1-磷酸鞘氨醇后適應對人臍靜脈內皮細胞缺氧/復氧損傷的保護作用

李蒙蒙，王雨晴，張麗志，婁建石，溫　克

(1.天津醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院藥理學教研室，天津　300070；2.天津市第一中心醫(yī)院婦產科，天津　300192)

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1-磷酸鞘氨醇后適應對人臍靜脈內皮細胞缺氧/復氧損傷的保護作用

李蒙蒙1，王雨晴1，張麗志2，婁建石1，溫克1

(1.天津醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院藥理學教研室，天津300070；2.天津市第一中心醫(yī)院婦產科，天津300192)

中國圖書分類號：R322.123；R329.24；R329.25；R845.22

摘要：目的研究1-磷酸鞘氨醇(S1P)后適應對人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)缺氧/復氧損傷的保護作用，并探討其作用機制。方法建立HUVEC缺氧/復氧損傷模型，將HUVEC細胞分為5組，正常對照組、S1P低劑量組、S1P中劑量組、S1P高劑量組以及缺氧/復氧損傷(H/R)組。MTT法檢測細胞存活率；流式細胞術分析測定細胞凋亡率；比色法測定細胞培養(yǎng)液中總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)、銅鋅超氧化物歧化酶(copper/zinc superoxide dismutase，CuZn-SOD)和錳超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase，Mn-SOD)活力以及一氧化氮(nitric oxide，NO)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量；熒光顯微鏡下觀察線粒體膜電位；Western blot測定HUVECs細胞Bcl-2/Bax、eNOS蛋白的表達水平。結果與H/R組相比，S1P低、中、高劑量組可明顯增加HUVECs細胞缺氧/復氧損傷后細胞存活率；均明顯升高T-SOD活力、CuZn-SOD活力、Mn-SOD活力，降低MDA含量，明顯升高NO含量及增加eNOS蛋白表達，降低凋亡率，抑制線粒體膜電位下降。結論S1P能夠使H/R損傷的HUVECs細胞凋亡率降低，且呈一定的濃度依賴性。S1P對H/R損傷的HUVECs細胞凋亡的保護作用可能與降低細胞內MDA含量，提高細胞內SOD活力，提升線粒體膜電位，增強抗凋亡蛋白Bcl-2/Bax的表達有關。

關鍵詞：S1P；缺氧/復氧；HUVECs細胞；Bcl-2/Bax；eNOS；凋亡

心肌缺血/再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，I/R)過程中除心肌細胞壞死、凋亡外，血管內皮細胞的損傷也發(fā)揮著重要作用。表現(xiàn)為內皮細胞屏障功能障礙、微血管通透性增加、粒細胞浸潤、炎性介質釋放；同時內皮細胞eNOS表達下降、一氧化氮(nitric oxide，NO)生成減少，導致微血管收縮，參與無復流現(xiàn)象的發(fā)生，心肌損傷加重[1]。

本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate，S1P)具有心血管保護作用，可抑制氧化應激狀態(tài)下或炎癥狀態(tài)下(血小板活化因子)引起的在體大鼠微血管內皮細胞通透性增加，具有內皮細胞保護作用。S1P后適應抑制炎癥反應、拮抗氧化應激、保護線粒體結構功能，減輕大鼠心肌缺血/再灌注損傷，亦可緩解心肌細胞缺氧/復氧(hypoxia/reoxygenation, H/R)損傷[2-3]。其他實驗室研究亦發(fā)現(xiàn)，離體大鼠心肌缺血后適應保護作用與內源性S1P有關[4]。但S1P是否對內皮細胞H/R損傷具有保護作用尚未見報道。本實驗通過建立人臍靜脈內皮細胞HUVEC缺氧/復氧損傷模型，以觀察S1P對HUVEC H/R損傷是否具有保護作用，為臨床用藥提供依據(jù)。

1材料

HUVECs 人臍靜脈內皮細胞株(上海艾研生物有限公司)；S1P(美國Sigma，批號：032M4103V)；超敏ECL化學發(fā)光試劑盒(批號：20130709)、BCA法蛋白定量試劑盒(批號：20140303)均購自江蘇碧云天生物技術研究所；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔抗體(批號：970380)、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠抗體(批號：107724)均購自北京中衫金橋生物技術有限公司；兔抗人Bcl-2多克隆抗體(批號：L1311)、兔抗人Bax多克隆抗體(批號：B2812)、β-actin抗體(批號：E3012)、兔抗人NOS3多克隆抗體(批號：E1413)均購自Santa Cruz公司；Tubulin抗體(江蘇碧云天生物技術研究所，批號：AT819-1)；Annexin V-PI 雙染色流式法細胞凋亡檢測試劑盒(美國BD公司，批號：3337788)；FACS Calibur型流式細胞儀(美國BD 公司)；FV1000熒光顯微鏡(NIKON公司)；ELx800吸收光酶標儀(BioTek公司)。

2方法

2.1細胞培養(yǎng)及實驗分組HUVECs細胞常規(guī)用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內。取對數(shù)期生長的HUVECs細胞，調整細胞密度為1×108·L-1，均勻接種于板中，24 h后細胞融合至80% 左右。將培養(yǎng)的HUVECs細胞隨機分為5組，即正常對照(Control)組、缺氧/復氧(H/R)組、S1P高、中、低劑量組。Control組換無血清的培養(yǎng)基。H/R組首先用模擬缺氧液(NaCl 139 mmol·L-1、KCl 4.7 mmol·L-1、CaCl21.0 mmol·L-1、MgCl20.5 mmol·L-1、HEPES 5 mmol·L-1、乳酸鈉 20 mmol·L-1,pH 6.2)置換正常培養(yǎng)基，放入細胞厭氧培養(yǎng)裝置密封，通入95% N2、5% CO2的混合氣15 min，密封裝置，置于37℃培養(yǎng)箱，缺氧處理16 h后，取出培養(yǎng)板，換用無血清培養(yǎng)基在95% O2+5% CO2的正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)4 h，建立H/R損傷模型。S1P低、中、高劑量組于復氧前加入含S1P(終濃度為2、4、6 μmol·L-1)的無血清培養(yǎng)基，余同H/R組。

2.2測定指標

2.2.1細胞存活率細胞缺氧/復氧損傷后，利用MTT法測定490 nm波長下每孔光吸收度值(OD 值)，實驗重復3次。并按下述公式計算細胞增殖率/%=(各實驗組OD值-空白對照組OD值)/ (正常對照組OD值-空白對照組OD值)×100%。

2.2.2SOD 活性、MDA 含量的檢測收集各組HUVECs細胞，按試劑盒說明書操作收集細胞裂解液3 000×g×10 min離心，取上清液，比色法測定MDA含量及SOD活性。

2.2.3細胞培養(yǎng)液中NO含量測定按實驗分組，每組分別取細胞培養(yǎng)液0.1 mL，根據(jù)測定試劑盒說明書測NO含量，并按照下述公式計算：NO含量/μmol·L-1=[(測定管OD-空白管OD)/(標準管OD-空白管OD)]×標準品濃度×稀釋倍數(shù)。

2.2.4流式細胞儀檢測細胞凋亡率各組缺氧/復氧細胞經(jīng)胰酶消化后，采用Annexin V-PI 雙染法對凋亡細胞進行染色，AnnexinV-FITC標記為綠色熒光，PI標記為紅色熒光。流式細胞儀測定熒光強度，計算各組凋亡率。

2.2.5熒光顯微鏡法檢測線粒體膜電位實驗結束后，棄培養(yǎng)液，加入JC-1染色工作液，充分混勻。細胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20 min。在孵育期間，按照每1 mL JC-1染色緩沖液(5×)加入4 mL蒸餾水的比例，配制適量的JC-1染色緩沖液(1×)，并放置于冰浴。37℃孵育結束后，吸除上清，用JC-1染色緩沖液(1×)洗滌2次。加入2 mL細胞培養(yǎng)液。熒光顯微鏡下觀察，并計算紅色熒光(激發(fā)波長：525 nm，發(fā)射波長：590 nm)及綠色熒光(激發(fā)波長490 nm，發(fā)射波長530 nm)熒光強度。在低膜電位時，JC-1以單體形式存在，產生綠色熒光；高膜電位時，JC-1形成聚合物，發(fā)射紅色熒光。計算紅、綠色熒光強度比值可反映線粒體膜電位變化。

2.2.6Western blot檢測實驗結束后，用PBS洗滌細胞，并用適量胰酶消化、收集細胞。應用預冷裂解液冰上裂解細胞30 min，收集蛋白質樣品，經(jīng)BCA蛋白定量、電泳、轉膜后用脫脂奶粉封閉2 h以上，加入一抗(tublin稀釋度為1 ∶2 000，Bax、Bcl-2、eNOS、β-actin稀釋度為1 ∶1 000)，4℃搖床過夜，二抗(稀釋度為1 ∶2 000)室溫孵育1~2 h，再經(jīng)顯影、定影后觀察結果并掃描，采用Quantitive軟件分析條帶的光密度值，計算Bcl-2/Bax、eNOS/tublin的比值。

3結果

3.1細胞存活率MTT數(shù)據(jù)顯示，經(jīng)缺氧/復氧處理后，與正常對照組比較，H/R組細胞存活率明顯降低(P<0.01)，而S1P各個濃度組存活率比H/R組有明顯升高，其中中、高濃度組與H/R組比較差異具有顯著性(P<0.05，P<0.01)，且隨S1P濃度增大，HUVEC細胞存活率逐漸上升，見Tab1。

Tab 1　Protective effect of S1P on

***P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsH/R group

3.2細胞培養(yǎng)液中SOD活性與正常對照組比較，H/R組的T-SOD、CuZn-SOD、Mn-SOD活性明顯降低(P<0.01)；與H/R組相比，S1P各個濃度組均明顯升高T-SOD活性(P<0.01)、CuZn-SOD活性(P<0.01)、Mn-SOD活性(P<0.01)，見Tab2。

3.3細胞培養(yǎng)液中MDA含量與正常對照組比較，H/R組的MDA含量明顯升高(P<0.0l)；與H/R組相比，S1P各個濃度組均明顯降低MDA含量(P<0.05)，見Tab 2。

Tab 2　Effect of S1P on SOD activity, MDA content during H/R injury in HUVECs ±s,n=3)

**P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsH/R group

Tab 3　Effect of S1P on NO content, apoptosis and mitochondrial membrane potential of HUVECs cells after H/R ±s,n=3)

**P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsH/R group

Fig 1　Effect of different concentrations of S1P on apoptosis of HUVECs cells

A: Control group; B: H/R group; C: S1P (L) group; D: S1P (M) group; E: S1P (H) group

3.4細胞培養(yǎng)液中NO含量測定H/R組細胞經(jīng)缺氧/復氧損傷后，NO含量明顯降低(P<0.01)。與H/R組相比，S1P低、中、高各個濃度組均明顯升高NO含量，且差異具有顯著性(P<0.01)，見Tab 3。

3.5流式檢測細胞凋亡率與正常對照組比較，H/R組凋亡細胞數(shù)量明顯增加(P<0.01)。S1P處理的不同濃度組可降低細胞凋亡率，其中高濃度組與H/R組比較差異具有顯著性(P<0.01)，見Tab 3及Fig 1。

3.6熒光顯微鏡法檢測線粒體膜電位熒光顯微鏡下觀察，正常對照組正常細胞被JC-1染色后顯示紅色熒光，H/R組多數(shù)細胞呈綠色熒光，提示線粒體膜電位下降。細胞經(jīng)S1P各個濃度組處理后，隨著藥物濃度的增加，HUVECs細胞紅色熒光顆粒逐漸增強，綠色熒光顆粒逐漸減少，提高紅綠色熒光比值，其中，中、高濃度組與H/R比較差異具有顯著性(P<0.05，P<0.01)，見Tab 3及Fig 2。

3.7Western blot測定HUVECs細胞Bcl-2/Bax、eNOS的蛋白表達與正常對照組比較，H/R組Bcl-2蛋白表達較低，而Bax條帶密度較深，Bcl-2/Bax比值較低。S1P各個濃度組可明顯增加Bcl-2表達，降低Bax表達，提高Bcl-2/Bax，見Fig 3。與正常對照組比較，H/R組eNOS表達明顯降低，S1P不同濃度組與H/R組比較，eNOS表達明顯增多，見Fig 4。

Fig 2　Fluorescence image of HUVEC loaded with JC-1

A: Control group; B: H/R group; C: S1P (L) group; D: S1P (M) group; E: S1P (H) group

Fig 3　Effect of S1P on the expression of Bcl-2/Bax

**P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsH/R group

Fig 4　Effect of S1P on the expression of

**P<0.05,**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsH/R group

4討論

心肌缺血/再灌注損傷過程中同時存在心肌細胞和內皮細胞損傷[1]。本實驗前期研究已通過在體大鼠心肌缺血/再灌注損傷模型以及體外心肌缺氧/復氧損傷模型證實，S1P具有心肌細胞保護作用。本研究采用體外內皮細胞模型，觀察了S1P對內皮細胞缺氧/復氧損傷的保護作用，研究證實，S1P可提高缺氧/復氧損傷細胞生存率，降低凋亡細胞數(shù)量。

eNOS在血管內皮細胞中高度表達，并催化NO的生成，發(fā)揮調節(jié)血管活性、抗凝血、抗血管增殖等作用。心肌缺血/再灌注時，內皮細胞功能障礙可導致eNOS水平下降、NO等擴血管物質減少，導致血管收縮、血小板黏附聚集，而進一步加重損傷[5]。Roviezzo等[6]研究發(fā)現(xiàn)，S1P處理牛胸主動脈后，能夠引起Akt介導的eNOS表達上調以及NO的大量產生。本實驗研究也證實，S1P處理后可上調內皮細胞eNOS表達水平，增加內皮細胞NO生成，減輕內皮細胞損傷。

內皮細胞缺氧/復氧損傷與多種因素密切相關，其中氧化應激是重要因素之一。細胞再給氧過程中，大量活性氧自由基(ractive oxygen species，ROS)產生超過了內源性抗氧化物質的清除能力，ROS可引起線粒體內細胞色素C釋放，進而誘導凋亡發(fā)生[7-8]。SOD為機體內源性抗氧化物質，可分為主要位于線粒體的Mn-SOD及位于胞質的Cu/Zn-SOD[9]。本研究證實，S1P可提高細胞3種SOD活性，并可降低細胞膜脂質過氧化反應的主要產物MDA含量，提示S1P的抗內皮細胞缺氧/復氧損傷作用可能與其抗氧化應激作用有關。

缺氧/復氧損傷過程中，內皮細胞發(fā)生明顯凋亡現(xiàn)象。細胞凋亡的機制主要包括死亡受體途徑以及線粒體途徑兩種。其中，線粒體發(fā)揮著重要的作用，細胞缺氧/復氧損傷過程中，氧化應激、鈣超負荷可導致線粒體通透性轉換孔開放、線粒體膜電位下降、線粒體腫脹、線粒體外膜破裂[10]。而細胞的存活與Bcl-2家族中抗凋亡成分與促凋亡成分的比率密切相關[11]。Bax是促凋亡基因，Bcl-2是抑制凋亡基因。后者主要作用為分布于線粒體外膜，抑制細胞色素C釋放，并維持線粒體外膜完整性[12]，同時也有研究證實，Bcl-2可通過抗氧化作用抑制氧化應激誘導的凋亡[13]。Bax正常情況下主要位于胞質，在凋亡信號誘導后易位至線粒體，誘導特異性通透孔道形成，導致促凋亡因子(細胞色素C、凋亡誘導因子等)釋放增加，誘導凋亡形成[14]。本研究采用JC-1熒光染色方法觀察了細胞線粒體膜電位的變化。該熒光的強弱或顏色變化可以反映線粒體膜電位的增高或降低[15]。研究表明，S1P可抑制缺氧/復氧損傷引起的線粒體膜電位下降。同時關于Bcl-2及Bax表達的檢測證實，S1P可增加Bcl-2的表達，降低Bax的表達，提高Bcl-2/Bax的比率。

綜上所述，S1P可能通過增強抗凋亡蛋白Bcl-2表達、抑制線粒體膜電位下降、抗氧化應激作用減少內皮細胞缺氧/復氧損傷。

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Protective effect of sphingosine 1- phosphate postconditioning on hypoxia/reoxygenation injury in human umbilical vein endothelial cell

LI Meng-meng1, WANG Yu-qing1, ZHANG Li-zhi2, LOU Jian-shi1, WEN Ke1

(1.DeptofPharmacology,SchoolofBasicMedicalSciences,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China; 2.DeptofObstetricsandGynecology,TianjinFirstCentralHospital,Tianjin300192，China)

Abstract:AimTo investigate the protective effects of sphingosine 1-phosphate (S1P) postconditioning on hypoxia/reoxygenation(H/R) injury in human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) and its mechanisms.MethodsHUVECs cells were divided into five groups: normal (control) group, S1P low concentration group (L), S1P medium concentration group (M), S1P high concentration group (H) and H/R group. MTT method was used to measure cell survival. Using flow cytometric analysis, the rate of cell apoptosis was determined. The activities of total superoxide dismutase (T-SOD), copper/zinc superoxide dismuta-se (CuZn-SOD), manganese superoxide dismutase (Mn-SOD) activity, nitric oxide (NO) and malondialdehyde (MDA) content in cell culture medium were measured with colorimetry. Mitochondrial membrane potential in cells was observed with fluorescence microscope. Bax/Bcl-2, eNOS protein expression levels in HUVECs cells were observed with Western blot.ResultsCompared with H/R group, S1P low, medium and high concentrations in the intervention group could significantly increase the cell survival rate after H/R injury, and increase activity of T-SOD, CuZn-SOD, Mn-SOD and decrease content of MDA. Moreover, S1P could significantly increase NO content and increase eNOS protein expression, decrease apoptosis rate and inhibit the reduction of mitochondrial membrane potential. ConclusionsS1P can decrease cell apoptosis rate of HUVECs after H/R injury with a certain concentration dependence. The protection of S1P for cell apoptosis of HUVECs after H/R injury may be related to decreasing the intracellular MDA content and improving intracellular SOD activity, increasing mitochondrial membrane potential and enhancing expression of Bcl-2, anti-apoptotic protein.

Key words:S1P; hypoxia/reoxygenation; HUVECs cells; Bcl-2/Bax; eNOS;apoptosis

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1978(2016)02-0184-06

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.02.008

作者簡介：李蒙蒙(1991-)，女，碩士生，研究方向：心血管藥理學， E-mail: limeng50005@163.com;溫克(1974-)，男，博士，副教授，碩士生導師，研究方向：心血管藥理學,通訊作者，E-mail:13820883653@163.com

基金項目：國家自然科學基金資助項目(No 81173058)；國家自然科學基金青年基金資助項目(No 81502419)；天津市自然科學基金資助項目(No 10JCZDJC20900)

收稿日期：2015-10-22，修回日期：2015-11-13

網(wǎng)絡出版時間：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160125.1557.016.html網(wǎng)絡出版地址：2016-1-25 15:57