PI3K/Akt/Sirt1信號通路介導硫化氫后處理對大鼠缺血心肌的保護作用

胡明珠，周　波，盛　瓊，杜　斌，陳俊良，龐慶豐，季　永

[1.江南大學附屬醫院 (無錫市第四人民醫院)麻醉科，江蘇 無錫　214062；2.江南大學無錫醫學院，江蘇 無錫　214062]

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PI3K/Akt/Sirt1信號通路介導硫化氫后處理對大鼠缺血心肌的保護作用

胡明珠1,2，周波1，盛瓊2，杜斌2，陳俊良2，龐慶豐2，季永1,2

[1.江南大學附屬醫院 (無錫市第四人民醫院)麻醉科，江蘇 無錫214062；2.江南大學無錫醫學院，江蘇 無錫214062]

中國圖書分類號：R-332；R322.11；R329.25；R331.31；R542.202.2

摘要：目的探討PI3K/Akt/Sirt1 信號通路是否參與硫化氫(H2S)抗心肌缺血/再灌注( I/R )損傷的作用。方法采用Langendorff灌流裝置建立大鼠離體心臟I/R損傷模型，平衡灌注20 min后，全心停灌30 min，復灌60 min。60只♂SD大鼠，隨機分為5組(n=12)：空白組(Control組)、缺血/再灌注組(I/R組)、H2S后處理組(H2S組)、抑制劑LY294002組(LY組)、H2S后處理+ 抑制劑組(H2S+LY組)。統計平衡末及再灌注末的左室舒張末期壓(LVEDP)、左室發展壓(LVDP)、左室內壓上升最大速率(+dp/dtmax)和左室內壓下降最大速率(-dp/dtmax)；TTC法測定心肌梗死面積；實時熒光定量PCR 法檢測Sirt1和PGC-1α的 mRNA 含量；通過Western blot法檢測總的Sirt1和PGC-1α 的蛋白表達水平；免疫組化檢測Sirt1的細胞分布情況。結果各組間的心功能指標在平衡末差異無統計學意義(P>0.05)。再灌注60 min，H2S組與I/R組相比，心功能的各項指標明顯改善(P<0.05)，心肌梗死面積減少(26.9±4.9)% vs(48.9±5.6)%(P<0.05)；Sirt1和PGC-1α表達水平明顯升高(P<0.05)；Sirt1的細胞核陽性表達指數增加(P<0.05)。LY294002逆轉了H2S后處理產生的心肌保護效應，使H2S后處理+抑制劑組心功能指標、Sirt1和PGC-1α 的表達及Sirt1的細胞核陽性表達指數降低，心肌梗死面積增加。結論PI3K/Akt/Sirt1信號通路參與了H2S后處理對大鼠缺血心肌的保護作用。

關鍵詞：缺血/再灌注損傷；硫化氫；后處理；PI3K/Akt；Sirt1；PGC-1α；心臟保護

越來越多的研究表明，H2S是一種有效的心臟保護氣體信號分子,參與許多心血管系統的病理、生理調節過程。雖然本課題組前期研究證實，外源性H2S后處理通過磷脂酰肌醇3 激酶/ 蛋白激酶B(phosphatidyqinositol-3 kinase/protein kinase B，PI3K/Akt) 信號通路保護大鼠缺血心肌[1-2]，但其下游靶分子仍未完全清楚。有文獻報道，Sirt1表達水平的降低可導致心肌梗死的發生[3]，激活PI3K/Akt可磷酸化Sirt1，使其進入細胞核發揮作用[4]。然而，PI3K/Akt/Sirt1信號通路是否參與了H2S后處理對大鼠缺血心肌的保護作用還未見報到。本研究擬通過使用大鼠離體心臟I/R損傷模型及PI3K/Akt特異性抑制劑LY294002來探索PI3K/Akt/Sirt1信號通路在H2S保護缺血心肌中的作用。

1材料與方法

1.1試劑氯化三苯基四氮唑(TTC)、硫氫化鈉、 LY294002(Sigma, 美國)；鼠抗Sirt1單克隆抗體(ab110304，Abcam)、兔抗PGC-1α多克隆抗體(ab54481，Abcam)；兔抗β-actin多克隆抗體(Bioworld Technology, 美國)、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物公司)及辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG(武漢博士德生物公司)；SDS-PAGE 凝膠試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、超敏ECL化學發光試劑盒(碧云天生物技術公司)；動物組織總RNA提取試劑盒(天根生化科技)；逆轉錄及實時熒光定量PCR檢測試劑盒(TaKaRa，日本)。

1.2儀器Langendorff離體心臟灌流裝置、Power Lab八通道生理記錄儀(ADInstrument ，澳大利亞)；Roche實時熒光定量PCR儀(Roche Light Cycler480Ⅱ，德國)。

1.3大鼠離體心臟I/R模型的制備清潔級♂SD大鼠60只(8~10周齡，250±30 g)，上海斯萊克實驗動物責任有限公司提供，實驗動物許可證號：SCXK (滬) 2012-0002。腹腔注射3%的戊巴比妥鈉(80 mg·kg-1)麻醉，肝素鈉500 U·kg-1抗凝。麻醉后迅速打開胸腔取出心臟，置于呈冰水混合物狀態的95% O2和5% CO2混合氣體飽和的K-H液中，然后經主動脈逆行插管固定在Langendorff 灌注裝置上。使用37 ℃恒溫加熱的95% O2和5% CO2混合氣體飽和的改良K-H液進行常規恒流灌注(12 mL·min-1)。改良的K-H液成分為(mmol·L-1)：NaCl 118.5、KCl 4.7、CaCl22.5、MgSO41.2、KH2PO41.2、NaHCO324.8、D-Glucose 11、EDTA-2Na 0.125，pH=7.2~7.4。通過左心室內自制球囊實時監測心臟血流動力學指標：左室發展壓(LVDP)、左室內壓上升/下降最大速率(±dp/dtmax)和左室舒張末壓(LVEDP)等。

1.4實驗動物分組60 只♂SD大鼠隨機分為5組(n=12)：① Control組，全心持續灌注110 min；② I/R組，平衡20 min后，全心停灌30 min，再灌注60 min；③ I/R + NaHS組(H2S組)，全心停灌30 min后，復灌即刻給予含NaHS 10 μmol·L-1的K-H液15 s，不含NaHS的K-H液15 s，連續重復4次[1]，其余處理同I/R組；④ I/R+LY294002組(LY組), 平衡末10 min及復灌前5 min給予15 μmol·L-1LY294002[8]溶于0.02% DMSO的K-H液，共15 min，其余處理同I/R組；⑤ I/R+NaHS+LY294002組(H2S+LY組),平衡末10 min及復灌前5 min給予15 μmol·L-1LY294002溶于0.02% DMSO的K-H液，共15 min，同時復灌即刻給予含NaHS 10 μmol·L-1的K-H液15 s，不含NaHS的K-H液15 s，重復4次，其余處理同I/R組。

1.5TTC法測定心肌梗死面積復灌末取下大鼠心臟，置于-80 ℃冷凍5~10 min，剔除右心室和右心房后，將心臟橫切成約2~3 mm的薄片(4~6片)，然后浸于37 ℃的1% TTC磷酸緩沖液(pH 7.4)中閉光孵育20 min。終止反應后，可見梗死的灰白色心肌以及存活的磚紅色心肌。甲醛固定后，將切片心肌進行掃描，采用Image J軟件計算心肌梗死面積百分比/%=(梗死心肌面積之和/心肌總面積之和)× 100%。

1.6熒光實時定量PCR法檢測Sirt1和PGC-1α的 mRNA含量取復灌末置于-80 ℃冰箱保存的心肌組織，按照總RNA提取試劑盒說明書步驟提取總RNA，并以總RNA為模板，加入逆轉錄試劑合成 cDNA。根據SYBR Green 試劑盒說明書，以cDNA為模板進行逆轉錄聚合酶鏈式反應，通過Roche Light Cycler480Ⅱ熒光定量PCR儀實時監測熒光強度。根據Light Cycler480 optical system software(SW1.5.1)提供的CP值，以GAPDH為內參，用算術公式“2-ΔΔCT”對結果進行計算后再統計分析[3]。以檢索Genbank得到的基因序列設計引物如下：Sirt1，5′-CACCGAGGAACTACCTGAT-3′(forward),5′-CATCCCAGCCTCCGTTAT-3′(reverse)。PGC-1α， 5′-CCTCCATGCCTGACGGCACC-3′(forward),5′-GAGCTGAGTGTTGGCTGGCG-3′(reverse)。GAPDH，5′-GGA TGGAATTGTGAGGGAGA-3′(forward),5′-GTGGACCT CATGGCCTACAT-3′(reverse)。引物均由上海生工合成。

1.7Western blot 法測定Sirt1和 PGC-1α的蛋白表達取適量-80 ℃保存的心肌組織置于冰上，加入預冷的裂解液，快速制備組織勻漿，4 ℃ 14 000×g離心10 min后取上清。BCA法測定蛋白濃度后配平，加入5×SDS上樣緩沖液后煮沸。取40 μg總的心肌蛋白進行SDS-PAGE電泳，然后將蛋白轉移到PVDF膜上。5%的脫脂奶粉室溫搖床封閉2 h ，加入TBST稀釋的一抗(Sirt1，1 ∶1 000； PGC-1α，1 ∶1 000；β-actin，1 ∶3 000)，4℃搖床孵育過夜，TBST漂洗后加入相應的HRP標記的二抗(1 ∶2 000)，繼續室溫搖床封閉2 h ，最后采用超敏ECL發光液進行曝光，用Image J對蛋白條帶進行分析。

1.8免疫組化法檢測Sirt1的細胞分布心肌組織石蠟切片，按照SABC即用型免疫組化試劑盒說明書進行標記染色(武漢博士德生物公司)。按標準免疫組化步驟處理石蠟切片。加入PBS稀釋的一抗(Sirt1，1 ∶300)，4 ℃孵育過夜后DAB顯色，鏡下不斷觀察染色程度，終止反應后蘇木精染核。每張切片在×400鏡頭下隨機選取6個高倍視野，統計相應視野內的Sirt1 陽性細胞核個數，以細胞核陽性表達指數(%)即視野內陽性細胞核個數/視野內所有心肌細胞個數來反映各組心肌組織中Sirt1的細胞分布情況 。

GroupBaselineReperfusion30min60minLVEDP/kPaControl0.83±0.181.05±0.191.09±0.20I/R0.85±0.166.06±0.85*6.46±0.75*I/R+NaHS0.84±0.164.38±0.57#4.50±0.76#I/R+LY2940020.85±0.186.46±0.91△6.06±0.91△I/R+LY294002+NaHS0.83±0.185.98±0.89△5.80±0.90△LVDP/kPaControl14.30±0.6513.75±0.5113.49±0.52I/R14.33±0.915.86±1.11*6.13±1.33*I/R+NaHS13.99±0.838.00±1.56#8.32±1.70#I/R+LY29400214.08±0.895.58±1.21△5.61±1.57△I/R+LY294002+NaHS13.82±0.995.84±1.55△5.66±1.47△+dp/dtmax/kPa·s-1Control361±23358±25348±25I/R360±25170±25*155±25*I/R+NaHS341±24208±23#230±27#I/R+LY294002345±26148±27△152±27△I/R+LY294002+NaHS331±26151±25△146±25△-dp/dtmax/kPa·s-1Control-311±24-293±24-290±24I/R-298±23-125±27*-113±29*I/R+NaHS-293±23-161±27#-163±27#I/R+LY294002-297±26-117±26△-112±29△I/R+LY294002+NaHS-316±24-124±28△-128±28△

**P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsI/R group;△P<0.05vsI/R+NaHS group

2結果

2.1硫氫化鈉后處理對大鼠各項心功能指標的影響實驗結果顯示，在平衡末各組心功能指標間差異無統計學意義(P>0.05)。除Control組外，復灌30 min 和60 min后，其它4組與平衡末基礎值相比，LVEDP明顯升高(P<0.05)，LVDP和±dp/dtmax明顯降低(P<0.05)；與I/R組比較，H2S組 LVEDP 明顯降低(P<0.05)，LVDP和±dp/dtmax明顯升高(P<0.05)；與H2S組相比，H2S+LY組LVEDP明顯升高(P<0.05)，LVDP和±dp/dtmax明顯降低(P<0.05)，見Tab 1。

2.2硫氫化鈉后處理對大鼠缺血心肌梗死面積的影響復灌末I/R組的心肌梗死面積為(48.9±5.6) %，與Control組梗死面積百分比(16.3±4.1)%相比明顯增加(P<0.05)；與I/R組比較，H2S組梗死面積百分比減小，為(26.9±4.9)%(P<0.05)；與H2S組相比，H2S+LY組梗死面積百分比增加為(49.0±5.7)% (P<0.05)，見Fig 1。

Fig 1　Percentage of infract size of myocardium

One representative image of the myocardial infarct size of each group is shown. a: Control; b:I/R; c:I/R +NaHS; d:I/R+LY294002; e: I/R+LY294002+NaHS.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsI/R group;△P<0.05vsI/R+NaHS group

2.3硫氫化鈉后處理對大鼠缺血心肌Sirt1和PGC-1α mRNA水平的影響實時熒光定量PCR法檢測結果見Fig 2A和Fig 2B。I/R組Sirt1、PGC-1α mRNA的表達水平升高，但與Control組相比差異無統計學意義(P>0.05)；與I/R組比較，H2S組Sirt1、PGC-1α mRNA的表達水平進一步升高(P<0.05)；與H2S組相比，H2S+LY組Sirt1、PGC-1α mRNA表達水平明顯降低(P<0.05)。

Fig 2　Effects of NaHS on Sirt1 and ±s,n=3)

A and B: The levels of Sirt1 and PGC-1α mRNA were tested using real-time PCR; C and D: The protein levels of Sirt1 and PGC-1α were tested using Western blot.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsI/R group;△P<0.05vsI/R+NaHS group

2.4硫氫化鈉后處理對大鼠缺血心肌Sirt1和PGC-1α蛋白表達水平的影響Western blot法分析結果見Fig 2C和Fig 2D。I/R組與Control組相比，Sirt1蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)；與I/R組比較，H2S組Sirt1 蛋白表達水平升高(P<0.05)；與H2S組相比，H2S+LY組Sirt1蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)。PGC-1α在正常心肌組織中表達量比較低，在I/R組中，PGC-1α蛋白表達水平升高，但差異無統計學意義(P>0.05)；與I/R組比較，H2S組PGC-1α蛋白表達水平升高(P<0.05)；與H2S組相比，H2S+LY組PGC-1α蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)。

2.5硫氫化鈉后處理對大鼠缺血心肌Sirt1的細胞分布影響免疫組化法檢測心肌組織中Sirt1的細胞分布，見Fig3A、3B。結果顯示，在Control組中Sirt1主要位于細胞核中，陽性表達指數為(51±4)%，與Control組比較，I/R組Sirt1陽性細胞核個數明顯減少，為(22±3)%(P<0.05)；與I/R組比較，H2S組Sirt1細胞核陽性表達指數增加，為(43±4)%(P<0.05)；與H2S組比較，H2S+LY組Sirt1細胞核陽性表達指數減少，為(25±4)%(P<0.05)。

3討論

Sirt1是尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)依賴的高度保守第三類組蛋白/非組蛋白去乙酰酶抑制劑家族的成員之一，作為敏感的能量感應器調節著許多重要的代謝和生理過程。本課題組的近期研究表明，PGC-1α參與了H2S后處理對心肌I/R損傷的保護作用[5]。雖然PGC-1α作為Sirt1的直接下游靶分子，可以被Sirt1去乙酰化而激活，發揮其調節線粒體生物合成和能量代謝的重要作用[6]，但是Sirt1是否也參與了H2S的抗心肌缺血作用還尚未知。本實驗發現，Sirt1 在I/R組減少，而在硫化氫后處理組增加，同時心肌梗死面積減少及心臟整體功能提高，認為Sirt1在硫化氫后處理保護缺血大鼠心肌中起重要作用。這與Wu等[7]近期研究結果：硫化氫可通過Sirt1途徑減輕氧化應激誘導的心肌凋亡相一致。

Fig 3　Effects of NaHS on location of ±s,n=3)

A:Sirt1 location was examined by IHC(40×).One representative image of each group is shown. a： Control; b:I/R; c:I/R+NaHS; d:I/R+LY294002; e:I/R+LY294002+NaHS. B:The percentage of Sirt1-positive nuclei for each group was quantified.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsI/R group;△P<0.05vsI/R+NaHS group

PI3K/Akt是細胞內重要的信號轉導通路,在細胞的生存、凋亡以及增殖等活動中發揮重要的生物學功能。季永等[8]研究結果表明，外源性硫化氫后處理通過PI3K/Akt 信號通路調節線粒體Cx43蛋白，保護大鼠缺血心肌。有文獻報道[5]，當細胞受到外界刺激時，激活PI3K/Akt,磷酸化Sirt1，使其進入細胞核發揮作用。為了研究Sirt1在硫化氫后處理中的保護機制及H2S是否通過PI3K/Akt信號通路調節Sirt1的表達，本實驗使用PI3K/Akt 信號通路抑制劑LY294002，觀察各組心功能指標、心肌梗死面積、Sirt1和PGC-1α的表達水平以及Sirt1的細胞分布。

研究結果顯示，離體大鼠心臟經過全心缺血30 min，復灌60 min后，心臟整體功能明顯下降。與I/R組比較，H2S組明顯改善了心臟功能，主要表現為LVDP和±dp/dtmax均升高，LVEDP降低，心肌梗死面積減少等。在Control組中，Sirt1 的表達量較高，I/R損傷明顯降低了Sirt1 的表達量。但在H2S后處理后，與I/R組比較，Sirt1和PGC-1α蛋白表達水平及mRNA水平都明顯提高了。而加入PI3K/Akt抑制劑LY294002 后，H2S后處理的缺血心肌改善作用被廢除，Sirt1和PGC-1α蛋白表達水平及mRNA水平降低，提示PI3K/Akt/Sirt1 參與了H2S后處理對心肌I/R損傷的保護作用。

Sirt1幾乎在所有的哺乳動物細胞中都有表達，但其亞細胞定位卻不盡相同，有的僅在細胞質中表達，有的僅在細胞核中表達，還有一些在細胞質和細胞核中均有表達[9-10]。已有研究表明Sirt1是一種可以往返于細胞核和細胞質的蛋白[11]，而且Sirt1細胞核轉移量對其發揮細胞保護功能至關重要[12]。因此，我們采用了免疫組化的方法檢測了Sirt1的亞細胞定位。實驗結果顯示，在Control組中，Sirt1主要位于細胞核中，I/R損傷降低了Sirt1 的陽性細胞核指數。而與I/R組相比，H2S組提高了Sirt1 的陽性細胞核指數，提示H2S后處理通過調節Sirt1的蛋白表達量以及增加Sirt1陽性細胞核指數，保護大鼠缺血心肌。但Sirt1發揮其保護作用的具體機制將有待于進一步的深入研究。

綜上所述，本實驗研究結果表明H2S 后處理通過PI3K/Akt 信號通路增加Sirt1、PGC-1α的 表達及Sirt1陽性細胞核指數，減輕離體大鼠I /R 損傷。

(致謝：本實驗研究主要在江南大學無錫醫學院龐慶豐教授、邱麗穎教授實驗室以及醫學院綜合實驗平臺完成，感謝龐慶豐教授和邱麗穎教授給予課題實驗的悉心指導！)

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PI3K/Akt/Sirt1 signaling pathway mediated hydrogen sulfide postconditioning-induced protection against I/R injury

HU Ming-zhu1,2,ZHOU Bo1,SHENG Qiong2,DU Bin2,CHEN Jun-liang2,PANG Qing-feng2,JI Yong1,2

[1.DeptofAnesthesiology,theAffiliatedHospitalofJiangnanUniversity(Wuxi4thPeople′sHospital),WuxiJiangsu214062,China;2.WuxiMedicalSchool,JiangnanUniversity,WuxiJiangsu214062,China]

Abstract:AimTo explore the role of PI3K/Akt/Sirt1 pathway in cardioprotection of hydrogen sulfide(H2S) postconditioning against ischemia/reperfusion(I/R) injury.MethodsLangendorff perfusion apparatus was used to build an isolated rat myocardial I/R model. Isolated rat hearts were subjected to 30 min global ischemia followed by 60 min reperfusion after 20 min of equilibrium. 60 male SD rats were randomly divided into 5 groups(n=12): control group(Control), ischemia/reperfusion group(I/R), H2S postconditioning group(H2S), inhibitor LY294002 group(LY) and H2S with inhibitor group(H2S+LY). The left ventricular diastolic pressure(LVEDP),the left ventricular developed pressure(LVDP), the maximum rate of increase or decrease of left ventricular pressure(±dp/dtmax) were registered at the end of 20 min equilibrium, 30 and 60 min of reperfusion separately. Triphenyl tetrazolium chloride(TTC) staining was used to determine the myocardial infarct size. The levels of Sirt1 and PGC-1 mRNA were tested using real-time PCR. The expressions of Sirt1and PGC-1α were detected with Western blot analysis. Immunohistochemical method was used to determine the location of Sirt1.ResultsThere were no differences in equilibrium hemodynamics observed between the experimental groups(P>0.05). At the end of reperfusion, compared with I/R group, H2S group had obviously ameliorated functional recovery and significantly decreased the myocardial infarct size(26.9±4.9)% vs(48.9±5.6)%(P<0.05). Meanwhile, the expression of Sirt1 and PGC-1α increased significantly. However,LY294002 reversed the cardioprotective effects provided by hydrogen sulfide postconditioning and reduced the level of Sirt1and PGC-1α, the percentage of Sirt1-positive nuclei.ConclusionPI3K/Akt/Sirt1 signaling pathway mediates the hydrogen sulfide postconditioning-induced protection against I/R injury.

Key words:ischemia/reperfusion; hydrogen sulfide; postconditioning; PI3K/Akt; Sirt1; PGC-1α; cardioprotection

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1978(2016)02-0268-06

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.02.023

作者簡介：胡明珠(1989-)，女，碩士生，研究方向：重要臟器功能衰竭的機制及預防，E-mail :luhehude@163.com；季永(1969-)，男，博士，主任醫師，碩士生導師，研究方向：心、 肺、腦功能衰竭的機制及預防，通訊作者，E-mail:jiyong6914@163.com

基金項目：國家自然科學基金資助項目(No 81270126)；無錫市醫學管理中心醫學科研面上項目(No YGZXM1407)；江蘇省大學生創新項目(No KYLX_1174)

收稿日期:2015-10-26,修回日期:2015-11-28

網絡出版時間：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160125.1557.046.html

網絡出版地址：2016-1-25 15:57