黨參、甘草糖提取物對小腸上皮細胞遷移多胺信號通路的影響

李茹柳，陶玉珠，曾　丹，趙世清，林傳權，陳蔚文

(1.廣州中醫藥大學脾胃研究所，廣東 廣州　510405；2.廣州中醫藥大學中藥學院，廣東 廣州　510006)

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黨參、甘草糖提取物對小腸上皮細胞遷移多胺信號通路的影響

李茹柳1，陶玉珠1，曾丹1，趙世清2，林傳權1，陳蔚文1

(1.廣州中醫藥大學脾胃研究所，廣東 廣州510405；2.廣州中醫藥大學中藥學院，廣東 廣州510006)

中國圖書分類號：R-332；R284.1；R322.45；R329.24；R916.4

摘要：目的觀察益氣健脾中藥黨參、甘草的糖提取物對小腸上皮細胞(IEC-6)遷移過程多胺介導鉀通道激活信號通路的影響，探討黨參、甘草促進胃腸黏膜損傷修復的作用機制。方法在IEC-6細胞遷移模型上，于正常或抑制多胺(加入DFMO)時，觀察黨參、甘草糖提取物對該信號通路的作用：(1)Western blot檢測鉀通道蛋白Kv1.1蛋白表達；(2)流式細胞儀檢測細胞膜電位；(3)激光共聚焦顯微鏡檢測細胞內Ca2+水平；(4)Western blot檢測Ca2+下游指標RhoA蛋白表達。結果黨參、甘草糖提取物在細胞遷移過程可以: (1)提高Kv1.1蛋白表達水平，改善DFMO所致Kv1.1蛋白表達下降；(2)提高細胞膜電位超極化水平，逆轉DFMO所致細胞膜電位去極化；(3)提高細胞內Ca2+水平，黨參糖提取物可逆轉DFMO所致Ca2+水平降低；(4)提高RhoA蛋白表達水平，改善DFMO所致RhoA蛋白表達降低。結論黨參、甘草糖提取物促進IEC-6細胞遷移的作用機制與其影響多胺介導鉀通道激活信號通路有關。

關鍵詞：黨參；甘草；糖提取物；小腸上皮細胞；遷移；作用機制

胃腸黏膜損傷修復包括細胞遷移、分化、增殖等過程，其中細胞遷移是其重要步驟，尤其在早期整復階段[1]。益氣健脾中藥能促進胃腸黏膜損傷修復[2]，但其作用機制尚不清楚。本課題組近年在小腸上皮(IEC-6)細胞的研究發現，益氣健脾中藥黃芪、白術、黨參、甘草的提取物能促進細胞遷移，作用機制與其影響多胺介導鉀通道激活信號通路有關[3-11]，其中對黨參糖提取物(下文圖表中簡稱CSE)、甘草糖提取物(下文圖表中簡稱GSE)的研究表明，二者均可促進IEC-6細胞遷移，逆轉DFMO(多胺合成抑制劑)所致的細胞遷移抑制，提高細胞遷移過程細胞內多胺(精脒)含量，逆轉DFMO所致的精脒含量降低[5-6]；提示其促進細胞遷移的作用與增加細胞內多胺含量有關，為進一步探討黨參、甘草糖提取物促進細胞遷移的作用機制，本文觀察其對多胺介導鉀通道激活信號通路相關指標的影響，為黨參、甘草胃腸黏膜損傷修復作用機制研究提供參考。

1材料

1.1藥材黨參藥材為桔梗科植物黨參Codonopsispilosula(Franch.)Nannf的干燥根；甘草藥材為豆科植物甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.)的干燥根及根莖，由廣州中醫藥大學中藥鑒定教研室童家赟講師鑒定。

1.2試劑高糖DMEM(Cat.No.12800-017)、胎牛血清(Cat.No.10099-141)、青-鏈霉素(Cat.No.15140-122)，均為Gibco公司產品。精脒(spermidine，SPD，Cas.No.124-20-9，Cat.No.85558，分子質量145.25)、二氟甲基鳥氨酸(α-difluoromethylornithine，DFMO，Cas.No.96020-91-6，Cat.No.288500-25MG，分子量236.7)，美國Calbiochem公司產品；胰酶(1 ∶250，Cas.No.9002-07-7，Cat.No.0458-250G)，美國Amresco公司產品；蛋白提取試劑盒(Cat.No.269-500)，美國Biovion公司產品；BCA蛋白濃度測定試劑盒(Cat.No.BP312)，南京碧波生物科技有限公司產品；Kv1.1一抗為多克隆兔抗(Cat.No.ab32433)，RhoA一抗為多克隆兔抗(Cat.No.ab68826)，均為英國Abcam公司產品；GAPDH一抗為多克隆兔抗(Cat. No.10494-1-AP)，美國Proteintech公司產品；HRP標記羊抗兔二抗(Cat.No.EO30120-01)，美國EarthOx公司產品；ECL高靈敏度化學發光檢測試劑盒(Cat.No.CW0049)，北京康為世紀生物科技有限公司產品；牛血清白蛋白(Cat. No.738323)，Roche公司產品；脫脂奶粉(Cat.No.Q/NYLB 0039S)，伊利公司產品；膜電位熒光探針DiBAC4(3)(Cat.No.61011，Lot.No.10D0819)，美國Biotium公司產品。

1.3儀器Smart specphus核酸蛋白測定儀，iMark酶標儀，ChemiDoc XRS化學發光成像系統，均為美國Bio-Rad公司產品；FACSCalibur型流式細胞儀，美國BD公司產品；SP2型激光共聚焦顯微鏡，德國Leica公司產品；激光共聚焦顯微鏡專用玻底培養皿(35 mm×12 mm)，丹麥NUNC公司產品；3111型CO2培養箱，美國Thermo Scientific公司產品；AUW120D型分析天平，日本島津公司產品。

1.4細胞IEC-6細胞(大鼠小腸隱窩上皮細胞)，購自ATCC(American Type Culture Collection)，Catalog No.CRL-1592，Lot.4988325。

2方法

2.1黨參和甘草糖提取物制備黨參、甘草糖提取物制備：稱取黨參或甘草飲片200 g，石油醚回流提取1 h。藥渣揮干溶劑后，用體積分數為0.80的乙醇回流提取2次，每次1 h；藥渣再用蒸餾水回流提取2次，每次1 h，合并2次水提液，減壓濃縮至濃度為含藥材0.5 kg·L-1；濃縮液加無水乙醇至乙醇體積分數為0.80，4℃靜置過夜，以布氏漏斗加濾紙抽濾，去上清液，沉淀物加水溶解，再加無水乙醇使乙醇體積分數為0.80后，沉淀過夜，重復3次；所得沉淀物加純水溶解成水溶液，以Sevage試劑(氯仿 ∶正丁醇=5 ∶1)萃取，取上層水相過大孔樹脂，以蒸餾水洗脫，直至收集的洗脫液與5倍量體積分數為0.95的乙醇混合不產生渾濁，洗脫液加無水乙醇至乙醇體積分數為0.80，所得沉淀物分別用體積分數為0.95的乙醇、無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，真空干燥，4℃保存。使用時加PBS配制成5 g·L-1黨參或甘草糖提取物溶液，0.22 μm濾膜過濾。苯酚-硫酸法以分光光度計測得黨參、甘草糖提取物平均含量(以葡萄糖計)分別為41.0%和49.3%。

2.2Western blot法檢測Kv1.1、RhoA蛋白表達細胞培養及給藥方法：細胞以4×108·L-1，每孔2 mL接種于6孔板，DMEM培養液含10%胎牛血清(FBS)、10 mg·L-1胰島素、100 kU·L-1青霉素-鏈霉素，5%CO2，95%空氣，飽和濕度下37℃培養24 h，用刻刀沿6孔板底部中央輕輕劃一直線劃痕，迅速加入受試藥(黨參、甘草糖提取物終濃度為50、100 mg·L-1)及完全培養基每孔2.5 mL；DFMO負荷實驗則在加受試藥(黨參、甘草糖提取物終濃度為100、200 mg·L-1)同時加入DFMO 2.5 mmol·L-1，在5%CO2，95%空氣，飽和濕度下37℃培養24 h。

總蛋白提取及測定：細胞培養24 h后，吸棄培養液，PBS沖洗細胞表面2次，加適量PBS，細胞刮刀輕輕將細胞從壁上完全刮下，將含有細胞的PBS液收集到5mL離心管，離心后收集細胞，提取總蛋白。總蛋白少量用于蛋白濃度測定，其余予5×蛋白上樣緩沖液以4 ∶1比例混勻，100℃水浴煮沸5 min使蛋白變性，置冰上5 min，然后10 000 r·min-1離心1 min，-20℃分裝保存。蛋白濃度測定按BCA試劑盒說明書操作。

Western blot法操作：蛋白上樣量為每孔20 μg，SDS-PAGE凝膠電泳(起始電壓60 V，條帶到達分離膠后調至120 V)，蛋白轉移至PVDF膜(轉膜電流300 mA，時間1 h)。PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉，分別用一抗Kv1.1、RhoA(均1 ∶1 000稀釋)孵育過夜，洗膜，二抗(1 ∶10 000稀釋)孵育2 h，洗膜，ECL法顯色；X線片曝光條帶并顯影定影，化學發光成像儀Image J圖像處理軟件畫圖工具圈起條帶，所得mean值即各條帶的平均灰度值。比較各組Kv1.1/GAPDH或RhoA/GAPDH平均灰度比值。

2.3流式細胞儀檢測細胞膜電位(Em)[12]細胞培養及給藥方法：細胞生長至80%~90%，消化細胞制作單細胞懸液；以4×108·L-1，每孔2 mL接種于6孔板，37℃、5%CO2，飽和濕度培養24 h，用1 mL移液器吸頭在6孔板底部中央輕輕劃一個“十”字劃痕，PBS沖洗細胞表面3次，迅速加入受試藥(黨參、甘草糖提取物終濃度為50、100 mg·L-1)及完全培養基每孔2.5 mL；DFMO負荷實驗則在加受試藥(黨參、甘草糖提取物終濃度為100、200 mg·L-1)同時加入DFMO 2.5 mmol·L-1，每組3個復孔，37℃、5%CO2，飽和濕度下培養。

細胞懸液制備及熒光標記：加入受試藥后培養12 h，HBSS(D-Hanks緩沖液)沖洗細胞2次，加入胰酶消化，細胞回縮變圓后，加等量DMEM終止消化；3 000 r·min-1離心5 min，棄上清液，加入HBSS重懸；再離心，棄上清液，每個離心管(6孔板每孔細胞收集于1個離心管)加入含1 μmol·L-1DiBAC4(3)溶液的HBSS 1 mL。CO2培養箱中避光孵育8 min，此過程每2 min搖晃混勻1次，使染料與細胞充分結合。孵育完畢，3 000 r·min-1離心5 min；棄上清液，加入適量HBSS重懸，離心，轉入流式管，上流式細胞儀檢測；激發波長488 nm，發射波長520 nm，每管檢測10 000個細胞，同時設不標記的空白細胞管用于調零。比較各組的平均熒光強度(mean值)進行統計。

DiBAC4(3)是細胞膜電位敏感的親脂性陰離子熒光染料，根據其在細胞內外的重新分布，可無損傷地測定細胞膜電位的變化。DiBAC4(3)本身無熒光，當進入細胞與胞質內的蛋白質結合后發出熒光。DiBAC4(3)進入細胞內增多，熒光增強時，表明膜電位負值減小，膜去極化；反之，細胞內熒光強度降低則表示細胞膜超極化。

2.4激光共聚焦顯微鏡檢測細胞Ca2+水平[13]細胞培養及給藥方法：細胞生長至80%~90%，消化細胞制作單細胞懸液；以4×108·L-1，每孔2 mL接種于激光共聚焦培養皿中，37℃、5%CO2，飽和濕度下培養24 h，用1 mL移液器吸頭沿底部中央輕輕劃一直線劃痕，PBS沖洗細胞表面3次，迅速加入受試藥(黨參、甘草糖提取物終濃度為50、100 mg·L-1)及完全培養基每孔2.5 mL；DFMO負荷實驗則在加受試藥(黨參、甘草糖提取物終濃度為100、200 mg·L-1)同時加入DFMO 2.5 mmol·L-1；每組2個復孔，37℃、5%CO2，飽和濕度下培養。

熒光物質孵育：各組加入受試藥培養12 h，HBSS沖洗2次，每個培養皿加入終濃度為5 μmol·L-1的Fluo-3/AM探針裝載液1 mL，CO2培養箱中避光孵育30 min，吸棄探針裝載液，HBSS沖洗細胞3次，加入適量HBSS，CO2培養箱中避光孵育20 min。激光共聚焦顯微鏡下放大200倍進行熒光圖片采集，每個培養皿選擇劃痕附近遷移細胞6個視野采集熒光圖片。

平均熒光強度計算：IPP軟件將圖片轉成灰度圖片，測量累積光密度值(IOD)與area。每張圖片的IOD即為其總熒光強度，再以顯微鏡數出每張圖片的細胞個數；IOD除以細胞總數，即為單張圖片每個細胞的平均熒光強度值。

3結果

3.1黨參、甘草糖提取物對Kv1.1蛋白表達的影響

3.1.1對Kv1.1蛋白表達的影響(無DFMO負荷)Fig 1蛋白條帶灰度值比較，黨參糖提取物(50 mg·L-1和100 mg·L-1)與空白組比較均P<0.01；甘草糖提取物50 mg·L-1組與空白組比較P<0.01，甘草糖提取物100 mg·L-1組與空白組比較P<0.05；表明黨參、甘草糖提取物能提高細胞遷移過程鉀通道蛋白Kv1.1蛋白表達。

3.1.2DFMO負荷時對Kv1.1蛋白表達的影響Fig 2蛋白條帶結果可見，DFMO能抑制Kv1.1蛋白表達，黨參、甘草糖提取物(100 mg·L-1或200 mg·L-1)能改善DFMO所致Kv1.1蛋白表達抑制。

Fig 1　Effect of Codonopsis and Glycyrrhizae saccharide

1：CSE100 mg·L-1；2： CSE 50 mg·L-1；3：Control；4：spermindine 5 μmol·L-1；5： GSE 50 mg·L-1；6： GSE 100 mg·L-1

Fig 2　Effect of Codonopsis and Glycyrrhizae saccharide

1：DFMO+CSE 200 mg·L-1；2： DFMO+ CSE 100 mg·L-1；3：Control；4：DFMO 2.5 mmol·L-1；5：DFMO+spermidine 5 μmol·L-1；6： DFMO+GSE 100 mg·L-1；7： DFMO+GSE 200 mg·L-1

3.2黨參、甘草糖提取物對細胞膜電位的影響

3.2.1對細胞膜電位的影響(無DFMO負荷)Fig 3和Tab 1結果顯示，黨參、甘草糖提取物組(50 mg·L-1)細胞的平均熒光強度低于空白組(P<0.01)，表明其細胞膜超極化水平高于空白組，Em增加。表明黨參、甘草糖提取物可增加細胞膜超極化水平，提高細胞膜電位。

Tab 1　Effect of Codonopsis and Glycyrrhizae

***P<0.01vscontrol

3.2.2DFMO負荷時對細胞膜電位的影響Tab 2結果顯示，DFMO模型組細胞平均熒光強度高于空白組(P<0.05)，表明DFMO組細胞膜去極化水平高于空白組，Em降低；黨參、甘草糖提取物(100 mg·L-1或200 mg·L-1)能逆轉DFMO所致細胞膜去極化(與模型組比較P<0.05或P<0.01)。

3.3黨參、甘草糖提取物對細胞Ca2+水平的影響

3.3.1對細胞Ca2+水平的影響(無DFMO負荷)Fig 4和Tab 3結果顯示，黨參、甘草糖提取物(50 mg·L-1或100 mg·L-1)能提高細胞遷移過程細胞Ca2+水平(與空白組比較P<0.01)。

Fig 3　Effect of Codonopsis and Glycyrrhizae saccharide extracts on Em

A:Control; B:Spermidine 5 μmol·L-1;C:CSE 50 mg·L-1;D:CSE 100 mg·L-1;E:GSE 50 mg·L-1;F:GSE 100 mg·L-1

Tab 2　Effect of Codonopsis and Glycyrrhizae

**P<0.05vscontrol；ΔP<0.05，ΔΔP<0.01vsDFMO

Tab 3　Effect of Codonopsis and Glycyrrhizae saccharide

***P<0.01vscontrol

3.3.2DFMO負荷時對細胞Ca2+水平的影響Tab 4結果顯示，DFMO負荷時，細胞Ca2+水平降低(模型組與空白組比較P<0.01)；黨參糖提取物(100 mg·L-1或200 mg·L-1)能逆轉DFMO所致Ca2+水平降低(與模型組比較P<0.01)。

Tab 4　Effect of Codonopsis and Glycyrrhizae saccharide

***P<0.01vscontrol；△△P<0.01vsDFMO

3.4黨參、甘草糖提取物對RhoA蛋白表達的影響

3.4.1對RhoA蛋白表達的影響(無DFMO負荷)Fig 5蛋白條帶灰度值比較，黨參、甘草糖提取物(50 mg·L-1和100 mg·L-1)與空白組比較均P<0.01；表明黨參、甘草糖提取物能提高細胞遷移過程RhoA蛋白表達。

3.4.2黨參和甘草糖提取物對DFMO負荷下RhoA蛋白表達的影響Fig 6蛋白條帶結果可見，DFMO能抑制RhoA蛋白表達，黨參、甘草糖提取物(100 mg·L-1或200 mg·L-1)能改善DFMO所致RhoA蛋白表達降低。

4討論

黨參性味甘平，歸脾、肺經；功能健脾益肺，養血生津；用于脾肺氣虛，食少倦怠，咳嗽虛喘，氣血不足，足，面色萎黃，心悸氣短，津傷口渴，內熱消渴。甘草性味甘平，歸心、肺、脾、胃經，功能補脾益氣，清熱解毒，祛痰止咳，緩急止痛，調和諸藥；用于脾胃虛弱，倦怠乏力，心悸氣短，咳嗽痰多，脘腹、四肢痙急疼痛，癰腫瘡毒，緩解藥物毒性、烈性[14]。黨參、甘草是益氣健脾著名方劑四君子湯的組成藥物，臨床和實驗研究表明，四君子湯有促進胃腸黏膜損傷修復的作用[15]。

Fig 4　Effect of Codonopsis and Glycyrrhizae saccharide extracts on [Ca2+]cyt(200×)

A:Control; B:Spermidine 5 μmol·L-1;C:CSE 50 mg·L-1;D:CSE 100 mg·L-1;E:GSE 50 mg·L-1;F:GSE 100 mg·L-1

Fig 5　Effect of Codonopsis and Glycyrrhizae

1： CSE 100 mg·L-1；2： CSE 50 mg·L-1；3：Control；4： Spermindine 5 μmol·L-1；5： GSE 50 mg·L-1；6： GSE 100 mg·L-1

Fig 6　Effect of Codonopsis and Glycyrrhizae saccharide extracts

1：DFMO+CSE 200 mg·L-1；2： DFMO+CSE 100 mg·L-1；3： Control；4：DFMO 2.5 mmol·L-1；5： DFMO+spermidine 5 μmol·L-1；6：DFMO+GSE 100 mg·L-1；7： DFMO+GSE 200 mg·L-1

小腸上皮損傷后整復階段，多胺增加則增強了鉀通道蛋白的表達，K+外流，導致細胞膜超極化，增強了Ca2+內流驅動力而提高了細胞內Ca2+水平，后者增加了RhoA活性，使Rho-kinase激活，增加了肌球蛋白輕鏈磷酸化，從而刺激了應力纖維形成和細胞遷移；相反，消除了細胞內多胺(加入DFMO)，則下調了鉀通道活性，減少了細胞內Ca2+，使RhoA/Rho-kinse信號通路不激活，減少了肌球蛋白輕鏈磷酸化，從而抑制了細胞遷移[1]。二氟甲基鳥氨酸(DFMO)是多胺合成的限速酶——鳥氨酸脫羧酶的特異性抑制劑，本課題組前期研究表明，黨參、甘草糖提取物可促進小腸上皮(IEC-6)細胞遷移，逆轉DFMO所致的細胞遷移抑制，提高細胞遷移過程多胺(精脒)含量，逆轉DFMO所致的精脒含量降低[5-6]。本文在此基礎上，觀察黨參糖提取物、甘草糖提取物對IEC-6細胞遷移多胺介導鉀通道激活信號通路的影響。結果顯示二者在細胞遷移過程可以：提高鉀通道蛋白Kv1.1蛋白表達水平，改善DFMO所致Kv1.1蛋白表達下降；提高細胞膜電位超極化水平，逆轉DFMO所致細胞膜電位去極化；提高細胞內Ca2+水平，其中黨參糖提取物能逆轉DFMO所致Ca2+水平降低；提高Ca2+下游指標RhoA蛋白表達水平，改善DFMO所致RhoA蛋白表達降低。本課題組的另一研究表明，黨參、甘草糖提取物可逆轉鉀通道抑制劑4-氨基吡啶(4-AP)所致的細胞遷移抑制及細胞膜去極化[16-17]。結合前期黨參、甘草糖提取物在IEC-6細胞的實驗結果[5-6]，表明其促進IEC-6細胞遷移的作用機制，與其影響多胺介導鉀通道激活信號通路有關；此研究結果也與本課題組在益氣健脾中藥黃芪、白術、黨參、甘草提取物的作用類似[3-11]。提示對細胞遷移多胺介導鉀通道激活信號通路的影響，可能是益氣健脾中藥促進胃腸黏膜損傷修復的作用機制之一。

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Effect of Codonopsis and Glycyrrhizae saccharide extracts on polyamine-dependent signaling pathway during cell migration in IEC-6

LI Ru-liu1, TAO Yu-zhu1, ZENG Dan1, ZHAO Shi-qing2, LIN Chuan-quan1, CHEN Wei-wen1

(1.PiweiInstituteofGuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510405,China;2.SchoolofChineseHerbalMedicine,GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510006,China)

Abstract:AimsTo observe the effect of saccharide extracts of Yiqijianpi herb Codonopsis and Glycyrrhizae on polyamine-dependent activation of K+channels signal pathway during cell migration and to investigate their mechanism of promoting restoration in gastrointestinal mucosal injuries. MethodThe study was based on IEC-6 cell migration model. While in a normal polyamine level or polyamine was inhibited by DFMO, the effect of Codonopsis saccharide extracts and Glycyrrhizae saccharide extracts on polyamine-dependent activation of K+channels signal pathway during cell migration was observed. (1) K+channel protein Kv1.1 was determined by Western blot. (2)Membrane potential was measured by Flow Cytometer. (3) Laser scanning confocal microscope was used for measuring [Ca2+]cyt. (4) The expression of RhoA, which is Ca2+downstream protein, was determined by Western blot. ResultsDuring cell migration, Codonopsis and Glycyrrhizae saccharide extracts could: (1) improve the expression of Kv1.1 protein and ameliorate the decrease of kv1.1 protein expression by DFMO; (2) increase membrane hyperpolarization and reverse membrane depolarization resulted by DFMO; (3) improve intracellular [Ca2+]cyt, while Codonopsis could reverse the decrease of [Ca2+]cyt caused by DFMO; (4) improve the expression of RhoA protein, reversing its decline caused by DFMO. ConclusionCodonopsis and Glycyrrhizae saccharide extracts can promote cell migration in IEC-6 cell, which is correlated with their effect on polyamine-dependent activation of K+channels signal pathway.

Key words:Codonopsis; Glycyrrhizae; saccharide extracts; intestinal epithelial cell; migration, mechanism of action

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1978(2016)02-0245-07

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.02.019

作者簡介：李茹柳(1962-)，女，博士，教授，研究方向：益氣健脾中藥作用機制，通訊作者，Tel：020-36585444；E-mail：lrl@gzucm.edu.cn

基金項目：國家自然科學基金資助項目(No 30772753，81173254)；中央財政支持地方高校發展專項資金項目“重大難治性脾胃病防治協同創新平臺”[財教(2013)338號]；華南中醫藥協同創新中心—中醫藥防治脾胃病、腦病創新研究團隊項目(No E1-KFD015141K03)

收稿日期:2015-10-20,修回日期:2015-11-09

網絡出版時間：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160125.1557.038.html網絡出版地址：2016-1-25 15:57