沉默MALAT1基因對蜂毒素誘導HepG2細胞增殖和凋亡的影響

趙　斌, 吳毓婷, 黃　成, 呂雄文, 李　俊

(安徽醫科大學藥學院，安徽 合肥　230032)

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沉默MALAT1基因對蜂毒素誘導HepG2細胞增殖和凋亡的影響

趙斌, 吳毓婷, 黃成, 呂雄文, 李俊

(安徽醫科大學藥學院，安徽 合肥230032)

中國圖書分類號：R329.24；R329.25；R342.2；R996.3

摘要：目的探討沉默HepG2細胞株中MALAT1基因對蜂毒素誘導的細胞增殖抑制和凋亡的影響。方法采用MTT法檢測蜂毒素對HepG2細胞的增殖抑制作用；流式細胞儀檢測細胞凋亡率；qPCR法檢測HepG2細胞中MALAT1基因的表達；采用特異性siRNA對HepG2細胞的MALAT1基因進行沉默；比較單獨用蜂毒素處理和給予蜂毒素同時沉默MALAT1的細胞增殖抑制率和凋亡率變化。結果蜂毒素明顯抑制HepG2細胞的增殖并促進細胞凋亡，呈濃度依賴性；和正常肝細胞株L0-2相比，MALAT1 mRNA在HepG2細胞中存在高表達(P<0.05)；蜂毒素可下調細胞中MALAT1的表達，并隨著濃度的增加抑制率升高；給予蜂毒素同時沉默MALAT1的研究組中，細胞增殖抑制和凋亡率都明顯高于單獨給予蜂毒素組(P<0.05)。結論蜂毒素可下調HepG2細胞株中MALAT1的表達，且沉默MALAT1可促進蜂毒素誘導的HepG2細胞增殖抑制和凋亡。

關鍵詞：蜂毒素；長鏈非編碼RNA；MALAT1；RNA干擾；細胞凋亡；HepG2細胞

長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA, lncRNA) 是指長度超過200nt 的RNA分子[1]，主要形式是以RNA的形式、不編碼蛋白，其主要功能包括在表觀遺傳水平、轉錄水平以及轉錄后水平等多種層面上調控基因的表達，與多種人類疾病的發生有密切的關系。某些特定的lncRNA在多種腫瘤組織和細胞株中表達異常，可能為惡性腫瘤分子診斷和治療提供依據和靶點[2]。MALAT1基因(metastasis associated in lung denocarcinoma transcript 1)是在研究人非小細胞肺癌的轉移中發現的新的長鏈非編碼RNA基因[3]，定位人類11q13染色體上。近年發現MALAT1與肝癌關系密切，抑制MALAT1在肝癌細胞HepG2的表達可以有效降低細胞活力、運動、侵襲等[4]，可能成為腫瘤治療的新靶點[5]。蜂毒素(Melittin)是蜂毒的主要活性部分，可以阻滯腫瘤細胞的增殖和誘導凋亡，有望用于臨床的腫瘤治療，然而其抗腫瘤的分子機制尚未完全明確。本研究通過構建針對MALAT1 RNA的小干擾RNA(small interfeting RNA, siRNA)，特異沉默MALTA1的表達，觀察對蜂毒素誘導的HepG2增殖抑制和細胞凋亡作用的影響，為臨床治療提供新的思路與理論依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株人正常肝細胞株L0-2和人肝癌細胞株HepG2購自中國科學院上海細胞研究所。

1.1.2試劑與儀器蜂毒素Melittin購于上海吉爾公司，MTT試劑盒購于Sigma公司，胎牛血清購于杭州四季青公司，培養基購于Hyclone公司，Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購于BestBio公司，逆轉錄試劑盒購于TaKaRa公司，Real-time Quantitative PCR (RT-qPCR) 試劑盒QuantiTect SYBR? Green PCR Kits購于Qiagen公司，TRIzol Reagent、脂質體LipofectamineTM2000、Opti-MEM購于Invitrogen 公司。引物合成均由上海生工生物工程公司提供。二氧化碳培養箱(Thermoforma)，酶標儀(BiotecEL)，流式細胞儀(Beckman)。

1.2方法

1.2.1細胞培養細胞培養采用DMEM培養基(含10%胎牛血清、100 U·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素)，細胞培養條件為37℃、5% CO2、飽和濕度，細胞為貼壁生長，胰蛋白酶消化后傳代，實驗時調整細胞狀態為對數生長期。

1.2.2MTT法檢測蜂毒素對細胞的增殖抑制① 實驗分組：陰性對照組、蜂毒素(1、4和8 mg·L-1)3個濃度組。用完全培養基稀釋對數生長期細胞至4×108·L-1，將細胞懸液接種于96孔板中，培養12 h后細胞貼壁后換液，加入含不同濃度蜂毒素(1、4和8 mg·L-1)的培養基100 μL，陰性對照組加入等量培養基。設6個復孔。蜂毒素作用48 h。② 實驗分組：空白對照組、蜂毒素組(4 mg·L-1)、蜂毒素(4 mg·L-1)+陰性對照組、蜂毒素(4 mg·L-1)+MALAT1 siRNA組。用完全培養基稀釋對數生長期細胞至4×108·L-1，將細胞懸液接種于96孔板中，培養24 h細胞貼壁后加入轉染復合物100 μL進行轉染，轉染6 h后，各組加入含蜂毒素(4 mg·L-1)的完全培養基100 μL，空白組加入等量培養基。蜂毒素作用48 h。以上兩個分組中，每孔加入MTT 溶液(5 g·L-1)20 μL，繼續孵育4 h 后吸去上清，加入DMSO 150 μL，振蕩5~10 min，待藍色晶體完全溶解后，酶標儀上492 nm測定吸光度。按以下公式計算生長抑制率：抑制率/%=(對照組A值-實驗組A值)/對照組A值×100%。

1.2.3流式細胞儀檢測凋亡率細胞凋亡定量分析采用Annexin-V-FITC凋亡檢測試劑盒。① 實驗分組：空白對照組、蜂毒素(1、4和8 mg·L-1)3個劑量組。用完全培養基稀釋細胞至4×108·L-1，將細胞懸液接種至培養瓶中，用含10%胎牛血清的DMEM培養基培養12 h，細胞貼壁后換液，分別給予蜂毒素(1、4和8 mg·L-1)，作用48 h后，用不含EDTA的胰酶消化細胞，低速離心收集細胞。② 實驗分組：空白對照組、蜂毒素組(4 mg·L-1)、蜂毒素(4 mg·L-1)+陰性對照組、蜂毒素(4 mg·L-1)+MALAT1 siRNA組。HepG2細胞常規培養至對數生長期，將細胞以4×105接種于6孔板中，24 h左右待細胞貼壁后轉染，轉染后6 h更換為含血清的完全培養基，并各組加入蜂毒素(4 mg·L-1)2 mL，空白組不進行處理。蜂毒素作用48 h后，用不含EDTA的胰酶消化細胞，低速離心收集細胞沉淀。在以上兩個分組中，在收集的細胞沉淀中加入400 μL Binding Buffer 混懸細胞，加入5 μL Annexin V-FITC輕輕混勻后，于2~8 ℃ 避光條件下孵育15 min，加入10 μL PI后輕輕混勻，于2~8 ℃避光條件下孵育5 min。流式細胞儀常規檢測。

1.2.4siRNA的合成根據siRNA設計原則，設計針對MALAT1的siRNA序列，在GenBANK表達序列標簽(EST)數據庫中用BLAST檢索，確認所設計siRNA序列的唯一性，靶向目的MALAT1的序列設計兩條序列。siRNA1正義鏈：5′-GAUCCAUAAUCGGUUUCAAGGTT-3′，反義鏈：5′-CCUUGAAACCGAUUAUGGAUCTT-3′；siRNA2正義鏈：5′-CACAGGGAAAGCGAGUGGUUGGUAATT-3′，反義鏈：5′-UUACCAACCACUCGCUUUCCCUGUGTT-3′。同法構建陰性對照組，兩條DNA鏈的正義鏈：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反義鏈：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′，與任何編碼序列無同源性，上海吉瑪制藥有限公司合成有效siRNA干粉制劑。

1.2.5轉染實驗分為空白組、陰性對照組、MALAT1 siRNA1組、MALAT1 siRNA2組。用完全培養基稀釋對數生長期細胞至4×108·L-1，接種于6 孔板中，常規培養24 h后，調整細胞密度為50% ~80%。在200 μL Opti-MEM中加入5 μL LipofectamineTM2000，室溫孵育5 min后，在200 μL Opti-MEM中加入5 μL siRNA；將上述兩種稀釋液混勻成轉染復合物，室溫孵育20 min。分別配制陰性對照siRNA、siRNA1、siRNA2組轉染復合物。將6孔板中的細胞培養液棄去，PBS清洗1遍，將2 mL Opti-MEM加入空白組；1.6 mL Opti-MEM加入陰性對照組、MALAT1 siRNA1組、MALAT1 siRNA2，再加入對應的上述轉染復合物；輕輕搖勻，置于培養箱常規培養，6 h后更換為含胎牛血清的完全培養基，蜂毒素可在換液后加入。

1.2.6Real-time Quantitative PCR方法檢測MALAT1表達水平細胞總RNA提取采用TRIzol試劑盒操作指南。提取得到的總RNA按TaKaRa試劑盒操作指南，取2 μL總RNA，2 μL Primer Mix，6 μL Water反轉錄成cDNA。取3 μL cDNA，2 μL引物，5 μL SYBGREEN體系進行PCR反應。PCR條件按Qiagen試劑盒操作：MALAT1：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s，共進行45個循環；60 ℃ 30 s；升至95℃采集熔解曲線數據。重復實驗3次。引物序列：內參為β-actin，上游：5′-CCCACACTGTGCCCA TCTACG-3′，下游：5′-GCCATCTCTTGCTCGAAGTC C-3′；MALAT1上游：5′-AAAGCAAGGTCTCCCCA CAAG-3′，下游：5′-GGTCTGTGCTAGATCAAAAGG CA-3′。采用PikoReal 96 Real-Time PCR軟件對實驗結果進行分析。

2結果

2.1蜂毒素對HepG2細胞增殖的抑制作用MTT實驗結果顯示，與空白對照組相比，蜂毒素各濃度組(1、4、8 mg·L-1)處理48h的細胞增殖抑制率均明顯升高，如Fig 1所示。隨著藥物濃度加大，抑制率逐漸增高，呈現出濃度依賴性。

Fig 1　Inhibitory effects of Melittin on proliferation of HepG2 cells

2.2流式細胞術檢測蜂毒素誘導HepG2細胞凋亡藥物處理48 h后，蜂毒素各濃度組均能誘導HepG2細胞凋亡，并呈現一定的濃度依賴性。1、4、8 mg·L-1蜂毒素作用細胞48 h后，細胞凋亡率明顯高于正常對照組(P<0.01)，如Fig 2所示。

Fig 2　Effects of Melittin on cell apotosis of HepG2 cells

A:Control group；B-D:HepG2 cells were treated with various concentrations of Melittin(1,4,8 mg·L-1);E:Histogram.**P<0.01vscontrol

2.3MALAT1在HepG2細胞株上的表達通過qPCR檢測可以看出，與人正常肝細胞株L0-2相比，MALAT1 mRNA在HepG2細胞株上相對高表達，二者之間差異比較具有統計學意義(P<0.01)，如Fig 3所示。

Fig 3　mRNA expression levels of

2.4蜂毒素抑制HepG2細胞中MALAT1的表達用不同劑量的蜂毒素對HepG2細胞進行處理后，檢測其MALAT1的表達情況。1、4、8 mg·L-1的蜂毒素處理后的MALAT1 mRNA表達量明顯下降，并呈濃度依賴性，如Fig 4所示。提示蜂毒素可明顯抑制HepG2細胞中MALAT1 mRNA的表達。

Fig 4　Effects of Melittin on MALAT1 mRNA

2.5MALAT1 siRNAs沉默HepG2細胞中MALAT1 表達用兩種MALAT1特異性siRNAs(siRNA1、siRNA2)沉默HepG2細胞中的MALAT1，相對于陰性對照組，siRNAs均可使MALAT1 mRNA的表達明顯降低，如Fig 5所示，其中MALAT1-siRNA2效果更為明顯，用于后續實驗研究。

Fig 5　Effects of siRNAs on MALAT1 mRNA level in HepG2 cells

**P<0.05,**P<0.01vsnegative control

2.6在HepG2細胞株上沉默MALAT1可促進蜂毒素誘導的HepG2細胞凋亡選取中等劑量4 mg·L-1的蜂毒素處理HepG2細胞同時沉默MALAT1，MTT結果顯示，與單獨給予蜂毒素組比較，siRNA2沉默MALAT1能促進蜂毒素誘導的HepG2細胞增殖抑制率明顯升高(P<0.05)，如Fig 6所示。流式細胞檢測結果顯示，給予蜂毒素同時沉默MALAT1能促進細胞凋亡率升高更明顯(P<0.01)，如Fig 7所示。結果提示沉默MALAT1能有效促進蜂毒素對HepG2細胞增殖抑制和誘導細胞凋亡。

3討論

長鏈非編碼RNA可在腫瘤細胞中特異性地表達，與癌癥的發生發展密切相關[6-7]。MALAT1位于細胞核核小體的核心區，該區域參與基因的聚集、修飾、儲存和加工，在基因表達調控上具有重要作用[8]。 MALAT1可在細胞水平調節絲氨酸精氨酸蛋白(SR)磷酸化模式，從而對剪接進行調節[9]。研究表明MALAT1在肝癌細胞中高表達，抑制MALAT1可降低肝癌細胞HepG2的侵襲力并增加細胞凋亡的敏感性[4]，作用機制可能是通過干擾轉移相關基因與凋亡途徑而實現的。已有研究指出抑制MALAT1可上調caspase-3、caspase-8和Bax而下調Bcl-2 和Bcl-xL[10]。

Fig 6　Inhibitory effects of Melittin and MALAT1-siRNA2

1:Control；2: Melittin(4 mg·L-1)；3: Melittin(4 mg·L-1)+negative siRNA；4: Melittin(4 mg·L-1)+MALAT1-siRNA2.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsMelittin(4 mg·L-1) + negative siRNA group.

Fig 7　Effects of Melittin and MALAT1-siRNA2

A:Control；B: Melittin(4 mg·L-1)；C: Melittin(4 mg·L-1)+negative siRNA；D: Melittin(4 mg·L-1)+MALAT1-siRNA2;E:Histogram.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsMelittin(4 mg·L-1)+negative siRNA group.

我國是全球肝癌新增病例和死亡人數最多的國家，深入研究治療肝癌的藥物具有非常重要的意義。蜂毒素是從蜂毒中提取出來的肽類物質，具有殺菌、抗炎和鎮痛作用，能誘導多種腫瘤細胞凋亡。蜂毒素抗腫瘤分子機制仍然不清楚，需要深入探討研究。目前發現其具有多方面機制[11-14]，如通過影響caspases途徑，最終激活caspase-3導致細胞凋亡；通過調控Bcl-2家族蛋白，使Bcl-2/Bax降低，使細胞凋亡；通過促進Ca2+內流活化CaMKII-TAK1-JNK/p38途徑，并抑制IKK-NF-κB途徑誘導肝癌細胞凋亡，并能通過這種方式增強細胞對凋亡誘導劑TRAIL的敏感性。蜂毒素是否能協同或通過長鏈非編碼MALAT1途徑促進細胞凋亡值得研究，為疾病的預測、診斷和治療提供新的分子依據。

本實驗研究了蜂毒素對HepG2細胞的增殖抑制和促凋亡作用，MTT顯示蜂毒素各濃度組(1、4和8 mg·L-1)處理48h的細胞增殖抑制率均明顯升高，呈現出濃度依賴性關系。流式細胞檢測能誘導HepG2細胞凋亡，并呈現一定的濃度依賴性。通過qPCR檢測發現MALAT1在HepG2細胞株上存在高表達，而用蜂毒素處理48 h后可明顯抑制MALAT1的表達，并呈濃度依賴性，可能的機制是蜂毒素可影響腫瘤細胞周期，將其阻滯于G2/M 期，從而減少了MALAT1基因的表達，這一假設有待于進一步的實驗驗證。鑒于目前RNA沉默技術在腫瘤治療中越來越受到重視，我們也采取兩種MALAT1特異性siRNAs(siRNA1、siRNA2)來沉默HepG2細胞中的MALAT1，結果表明二者均可使MALAT1的表達量明顯降低。通過對比，我們用下調效果更為明顯的siRNA2與蜂毒素(4 mg·L-1)共同作用于HepG2細胞。 MTT與流式細胞儀結果顯示，與單獨給予蜂毒素組比較，siRNA2沉默MALAT1同時給予蜂毒素的細胞的抑制率和凋亡率升高更明顯，提示沉默MALAT1可以促進蜂毒素誘導的HepG2細胞增殖抑制與細胞凋亡，其中機制可能和影響凋亡信號通路(如Bcl-2家族、caspases家族)有關，這是我們下一步工作的方向。

綜上所述，本研究證實了蜂毒素對人肝癌細胞株HepG2促凋亡作用，同時發現蜂毒素還可降低HepG2細胞中MALAT1的表達，體外實驗表明對MALAT1進行沉默可促進蜂毒素誘導細胞凋亡的敏感性，提示二者聯用有相對高的抗癌作用，為臨床用藥提供新的思路，其作用機制還有待于進一步闡明。

參考文獻

[1]Spizzo R, Almeida M I, Colombatti A, et al. Long non-coding RNAs and cancer: a new frontier of translational research[J].Oncogene, 2012, 31(43): 4577-87.

[2]Gutschner T, Hammerle M, Diederichs S. MALAT1-a paradigm for long noncoding RNA function in cancer[J].JMolMed(Berl), 2013, 91(7): 791-801.

[3]Tano K, Mizuno R, Okada T, et al. MALAT-1 enhances cell motility of lung adenocarcinoma cells by influencing the expression of motility-related genes[J].FEBSLett, 2010, 584(22): 4575-80.

[4]Lai M C, Yang Z, Zhou L, et al. Long non-coding RNA MALAT-1 overexpression predicts tumor recurrence of hepatocellular carcinoma after liver transplantation[J].MedOncol, 2012, 29(3): 1810-6.

[5]Lin R, Roychowdhury-Saha M, Black C, et al. Control of RNA processing by a large non-coding RNA over-expressed in carcinomas[J].FEBSLett, 2011, 585(4): 671-6.

[6]李艷利, 張詩夢, 汪菊, 等. 長鏈非編碼RNA在癌癥中的研究進展[J]. 自然雜志, 2014, 36(3): 192-201.

[6]Li Y L, Zhang S M, Wang J, et al. Progress of long noncoding RNA in cancer[J].ChinJNat, 2014, 36(3): 192-201.

[7]Wang X, Li M, Wang Z, et al. Silencing of long noncoding RNA MALAT1 by miR-101 and miR-217 inhibits proliferation, migration, and invasion of esophageal squamous cell carcinoma cells[J].JBiolChem, 2015, 290(7): 3925-35.

[8]Clemson C M, Hutchinson J N, Sara S A, et al. An architectural role for a nuclear noncoding RNA: NEAT1 RNA is essential for the structure of paraspeckles[J].MolCell, 2009, 33(6): 717-26.

[9]Tripathi V, Ellis J D, Shen Z, et al. The nuclear-retained noncoding RNA MALAT1 regulates alternative splicing by modulating SR splicing factor phosphorylation[J].MolCell, 2010, 39(6): 925-38.

[10] Guo F, Li Y, Liu Y, et al. Inhibition of metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1 in CaSki human cervical cancer cells suppresses cell proliferation and invasion[J].ActaBiochimBiophysSin(Shanghai), 2010, 42(3): 224-9.

[11] Zhang H, Zhao B, Huang C, et al. Melittin restores PTEN expression by down-regulating HDAC2 in human hepatocelluar carcinoma HepG2 cells[J].PlosOne, 2014, 9(5): e95520.

[12] Zhu H, Yang X, Liu J, et al. Melittin radiosensitizes esophageal squamous cell carcinoma with induction of apoptosisinvitroandinvivo[J].TumourBiol, 2014, 35(9): 8699-705.

[13] Wang C, Chen T, Zhang N, et al. Melittin, a major component of bee venom, sensitizes human hepatocellular carcinoma cells to tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL)-induced apoptosis by activating CaMKII-TAK1-JNK/p38 and inhibiting IkappaBalpha kinase-NFkappaB[J].JBiolChem, 2009, 284(6): 3804-13.

[14] 沈文文, 趙斌, 黃成, 等. 蜂毒素對人肝癌HepG2細胞增殖和凋亡的影響及其部分機制研究[J]. 中國藥理學通報, 2015, 31(9): 1222-7.

[14] Shen W W, Zhao B, Huang C, et al. effect of Melittin on proliferation and apoptosis of human HepG2 cells. [J].ChinPharmacolBull, 2015, 31(9): 1222-7.

Effects of silencing MALAT1 on proliferation and apoptosis in HepG2 cells induced by Melittin

ZHAO Bin, WU Yu-ting, HUANG Cheng, LYU Xiong-wen, LI Jun

(SchoolofPharmacy,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China)

Abstract：AimTo investigate the effects of silencing MALAT1 gene on cell proliferation inhibition and apoptosis induced by Melittin in human hepatocellular carcinoma HepG2 cells. MethodsThe inhibitory rate of cell proliferation treated with Melittin in HepG2 cells was examined by MTT assay. Apoptotic rate was detected by flow cytometry. The MALAT1 expression level in HepG2 cells was measured by qPCR. Specific siRNAs were utilized to silence MALAT1 expression. The rates of cell proliferation inhibition and apoptosis in HepG2 cells treated with siRNA and Melittin were compared with those of Melittin alone. ResultsMelittin significantly suppressed the growth of HepG2 and induced cell apoptosis in a dose-dependent manner. Compared with normal liver cell lines, MALAT1 was highly expressed in HepG2 cells(P<0.05). The expression of MALAT1 in HepG2 cells was inhibited by Melittin, and the inhibitory rate increased with the increase of concentration. The rates of cell proliferation inhibition and apoptosis in HepG2 cells treated with siRNA and Melittin were significantly higher than those treated merely with Melittin. ConclusionMelittin can reduce the expression of MALAT1 and silencing MALAT1 can effectively promote proliferation inhibition and apoptosis in HepG2 cells induced by Melittin.

Key words：Melittin; long noncoding RNA; MALAT1; RNA silence; apoptosis; HepG2 cells

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1978(2016)02-0211-06

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.02.013

作者簡介：趙斌(1979-)，男，碩士，研究方向：抗炎免疫藥理學，E-mail:ayzhbin@163.com；李俊(1960-)，男，博士，教授，研究方向：臨床藥理學、抗炎免疫藥理學，通訊作者，Tel:0551-65161001,E-mail:lijun@ahmu.edu.cn

基金項目：國家自然科學基金資助項目(No 81473268，81273526)；高校博士點基金資助項目(No 20123420120001)；安徽省自然科學基金資助項目(No 1408085MKL31，1308085MH145)

收稿日期：2015-09-22，修回日期：2015-10-29

網絡出版時間：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160125.1557.026.html網絡出版地址：2016-1-25 15:57