川芎嗪對肝癌HepG2細胞遷移、侵襲和細胞骨架的影響

畢　蕾, 顏曉靜, 楊　燁, 陳衛平

(南京中醫藥大學基礎醫學院 , 江蘇 南京　210023)

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川芎嗪對肝癌HepG2細胞遷移、侵襲和細胞骨架的影響

畢蕾, 顏曉靜, 楊燁, 陳衛平

(南京中醫藥大學基礎醫學院 , 江蘇 南京210023)

中國圖書分類號：R284.1；R329.24；R73-37；R735.702.2

摘要:目的通過研究川芎嗪(tetramethypyrazine, TMP)對肝癌HepG2細胞遷移能力、侵襲能力和細胞骨架的影響,探討TMP抑制肝癌細胞侵襲轉移的作用及機制。方法以肝癌HepG2細胞為靶細胞,通過細胞遷移劃痕實驗觀察不同濃度的TMP對肝癌HepG2細胞遷移的影響及其時效關系；采用細胞侵襲實驗，檢測TMP對HepG2細胞侵襲能力的影響；應用高內涵細胞分析系統(HCS)免疫熒光法檢測TMP對HepG2細胞骨架的影響。結果TMP對HepG2細胞的遷移能力有抑制作用，并呈現時間和劑量依賴性；TMP能夠明顯抑制HepG2細胞的侵襲(P<0.01)，并呈現一定的時間依賴性；TMP可減少HepG2細胞微絲數量，降低細胞骨架的面積，差異有顯著性(P<0.01)，有劑量相關性。結論TMP能抑制肝癌HepG2細胞遷移及侵襲，具有潛在的抗腫瘤轉移作用，其機制可能與TMP能明顯降低細胞骨架微絲數量和面積，抑制骨架微絲重排相關。

關鍵詞：川芎嗪；肝癌；HepG2； 細胞遷移；細胞侵襲；細胞骨架

川芎始載于東漢時期的《神農本草經》，是臨床常用活血理氣類中藥，能夠袪風止痛、活血，前人譽其為“血中氣藥”，臨床多用于瘀血阻滯等病癥。川芎嗪(tetramethypyrazine, TMP)是有效單體，分子式為C8H12N2，化學名為四甲基吡嗪，首先從川芎的生物堿中分離得到。TMP目前在臨床上廣泛應用,不僅用于心血管疾病、呼吸系統、消化系統、泌尿系統及代謝性疾病的治療,其抗腫瘤作用也日益受到關注[1-4]。在前期研究中，我們發現TMP對肝癌HepG2細胞、乳腺癌MCF-7細胞、肺癌A549細胞的增殖均有抑制作用，通過進一步研究發現TMP對肝癌HepG2細胞具有誘導凋亡及調控相關蛋白表達的作用[5]，但其對腫瘤轉移的作用尚未明確。結合前期研究結果，本文研究對象為肝癌HepG2細胞，通過觀察TMP對肝癌HepG2細胞遷移能力、細胞侵襲和細胞骨架的影響，探討TMP抗肝癌細胞侵襲轉移的作用及機制，為臨床腫瘤綜合治療中川芎嗪的合理應用提供參考。

1材料

1.1藥物與試劑川芎嗪(中國藥品生物制品檢定所標準品，批號110817-200305)；紫杉醇注射液(PTX)(太陽集團四川太極制藥有限公司，批號12100031)；DMEM(Gibco，批號：11995-065)；澳洲進口胎牛血清(Gibco，批號：16000-044)；0.25%胰蛋白酶(Gibco，批號：25200-056)；青-鏈霉素(Gibco，批號：15140-122)；細胞遷移試劑盒Cellomics Cell Motility kit(Thermo Scientific，美國，批號：OE187113)；細胞骨架分析試劑盒Cellomics Cytoskeletal Rearrangement kit(Thermo Scientific，美國，批號：OA183099)；羅丹明染色劑(Thermo Scientific，美國，批號：OB16636440)；羅丹明-鬼筆環肽染色劑(Thermo Scientific，美國，批號：OC183818)；基質膠Matrigel matrix(BD公司，美國，批號：2342761)；4%多聚甲醛(Sigma公司，美國，批號：20120421)；甲醇(Kermel公司，中國，批號：20140410)。

1.2細胞系及細胞培養肝癌HepG2細胞株，購于中國科學院上海細胞庫。HepG2細胞培養所用培養基為含10%胎牛血清的DMEM培養基，置于37℃、5%CO2培養箱中培養貼壁，傳代周期為2~3 d，取對數生長期細胞進行實驗。

1.3主要儀器高內涵細胞分析系統(型號：Arrayscan VTI 700，Thermo Scientific，美國)；RTCA DP實時無標記細胞傳感電阻儀 (型號：RTCA DP，Roche公司，瑞士)；超凈工作臺(型號：SW-CJ-1FD，蘇州凈化設備有限公司，中國)；CO2恒溫培養箱(型號：NU4950E， NUAIRE公司，美國)；倒置相差顯微鏡(型號：DFC-259 Leica，德國)。

2方法

結合前期研究基礎，選用肝癌HepG2細胞為研究對象，依據前期實驗獲得TMP對HepG2細胞的IC50確定劑量[5]，進行以下實驗。

2.1細胞劃痕實驗檢測細胞遷移取培養至對數期的HepG2細胞，用0.25%胰酶消化，用滴管吹打至單細胞懸液，調整細胞密度為1×108·L-1，接種于6孔板上，每孔1 mL，置于37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下，細胞培養箱中培養24 h至細胞基本融合。用100 μL微量移液頭在6孔板內垂直劃痕，PBS液沖洗2次后加入TMP溶液，每孔1 mL，使終濃度分別為50、100和200 mg·L-1，陰性對照組加入等體積的細胞培養液。將培養板置入37℃、5% CO2培養箱中培養12、24、48 h，分別用倒置相差顯微鏡觀察。每個視野內，隨機選擇3個區域，并計算100×視野內遷移劃痕空隙的長度。

2.2細胞侵襲實驗在CIM-plate細胞遷移浸潤檢測板上室中加入一層Matrigel凝膠，下室加入趨化因子600 μL。然后在上室中加入細胞懸液，調整細胞密度為1×108·L-1，每孔200 μL，置于37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下，細胞培養箱中培養24 h。設給藥組和陰性對照組，每組3個復孔，在細胞傳感電阻儀動態檢測72 h。

2.3高內涵細胞分析系統免疫熒光法檢測細胞骨架將細胞消化懸浮于培養液中，吹打接種于96孔板，置于37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下細胞培養箱中培養24 h后給藥，分陰性對照組、給藥組以及陽性對照組。陰性對照組加入等體積的細胞培養液，給藥組加入TMP溶液，每孔50 μL，陽性對照組加紫杉醇，終濃度均為10 mg·L-1，每組設3個復孔。培養48 h，棄去細胞培養上清，加入提前預熱的多聚甲醛固定，每孔200 μL，室溫孵育30 min；去除固定液，清洗2次；加入穿透液，室溫孵育15 min；去除穿透液，加入封閉液，進行封閉，室溫孵育15 min；去除封閉液，加入抗體探針溶液，室溫孵育1 h；去除探針溶液，清洗3次，避光室溫孵育15 min；去除Whole cell stain 溶液，清洗3次；封口96孔板，于HCS 讀板，4℃保存。

3結果

3.1TMP對肝癌HepG2細胞遷移能力的影響細胞劃痕實驗中，TMP對肝癌細胞遷移的影響如Fig 1所示，隨機選擇視野內3個區域，并計算100×視野內遷移劃痕空隙的長度，結果如Fig 2所示，TMP能夠明顯抑制肝癌HepG2細胞遷移，并呈時間依賴性和劑量依賴性。

3.2TMP對肝癌HepG2細胞侵襲的影響實時細胞分析系統(RTCA DP)檢測TMP對HepG2細胞侵襲結果如Fig 3示，與陰性對照組比較，TMP能夠明顯抑制HepG2細胞的侵襲，并呈現一定的時間依賴性。TMP對HepG2細胞分別作用24 h、48 h和72 h的細胞侵襲分析結果如Fig 4、Tab 1所示，與對照組比較，TMP作用48 h和72 h后對細胞侵襲均能明顯抑制(P<0.01)，呈現一定的時間依賴性。

Tab 1　Effect of TMP on invasion of HepG2 cells

***P<0.01vscontrol

3.3TMP對肝癌HepG2細胞骨架的影響高內涵細胞分析系統免疫熒光法檢測TMP對肝癌HepG2細胞骨架蛋白-肌動蛋白F-actin的結果如Fig 5示，對照組細胞骨架蛋白-肌動蛋白F-actin構成的微絲面積比較大，TMP作用后，HepG2細胞中由F-actin 構成的微絲減少。骨架面積分析結果見Fig 6、Tab 2，結果表明TMP能夠明顯降低人肝癌細胞HepG2骨架的面積(P<0.01)，且呈一定的劑量相關性。

Tab 2　Effect of TMP on cytoskeleton of HepG2 ±s，n=3)

***P<0.01vscontrol

4討論

腫瘤細胞的侵襲轉移是惡性腫瘤的主要生物學特性之一，是惡性腫瘤的發生和發展過程中的危險階段，其預后不良，是腫瘤患者死亡的主要原因，據統計，臨床腫瘤患者約有80%~90%死于腫瘤細胞的侵襲和轉移。細胞發生上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition， EMT)是腫瘤細胞侵襲轉移的基礎和必備條件，是一個動態的、多步驟的過程。細胞間黏附性的喪失、腫瘤基底膜和細胞外基質的破壞以及細胞骨架的重建，導致細胞運動性增加和細胞遷移的產生[6-9]。

Fig 1　Effect of TMP on migration of HepG2 cells(×100)

Fig 2　Effect of TMP on scratch length of HepG2 cells(n=3)

***P<0.01vscontrol group

Fig 3　Effect of TMP on invasion of HepG2 cells

細胞骨架為經由蛋白纖維交織而成的立體網架結構，充滿整個細胞質，為了保持細胞特有的形狀，其與外側的細胞膜和內側的核膜存在一定的結構聯系，并與細胞運動有關[10]。微管、微絲和中間纖維是組成細胞骨架主要結構，而微絲在多種腫瘤細胞中被大量修飾，與腫瘤細胞異常的生長特點如黏附和轉移有關。肌動蛋白F-actin是構成微絲的主要細胞骨架蛋白，在腫瘤細胞形態改變和遷移中起著非常重要的作用[11-12]。

Fig 4　Effect of TMP on invasion of HepG2 cells after

***P<0.01vscontrol group

Fig 5　Fluorography of HepG2 cells

Fig 6　Effect of TMP on HepG2 cell

***P<0.01vscontrol group

課題組通過研究發現TMP對HepG2細胞遷移有抑制作用，并呈現時間依賴性和劑量依賴性；TMP能夠明顯抑制HepG2細胞的侵襲，并呈現一定的時間依賴性；與空白對照組及陽性對照組比較，TMP能夠明顯降低人肝癌HepG2細胞微絲數量和細胞骨架的面積，且呈劑量相關性，這可能是因為TMP通過調節細胞松弛素，阻止肌動蛋白聚合成微絲，從而減少微絲的形成，影響微絲的功能。總之，TMP可抑制肝癌HepG2細胞的遷移及侵襲，具有潛在的抗腫瘤轉移作用，其作用機制可能與TMP能明顯減少細胞骨架微絲數量和降低細胞骨架面積，抑制骨架微絲重排相關。由此TMP是否可以抑制細胞獲得新的間質表型，進而抑制細胞發生EMT，有待于進一步研究。

(致謝:本文實驗在南京中醫藥大學校級重點實驗室中藥性效研究實驗室完成，感謝實驗室對本項目實驗的鼎力支持！)

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Effect of tetramethypyrazine on cell migration, cell invasion and cytoskeleton in human hepatocellular carcinoma cell line HepG2

BI Lei, YAN Xiao-jing , YANG Ye, CHEN Wei-ping

(DeptofPreclinicalMedicine,NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210023,China)

Abstract:AimTo explore the mechanism of tetramethypyrazine (TMP) in the inhibition of cancer cell invasion and metastasis, by investigating the effect of TMP on cell migration, cell invasion and cytoskeleton of HepG2 cells. MethodsUsing HepG2 cells as target cells, cell migration of different concentrations of TMP on HepG2 cells was assayed by the scratch wound healing assay. Matrigel cell invasion assay was used to detect the effect of TMP on the invasion of HepG2 cells. The effect of TMP on cytoskeleton of HepG2 cells was detected by high content screening (HCS).ResultsTMP inhibited the migration of HepG2 cells, and showed a time-dependent and dose-dependent manner. Moreover, TMP significantly inhibited the invasion of HepG2 cells (P<0.01), and showed a certain time-dependence. Furthermore, compared with control group, a significant decrease in HepG2 cytoskeleton area was found in a dose-dependent manner (P<0.01). ConclusionTMP can inhibit the migration and invasion of HepG2 cells, and it has the potential to resist tumor metastasis, and the mechanism may be associated with TMP significantly decreasing the number and area of cytoskeleton, and inhibiting the rearrangement of cytoskeleton.

Key words:tetramethypyrazine; liver cancer;HepG2;cell migration; cell invasion; cytoskeleton

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1978(2016)02-0194-05

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.02.010

作者簡介:畢蕾(1984-),女,博士,講師,主治醫師,研究方向：中醫藥抗腫瘤, Tel:025-85811941，E-mail:bellajssz@163.com；陳衛平(1959-),女,博士,教授,博士生導師， 研究方向：中醫藥抗腫瘤，通訊作者，Tel/Fax: 025-85811923，E-mail: wp2002123@163.com

基金項目:國家自然科學基金資助項目(No 81273638, 81503486);江蘇省高校自然科學研究項目(No 14KJD360004); 江蘇省中醫藥局科技重點項目(No ZD201502);江蘇省普通高校研究生科研創新計劃項目(No KYLX15_0997)

收稿日期：2015-11-24，修回日期：2015-12-16

網絡出版時間：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160125.1557.020.html網絡出版地址：2016-1-25 15:57