DADS對Chk1/2基因高表達人胃癌MGC803細胞G2/M期的影響

夏　紅，向姝霖,2,曾　穎，陸麗峰，劉　芳，凌　暉，蘇　波，蘇　琦

(1.湖南省胃癌研究中心南華大學腫瘤研究所， 湖南省高校腫瘤細胞與分子病理學重點實驗室，湖南 衡陽　421001；2. 南華大學附屬懷化醫院，懷化市第一人民醫院，湖南 懷化　418000)

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DADS對Chk1/2基因高表達人胃癌MGC803細胞G2/M期的影響

夏紅1，向姝霖1,2,曾穎1，陸麗峰1，劉芳1，凌暉1，蘇波1，蘇琦1

(1.湖南省胃癌研究中心南華大學腫瘤研究所， 湖南省高校腫瘤細胞與分子病理學重點實驗室，湖南 衡陽421001；2. 南華大學附屬懷化醫院，懷化市第一人民醫院，湖南 懷化418000)

中國圖書分類號：R329.24；R329.28；R345.57；R735.202.2；R916.4；R979.1

摘要:目的在建立Chk1/2基因高表達人胃癌MGC803細胞基礎上，探討DADS對Chk1/2高表達MGC803細胞G2/M期的作用。方法分別采用集落形成實驗、流式細胞術、RT-PCR、Western blot等方法，檢測DADS對Chk1/2高表達MGC803細胞增殖、細胞周期分布、Chk1與Chk2 mRNA與蛋白、p-Chk1與p-Chk2及CDC25C與cyclinB1的表達。結果軟瓊脂集落形成實驗顯示，30 mg·L-1DADS作用Chk1與Chk2高表達MGC803細胞組集落形成率均明顯低于對照組與空載體組(P<0.05)。流式細胞術顯示，30 mg·L-1DADS作用12、24、36、48 h后，Chk1/MGC803細胞G2/M期分別為41.3%、57.4%、68.9%、42.9%，較MGC803細胞與Chk2/MGC803細胞明顯增加(P<0.05)。而Chk2/MGC803細胞與MGC803細胞差異沒有顯著性(P>0.05)。RT-PCR顯示，Chk1/MGC803與Chk2/MGC803細胞Chk1與Chk2 mRNA水平較對照組無明顯變化；并且，Western blot顯示，Chk1與Chk2總蛋白及p-Chk2的表達無明顯改變，但p-Chk1呈時間依賴性上調，CDC25C與cyclinB1呈時間依賴性下調(P<0.05)。結論DADS可阻滯Chk1/MGC803細胞于G2/M期，與上調磷酸化Chk1和下調CDC25C與cyclinB1有關。

關鍵詞：二烯丙基二硫；人胃癌細胞；G2/M期；Chk1/Chk2激酶；CDC25C；cyclinB1

二烯丙基二硫(diallyl disulfide，DADS)是大蒜中的脂溶性有效成分，可抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞分化與凋亡、阻滯細胞周期、抑制血管形成及侵襲等，是一種很有開發潛力的抗腫瘤藥物[1]。我們已經證實，DADS抑制人胃癌細胞增殖和G2/M阻滯與激活p38、抑制ERK/AP-1、上調組蛋白乙酰化、p21 WAF1等有關[2-4]。但是，誘導G2/M阻滯的機制尚未完全闡明。G2/M期檢查點失活在細胞癌變過程中起著重要的作用，Chk1和Chk2是G2/M期檢查點的兩個關鍵激酶，而Chk1是重要靶點[5]。本研究在構建Chk1/2基因高表達MGC803細胞的基礎上[6]，進一步探討DADS對Chk1/2高表達人胃癌細胞周期阻滯的作用及其機制。

1材料與方法

1.1細胞培養人胃癌MGC803細胞株由本實驗室保存，置于含10%小牛血清的RPMI 1640培養基中，37℃、5% CO2、飽和濕度的培養箱內傳代培養。取對數生長期的細胞用于實驗。

1.2主要試劑DADS為Fluka公司產品。DADS與Tween 80以1 ∶2的比例充分溶解后，加入體積分數為0.90%的生理鹽水稀釋100倍，作為母液保存于-20℃冰箱中。RT-PCR逆轉錄試劑盒為Promega公司產品；BCA蛋白定量試劑盒為Pierce公司產品；Chk1、Chk2、CDC25C、cyclin B1與β-actin抗體及ECL發光檢測試劑盒購自Santa Cruz公司；p-Chk1(Ser345)、p-Chk2(Thr68)抗體與Anti-rabbit IgG購自Cell Signaling Technology；新生牛血清購自杭州四季青生物工程公司。引物用Primer Premier 5.0軟件設計，由上海生工公司合成。

1.3軟瓊脂集落形成實驗用雙蒸水制備15 g·L-1和9 g·L-1濃度的低熔點瓊脂糖溶液，高溫高壓滅菌后維持于40℃水浴中；同時制備3×RPMI 1640培養基(含300 mol·L-1小牛血清)，保存于37℃溫箱中，臨用時1 ∶2混合瓊脂糖與3×RPMI 1640培養液，調整細胞濃度使最終細胞接種為1 000個/孔，每組3個平行樣本，2周后觀察集落形成情況并計數集落數，計算集落形成率。集落形成率/%=(對照組克隆均數-實驗組克隆均數)/對照組克隆均數×100%。

1.4流式細胞儀測定收集已處理好的細胞，1 000 r·min-1離心5 min，棄去培養液，5 mL PBS洗2次，離心，去PBS，加入70%乙醇固定24 h，流式細胞儀分析DNA含量，檢測群體細胞中G1、S、G2/M期細胞百分率。

1.5RT-PCR分析Total RNA Kit提取細胞總RNA，在 AMV 酶作用下逆轉錄合成 cDNA。設計并合成PCR引物序列：Chk1：F 5′-CTGAAGAAGCA GTCGCAGTG-3′，R 5′-TTCCACAGGACCAAACATCA-3′，產物長度494 bp；Chk2：F 5′-TCCGCTTGCTGATGATCTTTATGG-3′，R 5′-GACCTACTCCTTGGGCTCG GCTAT-3′，產物長度498 bp；β-actin： F 5′-CGTCATA CTCCTGCTT-3′，R 5′-ATCTGGCACCACACCT-3′，產物長度820 bp。PCR反應條件：Chk1：95℃，5 min；30個PCR循環(95℃，30 s；53.5℃，30 s；72℃，60 s；72℃，5 min)。Chk2：95℃，5 min；30個PCR循環(95℃，30 s；60℃，15 s；72℃，60 s；72℃，5 min)。β-actin：94℃，5 min；30個PCR循環(94℃，30 s；62.7℃，30 s；72℃，60 s；72℃，5 min)。5 μL的PCR產物經1%的瓊脂糖電泳，嗅化乙啶染色，通過IS1000圖像分析軟件讀取目的條帶灰度值，相對值以目的基因與β-actin灰度值之比表示。

1.6Western blot 分析分別收集細胞，冰PBS洗2次，以1×107個細胞濃度加入100~150 μL裂解液，冰上裂解1h，低溫高速離心收集蛋白，以BCA蛋白定量測定法檢測蛋白濃度。以每孔30μg的蛋白量加樣，以5 ∶1倍體積與5×SDS加樣緩沖液混合，100℃煮沸5 min變性，經10% SDS-PAGE凝膠電泳后，轉移至硝酸纖維素膜上，用含5%脫脂牛奶的TBST(Tris-HCl 20 mmol·L-1，NaCl 137 mmol·L-1含0.1% Tween-20)封閉2 h，TBST洗膜3次，一抗37℃孵育2 h，TBST洗3次，每次15 min，相應的二抗孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min，化學發光劑檢測蛋白質印跡，薄層掃描儀測定印跡區帶的光密度值。

2結果

2.1軟瓊脂集落形成實驗Tab 1顯示，30 mg·L-1DADS作用后，Chk1與Chk2高表達MGC803細胞集落形成率均明顯低于對照組與空載體組(P<0.05)。并且，Chk1較Chk2高表達細胞組明顯降低(P<0.05)。對照組與空載體組差異無顯著性。表明Chk1與Chk2高表達可抑制MGC803細胞增殖，而Chk1高表達更為明顯。

2.2DADS對Chk1/2高表達的MGC803細胞周期影響Tab 2與Fig 1顯示，30 mg·L-1DADS作用12、24、36、48 h后，Chk1/MGC803細胞G2/M期分別為41.3%、57.4%、68.9%、42.9%，較MGC803細胞與Chk2/MGC803明顯增加(P<0.05)。而Chk2/MGC803細胞與MGC803細胞差異沒有顯著性(P>0.05)。表明DADS可阻滯Chk1/MGC803細胞于G2/M期與Chk1基因表達增加有關。

**P<0.05vsMGC803 and Chk2/MGC803

Fig 2　Total RNA in Chk1/2 MGC803 cells

A: Chk1/MGC803; B: Chk2/MGC803;1:0 h;2:12 h;3:24 h;4:36 h;5:48 h

Tab 1　The colony forming efficiency in MGC803 cells of overexpression of Chk1/2 gene

**P<0.05vsMGC803 and vector/MGC803;#P<0.05vsChk2/MGC803

Fig 3　Effects of DADS on Chk1/Chk2 mRNA expression in Chk1 or Chk2/MGC803 cells

A:Chk1/MGC803; B: Chk2/MGC803; M: Marker; 1: 0 h; 2: 12 h; 3: 24 h; 4: 36 h; 5: 48 h.

2.3DADS對Chk1/2高表達MGC803細胞Chk1與Chk2 mRNA的影響Fig 2凝膠電泳顯示28S和18S條帶濃而亮，總RNA純度高，完全符合RT-PCR要求。Fig 3顯示，30 mg·L-1DADS處理12、24、36、48 h后，Chk1/MGC803與Chk2/MGC803細胞Chk1與Chk2 mRNA表達與對照組差異無顯著性(P>0.05)。

2.4DADS對Chk1/2高表達MGC803細胞Chk1/Chk2蛋白與磷酸化的影響Fig 4顯示，30 mg·L-1DADS處理12、24、36、48 h后，Chk1與Chk2高表達MGC803細胞Chk1與Chk2總蛋白及p-Chk2表達分別較對照組無明顯改變(P>0.05)。而Chk1/MGC803細胞p-Chk1呈時間依賴性表達上調(P<0.05)。

2.5DADS對Chk1高表達MGC803細胞CDC25C與cyclinB1表達的影響Fig 5顯示，30 mg·L-1DADS處理12、24、36、48 h后，Chk1/MGC803細胞CDC25C與cyclinB1表達呈時間依賴性表達下調(P<0.05)。

3討論

G1/S和G2/M期檢查點失活在細胞癌變過程中起著重要的作用，靶向檢查點已成為腫瘤治療的新策略。研究顯示，α-pinene通過上調Chk1與Chk2和下調cyclin B、CDC25與CDK1抑制肝癌細胞增殖[7]。Jaridonin 通過上調p-ATM，激活Chk1與Chk2導致CDC25C、Cdc2與H2A.X磷酸化，阻滯食管癌細胞G2/M。ATM抑制劑可逆轉ATM與Chk1/2活化以及CDC25C、Cdc2與H2A.X 的磷酸化和G2/M 阻滯[8]。

Tab 2　Effects of DADS on G2/M arrest in

**P<0.05vsMGC803 and Chk2/MGC803

大量研究表明，Chk1是G2/M 阻滯的關鍵靶點。Selvarajah等[9]報道，沉默mTOR或采用mTORC1/2激酶抑制劑可防止etoposide 誘導G2/M阻滯，阻止Chk1磷酸化與下調Chk1，而不是Chk2,表明mTOR抑制劑可通過mTORC2-Chk1途徑克服乳腺癌治療的抵抗。mTOR抑制劑RAD001可增加口腔癌SCC4細胞放療敏感性，并且與放療結合可通過活化Chk1增加G2/M阻滯[10]。惡嗪衍生物ZGDHu-1通過上調Chk1和下調cyclin B1與CDC2誘導胰腺癌PANC-1細胞凋亡與G2/M阻滯[11]。ZGDHu1可上調Chk1、p53、p27、pcdc25c, pChk1與pp53和下調cyclin B1、CDC2與CDC25c阻滯白血病Kasumi1細胞于G2/M，而Chk1抑制劑CHIR-124可消除ZGDHu1誘導G2/M阻滯[12]。gossypin可通過活化Chk1引起CDC25C磷酸化，誘導惡性膠質瘤U251細胞G2/M阻滯[13]。Chk1抑制劑與沉默Chk1通過ATR-Chk1途徑，而不是ATR-Chk2可廢除熱應激誘導Jurkat細胞凋亡與G2/M檢查點活化[14]。氯雷他定可直接損傷DNA，活化Chk1從而促進G2/M阻滯，使細胞對輻射誘導DNA損害易感[15]。

Fig 4　Effect of DADS on expression of Chk1/2

A:Chk1/MGC803; B: Chk2/MGC803; 1:0 h;2:12 h;3:24 h;4:36 h; 5:48 h;*P<0.05vscontrol.

Fig 5　Effect of DADS on CDC25C and cyclinB1

**P<0.05vscontrol

我們先前證明，DADS可通過ATR/Chk1/CDC25C/cyclin B1通路，磷酸化ATR，激活Chkl，下調CDC25C 和cyclinB1，阻滯MGC803細胞G2/M[16-17]。DADS通過特異性磷酸化Chk1，而不是Chk2，抑制CDC25C/cyclin B1途徑，阻滯人胃癌BGC823細胞于G2/M期。沉默Chk1可消除G2/M期阻滯和下調CDC25C與cyclin B1，但沉默Chk2作用不明顯。提示沉默Chkl基因可消除DADS誘導BGC823細胞G2/M期阻滯[18]。然而，闡明DADS阻滯MGC803細胞G2/M阻滯的作用靶點是Chkl或Chk2，必須建立高表達Chkl/Chk2胃癌細胞證實。

本研究在建立Chk1/Chk2基因高表達MGC803細胞的基礎上，進一步研究顯示，DADS作用12、24、36、48 h后，Chk1/MGC803細胞G2/M期較MGC803細胞與Chk2/MGC803細胞明顯增加(P<0.05)。但是，Chk1/MGC803細胞G2/M期較MGC803細胞沒有明顯差異。并且，Chk1、Chk2 mRNA與總蛋白和p-Chk2表達無明顯變化，而Chk1/MGC803細胞p-Chk1上調和CDC25C與cyclin B1下調(P<0.05)。表明DADS通過Chk1/CDC25C/cyclin B1途徑阻滯Chk1/MGC803細胞于G2/M期，進一步證實DADS阻滯人胃癌細胞G2/M阻滯的作用靶點是Chkl。

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Overexpression of Chk1/2 gene affects G2/M arrest in MGC803 cells induced by diallyl disulfide

XIA Hong1, XIANG Shu-lin1,2, ZENG Ying1, LU Li-feng1, LIU Fang1, LING Hui1, SU Bo1, SU Qi1

(1.CenterforGastricCancerResearchofHunanProvince,CancerResearchInstitute,KeyLaboratoryofCancerCellularandMolecularPathologyofHunanProvincialUniversity,UniversityofSouthChina,HengyangHunan

421001,China; 2.HuaihuaFirstHospitalAffiliatedtoUniversityofSouthChina,HuaihuaHunan418000,China)

Abstract:AimTo investigate the effects of diallyl disulfide(DADS) on G2/M arrest in Chk1/MGC803 and Chk2/MGC803 cells so as to establish stable human gastric cancer MGC803 cells with overexpression of Chk1/2 gene.MethodsThe colony formation, flow cytometry, RT-PCR and Western blot were used to detect the proliferation, cell cycle, and expression of Chk1/2 mRNA and protein, p-Chk1/2, CDC25C and cyclinB1, respectively.ResultsThe colony formation showed that the colony forming efficiency in Chk1/MGC803 and Chk2/MGC803 cells treated by 30 mg·L-1DADS was lower than in control group and vector group(P<0.05). Flow cytometry demonstrated that 41.3%, 57.4%, 68.9% and 42.9% of G2/M cells in Chk1/MGC803 were increased than in MGC803 and Chk2/MGC803, respectively after treated by DADS in 12,24, 36 and 48 h(P<0.05). At the same time, RT-PCR disclosed that expression of Chk1 and Chk2 mRNA had no marked change. Western blot showed that total proteins of Chk1 and Chk2 and p-Chk2 had invisible change, but expression of p-Chk1 was up-regulated, and CDC25C and cyclinB1 were down-regulated time-dependently in Chk1/MGC803 cells (P<0.05).ConclusionDADS arrests MGC803 cells at G2/M by increasing p-Chk1 expression to cause down-regulation of CDC25C and cyclinB1 simultaneously.

Key words:diallyl disulfide; gastric cancer cell; G2/M; Chk1/2 gene; CDC25C; cyclinB1

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1978(2016)02-0199-06

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.02.011

作者簡介：夏紅(1976-)，女，博士生，實驗師，研究方向：胃癌防治的分子機制，E-mail: 6970842@qq.com；向姝霖(1979-)，女，碩士，主治醫師，研究方向：抗腫瘤藥物分子機制，并列第一作者，E-mail: 15074566777@163.com;蘇琦(1945-)，男，教授，博士生導師，研究方向：胃癌發生及防治的分子機制,通訊作者,E-mail: suqi1945@163.com

基金項目：國家自然科學基金資助項目(No 81102854, 81374013)；湖南省衛生廳科研課題(No B2015-182)

收稿日期:2015-11-08,修回日期:2015-12-11

網絡出版時間：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160125.1557.022.html網絡出版地址：2016-1-25 15:57