樹豆酮酸A抑制3T3-L1細胞脂肪合成與分解的作用研究

秦　佑，楊瑞儀，陳梅果，沈小玲，胡英杰

(廣州中醫藥大學熱帶醫學研究所中藥新藥發現實驗室，廣東 廣州　510405)

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樹豆酮酸A抑制3T3-L1細胞脂肪合成與分解的作用研究

秦佑，楊瑞儀，陳梅果，沈小玲，胡英杰

(廣州中醫藥大學熱帶醫學研究所中藥新藥發現實驗室，廣東 廣州510405)

中國圖書分類號：R284.1；R329.24；R344.7；R394.2 ；R589.2

摘要：目的探討樹豆酮酸A(cajanonic acid A，CAA)對小鼠3T3-L1脂肪細胞脂質代謝的影響及其機制。方法誘導分化成熟的3T3-L1脂肪細胞加入不同濃度的CAA作用48 h后，進行總脂肪、甘油三酯、游離脂肪酸和甘油含量測定。實時熒光定量PCR法檢測脂質代謝相關基因的表達。結果CAA明顯降低3T3-L1脂肪細胞總脂肪和甘油三酯含量，抑制游離脂肪酸和甘油的釋放，下調乙酰輔酶A羧化酶(acetyl CoA carboxylase，ACC)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，FAS)、脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase，LPL)、激素敏感性脂肪酶(hormone sensitive lipase，HSL)和脂肪甘油三酯脂酶(adipose triglyceride lipase，ATGL)基因的表達，但增加乙酰輔酶A氧化酶(acyl CoA oxidase，ACOX)和肉堿棕櫚酰轉移酶-1(carnitine palmitoyl transferase 1，CPT-1)基因的mRNA水平。結論CAA通過抑制脂肪吸收與合成相關基因(ACC、FAS、LPL)的表達，減少脂肪細胞甘油三酯的合成，抑制細胞過度肥大。同時，下調脂肪分解限速酶基因(HSL、ATGL)mRNA水平，促進脂肪酸氧化關鍵基因(ACOX和CPT-1)的表達，減少游離脂肪酸的釋放，改善脂肪細胞的脂質代謝平衡。

關鍵詞：樹豆酮酸A；脂肪細胞；脂肪合成；脂肪分解；脂肪酸氧化；游離脂肪酸

白色脂肪組織(white adipose tissue，WAT)是機體重要的貯存脂肪、調節能量代謝平衡的組織。在WAT中，脂質的合成與分解效率直接呈正相關[1]。機體內脂肪需進行不斷地更新：一方面，外源性的脂肪通過血漿轉運，以游離脂肪酸(free fatty acid，FFA)的形式進入脂肪細胞，再合成脂肪儲存；另一方面，儲存的脂肪不斷分解，以FFA的形式進入各組織，然后被氧化利用供能，使脂肪代謝保持動態平衡。進食過多的熱量可促進甘油三酯(triglyceride，TG)的合成導致肥胖，而超重或肥胖者體內的脂肪堆積使脂肪分解更加活躍，釋放更多的FFA，血中FFA增加引發血脂紊亂，抑制葡萄糖利用，降低胰島素敏感性，繼而誘發胰島素抵抗、2型糖尿病等代謝綜合征。

樹豆(CajanuscajanL. Millspaugh)是蝶形花科木豆屬多年生灌木。研究表明，其菧類提取物能有效降血糖，并降低血清和肝臟的總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白水平，改善高脂血癥[2-3]。樹豆酮酸A是從樹豆提取物中分離出來的一種菧類化合物，該化合物對高糖高脂飲食聯合鏈脲佐菌素誘導的2型糖尿病SD大鼠及自發性肥胖伴高血糖高血脂模型(Zucker fa/fa大鼠、ob/ob小鼠、db/db小鼠)均能起到減輕體重，降低血糖、血脂，增強胰島素敏感性的作用[4]。但其作用機制尚未明確。有鑒于此，我們在本研究中以小鼠3T3-L1前脂肪細胞誘導分化WAT細胞為模型，研究樹豆酮酸A對脂肪細胞脂質代謝的影響。

1材料

1.1細胞株3T3-L1前脂肪細胞株由香港城市大學生物及化學實驗室惠贈。

1.2試劑與儀器高糖Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)細胞培養液、胎牛血清：美國Gibco公司；CCK8：美國Sigma-aldrich公司，批號FJ692；液體樣品甘油含量Glycerophosphate oxidase- Peroxidase (GPO-POD) 酶法測定試劑盒：普利萊基因有限公司，批號E1002； TG測定試劑盒、FFA測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，批號分別為：20150611、20150311；Revertra First Strand cDNA Synthesis Kit、THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix：日本TOYOBO公司，批號分別為：451100、453300；ABI 7500實時熒光定量PCR儀：美國應用生物系統公司；Thermo Scientific MK3型酶標儀：Thermo Fisher 公司；CK40倒置光學顯微鏡：美國Olympus公司。引物的設計和合成：上海生工生物技術有限公司。

2方法

2.1細胞培養及分化誘導小鼠3T3-L1前脂肪細胞株，用培養基(含10%胎牛血清的高糖DMEM)，在37℃、5% CO2的培養箱中培養。細胞以5×103個/孔的密度接種于96孔培養板中，待細胞匯合后接觸抑制48 h，換用含0.5 mmol·L-13-isobutyl-1-methylxanthine(IBMX)、0.25 μmol·L-1dexamethasone(DEX)和10 mg·L-1胰島素的培養基培養48 h。然后換用含10 mg·L-1胰島素的培養基培養48 h，再換用培養基繼續培養，每2天換液1次，誘導分化至d 8細胞 90%以上呈脂肪細胞表型。

2.2CAA分離與鑒定樹豆葉粗粉經乙醇提取，依次經石油醚、氯仿和乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯部位經柱層析分離得到CAA，核磁共振譜和質譜鑒定。

2.3CCK8測定細胞生存率3T3-L1前脂肪細胞以5×103個/孔的密度接種于96孔培養板中，當細胞融合率達到60%~70%后，換成含0(空白對照組)、25、50、100 μmol·L-1CAA的培養基孵育48 h后，每孔加入10 μL CCK8繼續孵育1.5 h，震蕩混勻，酶標儀檢測450 nm波長吸收值A。存活率/%=(藥物組A值-調零A值)/(空白組A值-調零A值)×100%，計算細胞存活率。

2.4油紅O測定細胞總脂量3T3-L1前脂肪細胞以5×103個/孔的密度接種于96孔培養板，按“2.1”方法誘導分化為成熟的脂肪細胞后，添加0(空白對照組)、25、50、100 μmol·L-1CAA，并設未分化組進行對照。48 h后，以磷酸鹽緩沖液(PBS)洗細胞3次，10%福爾馬林固定20 min，PBS 清洗3次晾干，每孔加入100 μL油紅O 染色液靜置20 min，倒掉染色液，以PBS 洗2次，除去多余染料，倒置顯微鏡下拍照。然后每孔加入150 μL異丙醇，震蕩1 min，酶標儀檢測492 nm 波長吸收值A。

2.5TG、甘油、FFA測定細胞以1×105個/孔的密度接種于6孔培養板，同“2.4”加入CAA處理48 h后，取各孔培養液，分別用試劑盒檢測FFA、TG和甘油含量。

2.6實時熒光定量PCR檢測基因表達收集細胞并裂解，按說明書提取RNA。取2 μg RNA，按Revertra First Strand cDNA Synthesis kit說明書進行逆轉錄，合成cDNA，然后以其為模板加入引物、ROX Referencedye和Thunderbird SYBR qPCR Mix，以β-actin基因為內參，按照說明書進行實時熒光定量PCR分析。實驗所用引物序列如Tab 1所示。

Tab 1　Primers designed for quantitative amplification

3結果

3.1CAA對3T3-L1細胞增殖的影響實驗中以不同濃度CAA(25、50、100 μmol·L-1)作用3T3-L1前脂肪細胞48 h后，細胞存活率分別為99.97%、101.36%和93.25%，與空白對照組比較差異均無統計學意義(P>0.05)，見Tab 2。表明CAA終濃度在25~100 μmol·L-1范圍內對3T3-L1前脂肪細胞增殖無影響。

Tab 2CAA showed no effect on viability

GroupCAA/μmol·L-1Survivalrate/%Control0100CAA2599.97±2.9650101.36±1.6810093.25±11.06

3.2CAA抑制脂肪細胞脂質與TG合成根據CCK8結果，使用25、50、100 μmol·L-1CAA作用已誘導分化成熟的脂肪細胞，油紅O脂類染色法檢測細胞脂質合成。鏡檢顯示，未分化的3T3-L1前脂肪細胞呈梭狀，而分化成熟的脂肪細胞呈圓形。隨著CAA添加濃度的增高，脂肪細胞變小，油紅O沉淀也依次減少。以異丙醇溶解細胞內沉淀的油紅O，采用酶標儀進行定量檢測。與前脂肪細胞比較，分化成熟的脂肪細胞A值明顯升高(P<0.01)，表明脂肪含量明顯增加；添加CAA處理48 h后，脂肪含量則明顯下降(P<0.01)，見Tab 3。與CAA減少脂肪細胞總脂質含量的結果一致，CAA同樣抑制脂肪細胞TG的生成，與不加CAA對照組比較差異有顯著性(P<0.05, Tab 4)。結果表明，CAA具有明顯抑制脂肪細胞脂肪合成的作用，且隨劑量增加而作用增強。

Tab 3 Inhibitory effects of CAA

*##P<0.01vspreadipocytes；**P<0.01vsthe group of adipocytes without CAA treatment.

3.3CAA抑制脂肪細胞甘油和FFA的釋放如Tab 4所示，與對照組比較，CAA低劑量組(25 μmol·L-1)可減少脂肪細胞甘油和FAA的釋放，但無統計學意義。CAA 中劑量和高劑量組(50、100 μmol·L-1)作用濃度能明顯抑制甘油FAA的釋放，且與對照組比較差異有顯著性(P<0.05或P<0.01)。結果表明，CAA對脂肪細胞的脂肪分解有抑制作用。

3.4CAA對脂肪代謝相關基因表達水平的影響實驗定量檢測了ACC和FAS(脂肪酸從頭合成關鍵酶)、LPL(與脂肪酸吸收相關)、ATGL和HSL(TG分解的限速酶)、ACOX和CPT-1(脂肪酸氧化限速酶)編碼基因的mRNA水平，發現與未分化的前脂肪細胞比較，脂肪細胞ACC、FAS、LPL、ATGL、HSL、ACOX、CPT-1表達水平均大幅提升(P<0.01，Fig 1)，表明由于脂肪細胞內脂代謝活躍，其相關基因表達也相應提高。CAA作用后，ACC、FAS、LPL、ATGL、HSL mRNA水平明顯下降(P<0.05或P<0.01，Fig 1)，與CAA對脂肪細胞脂肪合成與分解的抑制作用一致。但CPT-1、ACOX mRNA表達水平明顯提高(P<0.05或P<0.01，Fig 1)，提示CAA可能對脂肪酸氧化有促進作用。

4討論

本研究觀察了樹豆酮酸A對脂肪細胞脂質合成與分解的作用，結果顯示，樹豆酮酸A明顯抑制TG的合成，并明顯抑制甘油和FFA的釋放。TG在體內合成所需的脂酰CoA，主要有兩種來源：一是以乙酰CoA為原料的從頭合成途徑，ACC和FAS是參與合成的兩個關鍵酶；二是脂肪酸碳鏈延長的合成途徑，通過吸收血液中的FFA或利用細胞中TG分解的FFA，由脂酰CoA合成酶催化合成脂酰CoA，實現FFA再酯化。血液中的乳糜微粒和極低密度脂蛋白所攜帶的TG在LPL催化下降解為甘油和FFA，后者通過細胞表面的CD36途徑進入細胞。因此，LPL在細胞獲取FFA過程中起關鍵作用[5]。而HSL和ATGL則是脂肪細胞內TG水解的限速酶[6]。本研究的結果顯示，樹豆酮酸A通過下調ACC、FAS、LPL、HSL和ATGL的表達，從而抑制脂肪細胞內兩條TG合成途徑，減少TG等脂質合成，并抑制TG降解，減少甘油和FFA的釋放。

Tab 4　Inhibitory effects of CAA on TG, FFA and glycerin in ±s，n=12)

—：Undetected.##P<0.01vspreadipocytes；*P<0.05，**P<0.01vsthe group of adipocytes without CAA treatment

Fig 1　Effects of CAA on mRNA levels of genes related to lipid ±s，n=4)

在脂肪細胞分化早、中期階段，LPL、ACC和FAS的表達量依次明顯增高，細胞內的脂質合成加速，使脂肪細胞體積增大。到脂肪細胞分化成熟時，HSL和ATGL的表達也會明顯提高，提示細胞內脂肪分解也開始變得活躍[7]。因此，脂肪細胞的脂質合成與分解維持著一種動態平衡，當脂肪積累超出負荷時，脂質分解會增加，引起FFA升高、高甘油三脂血癥，使人體糖脂代謝紊亂。在減少脂肪細胞脂質合成的同時，抑制脂解更有利于維持更健康的能量代謝平衡。有資料顯示，抑制ATGL與HSL的表達與活性可有效抑制脂解反應，改善代謝綜合征[8-9]。通過節食或鍛煉使體重下降，其HSL表達也隨之下降，相應地FFA也會減少[10]。特異性敲除小鼠脂肪細胞的ATGL基因，在抑制脂解、降低血脂的同時，與脂肪吸收、合成相關基因表達也受到抑制，肝胰島素信號通路增強，葡萄糖耐受性得到改善[11]。LPL與脂蛋白中TG的降解及FFA吸收密切相關，其生理效應具有組織特異性差異。脂肪組織特異性LPL減少或缺失可減少先天肥胖ob/ob小鼠的脂肪儲存[12]。另有研究表明，下調WAT中LPL和FAS的表達，可有效抑制脂肪細胞的過度肥大[13]。

本研究的結果還顯示，樹豆酮酸A上調ACOX和CPT-1的mRNA水平。ACOX和CPT-1是FFA β氧化過程的限速酶，其表達量提高提示樹豆酮酸A對脂肪細胞的脂肪酸氧化可能有促進作用。在脂酰CoA從頭合成途徑中，ACC催化乙酰CoA產生丙二酰CoA(malonyl-CoA)。以往的研究表明，丙二酰CoA可通過抑制CPT-1而抑制脂肪酸氧化。ACC表達下降可活化CPT-1，從而在抑制脂肪合成的同時，促進脂肪酸氧化和葡萄糖吸收[14-15]。脂肪酸再酯化貯能、脂肪酸氧化供能是脂肪酸代謝的兩個方面，當脂肪酸再酯化能力下降，FFA富余的情況下，高效的脂肪酸氧化有助于維持細胞內能量平衡[16]。如有研究顯示，長時間中低強度運動會抑制內臟與皮下脂肪細胞脂質合成與分解，同時促進脂肪酸氧化參與供能，將體內儲能的WAT，轉化為提供能量的褐色脂肪[1]。

綜上所述，樹豆酮酸A通過下調ACC、FAS、LPL、HSL、ATGL，上調ACOX、CPT-I的表達，抑制脂肪細胞TG的合成與分解、促進脂肪酸過氧化，減少FFA的釋放，起到減肥降脂的作用。令人驚喜的是，樹豆酮酸A還具有改善地塞米松誘導的3T3-L1脂肪細胞胰島素抵抗、增加糖消耗的作用；在體內也顯示良好的降血糖、血脂，減肥作用[4]。其治療肥胖、胰島素抵抗、2型糖尿病的開發前景值得期待。

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Inhibitory effect of cajanonic acid A on lipogenesis and lipolysis in 3T3-L1 adipocytes

QIN You，YANG Rui-yi，CHEN Mei-guo，SHEN Xiao-ling，HU Ying-jie

(LaboratoryofChineseHerbalDrugDiscovery,TropicalMedicineInstitute,Guangzhou510405,China)

Abstract:AimTo investigate the effects of cajanonic acid A (CAA) on lipid metabolism in murine 3T3-L1 adipocytes. Methods3T3-L1 cells induced to differentiated into mature adipocytes were treated with CAA in different dosages for 48 h, then total lipids as well as triglyceride, free fatty acid and glycerol were measured. The expression levels of genes related to lipid metabolism were quantitatively analyzed by real-time fluorescent quantitative polymearase chain reaction (RTFQ-PCR). ResultsTotal lipids and triglyceride in 3T3-L1 adipocytes were markedly reduced by CAA. The release of free fatty acid and glycerol was lower than that of control. This coincided with decreased mRNA levels of the key enzymes involved in de novo lipogenesis (acetyl CoA carboxylase and fatty acid synthase), fatty acid uptake (lipoprotein lipase), and lipolysis (hormone sensitive lipase and adipose triglyceride lipase). While the expression of fatty acid oxidative genes including acyl CoA oxidase and carnitine palmitoyl transferase1 was increased after CAA treatment. ConclusionCAA may inhibit lipogenesis and lipolysis，reduce circulating free fatty acid and improve the lipid metabolism in adipocytes by regulating gene expressions.

Key words:cajanonic acid A；adipocytes；lipogenesis；lipolysis；fatty acid oxidation；free fatty acid

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1978(2016)02-0189-05

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.02.009

作者簡介：秦佑(1990-)，女，碩士生，研究方向：創新中藥研究，E-mail：youqincqmu@163.com；楊瑞儀(1972-)，女，博士，研究員，碩士生導師，研究方向：創新中藥研究，通訊作者，Tel：020-36585100，E-mail：rysyry@gzucm.edu.cn

基金項目：國家自然科學基金資助項目(No 81202968)；華南中醫藥協同創新中心團隊資助項目(No E1-KFD015141K05)

收稿日期：2015-10-29,修回日期：2015-11-19

網絡出版時間：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160125.1557.018.html網絡出版地址：2016-1-25 15:57