小鼠不同心肌肥厚模型標志性基因表達變化的比較

闞紅衛，司文文，尹艷艷，何　燦，程　杰，汪春彥，張瓊光，楊　雁

(1. 安徽醫科大學基礎醫學院藥理教研室，安徽 合肥　230022；2. 安徽省食品藥品審評認證中心， 安徽 合肥　230051；3. 安徽省食品藥品檢驗研究院，安徽 合肥　230051；4. 湖北省食品藥品監督管理局技術審評核查中心，湖北 武漢　430071)

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小鼠不同心肌肥厚模型標志性基因表達變化的比較

闞紅衛1,2，司文文3，尹艷艷1，何燦1，程杰3，汪春彥3，張瓊光4，楊雁1

(1. 安徽醫科大學基礎醫學院藥理教研室，安徽 合肥230022；2. 安徽省食品藥品審評認證中心， 安徽 合肥230051；3. 安徽省食品藥品檢驗研究院，安徽 合肥230051；4. 湖北省食品藥品監督管理局技術審評核查中心，湖北 武漢430071)

中國圖書分類號：R-332；R322.11；R363-332；R394.2；R542.202.2；R977.6

摘要：目的探索小鼠不同心肌肥厚模型間肥厚性標志基因心房利尿鈉肽(ANP)、腦利尿鈉肽(BNP)、β-肌球蛋白重鏈(β-MHC)基因表達的差異。方法取C57BL/6小鼠，采用腎上腹主動脈縮窄(AAC)、動靜脈瘺(AVF)和異丙腎上腺素(ISO)分別建立小鼠心肌肥厚模型。造模結束，稱取各小鼠體重(BW)、心臟重量(HW)和左室重量(LVW)，計算心臟重量指數(HW/BW)和左心室指數(LVW/BW)；HE染色觀察心肌病理組織形態學變化；免疫組織化學染色觀察心肌組織ANP、BNP 和β-MHC蛋白表達；采用Real-time PCR檢測心肌ANP、BNP 和β-MHC mRNA表達。結果與對照組比較，3種模型的HW/BW和LVW/BW升高，光鏡下觀察各模型小鼠心肌呈現不同程度的肥厚性變化，ANP、BNP和β-MHC在蛋白和mRNA表達水平均不同程度增加；與AAC組比較，AVF和ISO組心肌組織ANP、BNP和β-MHC在蛋白和mRNA表達水平均降低。結論3種心肌肥厚模型造模成功，AAC模型心肌組織在同時表達肥厚性標志基因ANP、BNP和β-MHC時優于AVF和ISO。

關鍵詞:小鼠；心肌肥厚；心房利尿鈉肽；腦利尿鈉肽；β-肌球蛋白重鏈；模型

近年的分子遺傳學研究發現，至少有60%～70%的肥厚型心肌病為基因突變所致。現已知有19個基因與該病有關，其中胚胎基因心房利尿鈉肽(atrial natriuretic peptide, ANP)、腦利尿鈉肽(brain natriuretic peptide, BNP)、β-肌球蛋白重鏈(β-myosin heavy chain, β-MHC)等的重新表達被認為是心臟肥厚的分子標志，檢測這些基因的表達改變不僅可以肯定心臟肥厚的存在，而且可以判斷肥厚的程度以及預后[1-2]。

目前研究表明，不同心肌肥厚(cardiac hypertrophy,CH )模型間多數心室基因表達譜的變化存在差異，有些基因表達水平改變的方向相同，部分基因表達水平改變方向相反[3]。為了解心肌肥厚標志性基因在不同模型上的表達差異, 本實驗復制了3種常見小鼠心肌肥厚模型：腎上腹主動脈縮窄(renal abdominal aortic coarctation, AAC)模型、動靜脈瘺(arteriovenous fistula, AVF)[4]模型和異丙腎上腺素( isoproterenol, ISO )模型，這3種模型都是經典的且被國內外研究者廣泛認可，但尚未見到不同心肌肥厚模型間肥厚性標志基因(ANP、BNP 和β-MHC)表達差異性相關文獻報道。

本文擬通過比較上述3種基因在mRNA和蛋白水平的差異性，來評價心肌肥厚模型的優劣，為深入探索心肌肥厚疾病的發生發展機制，及相關靶向藥物的篩選研發、應用奠定初步的實驗性理論基礎。

1材料與方法

1.1動物SPF級C57BL/6小鼠,♀♂各半，體質量18～22 g，由安徽省實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(皖)2011-002。

1.2儀器與試劑TP1020型脫水機，萊卡(德國)公司；BX-51型顯微鏡，OLYMPUS。DAB顯色試劑盒，批號：K136621D，北京中杉金橋生物科技有限公司；PV-6000通用型二步法檢測試劑盒，批號：WP133623，北京中杉金橋生物科技有限公司；β-MHC抗體(bs-0259R)，批號：140212，ANP抗體 (bs-2040R)，批號：990398W和BNP抗體(bs-2207R)，批號：980502W，均購自北京博奧森生物技術有限公司。TRIzol 試劑(G&M Gene Technology公司)；引物、反轉錄試劑盒及RT-PCR試劑盒(TaKaRa 公司)。

1.3實驗方法

1.3.1小鼠AAC法小鼠術前禁食 12 h，4%水合氯醛麻醉，于小鼠劍突下沿腹中線切開皮膚及肌肉約1.5 cm。隨后可見腹主動脈和下腔靜脈。在腎動脈上方約 0.3 cm 處的腹主動脈，用 5 mL注射器針頭(0.6 mm)緊貼腹主動脈，平行放置，用 4號手術絲線結扎，抽出針頭縫合創口。術后4周，處死小鼠，取材檢測。

1.3.2小鼠AVF法[4]使用4%水合氯醛生理鹽水溶液，麻醉小鼠，于腹正中切口,將連有1 mL注射器的4號靜脈注射針彎折成135°角，斜向上刺穿腹主動脈，繼續進針，刺穿動靜脈聯合壁，可見有鮮紅色動脈血進入下腔靜脈，迅速在腹主動脈針眼處，均勻涂抹醫用膠，封住針眼，松開血管夾，可見下腔靜脈明顯變紅，觸之有震顫感，證明造瘺成功。于術后2周末，處死小鼠，取材檢測。

1.3.3小鼠ISO法異丙腎上腺素組皮下注射鹽酸異丙腎上腺素1 mg·kg-1，每天2次，間隔8 h，連續14 d。對照組皮下注射相同體積的生理鹽水。末次給藥后24 h取材檢測。

1.3.4心臟重量指數稱取各組小鼠體重(BW)，脫頸處死。稱量心臟重量(HW)，剪去心房及右室，并置于4℃ PBS 緩沖液中清洗，稱量左室重量(LVW)，計算心臟重量指數(HW/BW)和左心室指數(LVW/BW)，留取部分心肌組織用于 HE 和免疫組織化學染色，其余部分立即置于-80℃ 凍存。

1.3.5心肌肥厚標志基因表達水平的測定將凍存的心肌組織放入組織研磨器中，并加入500 μL TRIzol 抽提總RNA。測定RNA純度、濃度后，反轉為cDNA，采用Real-time PCR 檢測。使用Real-time PCR引物，序列如下[5]：引物上、下游序列依次為:ANP:forward:5′-ACAGCCAAGGAGGAAAAGGC-3′,reverse:5′-CCACAGTGGCAATGTGACCA-3′; BNP:forward:5′-TCCAGAGCAATTCAAGATGCA-3′,reverse:5′-CTTTTGTGAGGCCTTGGTCC-3′;β-MHC:forward:5′-GATGTTTTTGTGCCCGATGA-3′,reverse:5′-ACCGT CTTGCCATTCTCCG-3′;GAPDH: forward:5′-TGAAGCAGGCATCTGAGGG-3′,reverse:5′-CGAAGGTGGAA GAGTGGGAG-3′。

2結果

2.1HW/BW和LVW/BW比較對照、AAC、AVF和ISO組小鼠體質量分別為(31.1±3.9) g、(30.4±3.3) g、(29.6±2.9) g和(30.8±3.1) g，之間差異無顯著性。Fig 1結果顯示，與對照組比較，AAC、AVF和ISO組的HW/BW、LVW/BW比值均增大(P<0.05～0.01)；與AAC比較，ISO組HW/BW、LVW/BW比值均下降(P<0.01)，AVF組HW/BW比值下降(P<0.05)。

Fig 1　Changes of HW/BW, LVW/BW in

**P<0.05，**P<0.01vscontrol；#P<0.05，##P<0.01vsAAC

2.2不同心肌肥厚模型小鼠左心室的病理形態學變化Fig 2結果顯示，在低倍鏡下，AAC、AVF和ISO組小鼠心肌可以見到室壁增厚，心室腔狹窄，其中AAC組變化明顯；在高倍鏡下，對照組的心肌細胞是修長而排列整齊，無心肌細胞肥大、壞死，無炎性細胞浸潤和間質纖維化，AAC、AVF和ISO組部分心肌細胞變厚，排列稀疏，心肌細胞肥大，可見間質纖維化。

2.3比較不同心肌肥厚模型小鼠左心室ANP、BNP和β-MHC免疫組織化學染色的變化Fig 3結果顯示，對照組ANP、BNP和β-MHC的組織染色幾乎未見陽性細胞；與對照組比較，AAC、AVF和ISO組ANP、BNP和β-MHC的表達明顯增加；與AAC組比較，AVF和ISO組ANP、BNP和β-MHC表達降低。

2.4不同心肌肥厚模型小鼠左心室ANP、BNP和β-MHC mRNA表達水平Fig 4結果顯示，與對照組比較，AAC和AVF 組ANP、BNP和β-MHC mRNA表達水平增加(P<0.05～0.01)，ISO組BNP mRNA表達水平增加(P<0.05)；與AAC組比較，AVF和ISO組ANP mRNA表達降低(P<0.01)，ISO組BNP、β-MHC mRNA表達降低(P<0.01)。

Fig 2　Histopathological changes of heart in three models

Fig 3　Expression of ANP,BNP and β-MHC in different mouse models(n=6 )

Fig 4　Expression of ANP, BNP and β-MHC mRNA in three CH models (n=6)

3討論

心肌肥厚過程伴隨著復雜的基因表達水平變化，與心肌肥厚表型的發生、發展互為因果，其中ANP、BNP和β-MHC基因在心肌肥厚過程的再表達已經得到公認[2]。ANP主要由心房肌細胞分泌，ANP 基因的表達是所有哺乳動物心肌肥厚的特征，也是臨床上判斷疾病嚴重程度的預測指標[6]。BNP主要在心室合成和分泌，研究表明，血漿中BNP濃度與心室射血分數具有相關性，心室射血分數不足時，大量的血液聚集在心室內，導致心室壓力增大，心室腔擴張，從而引起BNP 合成和釋放[7]。心肌肌球蛋白是心肌肌原纖維的主要成分和收縮蛋白, 主要由一對重鏈(即α-MHC 和β-MHC)和兩對輕鏈組成，通過研究各種因素引起的心肌肥厚發現，在早期常伴有MHC同型異構體轉換，當發生心肌肥厚時，β-MHC mRNA表達則明顯增強，心肌α-MHC向β-MHC發生轉化，所以β-MHC是心肌肥厚的一個重要的標志性基因[8]。因此，同時檢測ANP、BNP和β-MHC基因的表達，對心肌肥厚的判定和預后將有重要的意義。

研究心肌肥厚的機制，離不開動物模型的制備，目前心肌肥厚動物模型的造模方法主要分為3類：①壓力超負荷法。采取主動脈縮窄的方法，心臟后負荷增加，導致心臟做功與耗氧量增加，左心室重構而最終導致心肌肥厚[9]；②容量超負荷法。如動靜脈造瘺法引起動靜脈短路，增加右心室前負荷，形成右心室肥厚[4]；③激素誘導法。目前主要有去甲腎上腺素和甲狀腺素等[10]。研究表明[11]，只有接近臨床肥厚患者實際患病過程的模型，才有更高的研究價值。ISO法不能完全地模擬生理分泌腎上腺素的過程，且劑量過大可能導致動物的死亡，劑量過小則不能成功地建立肥厚模型；AVF法實驗操作相對復雜；AAC法主要是經過緩慢的病理變化模擬心肌肥厚，更接近肥厚疾病的真實病理進程。如在此基礎上能深入地研究心肌肥厚疾病的發生發展機制，可最終為減少和改善心肌肥厚及相關治療藥物的研發和應用奠定科學的理論基礎。本研究結果表明，AAC、AVF和ISO組小鼠心肌可以見到室壁增厚，心室腔狹窄，但AAC組變化明顯。

李平等[3]對以上3種心肌肥厚模型的基因表達譜進行分析研究，結果顯示不同造模方法引起的心肌肥厚，其基因表達譜存在差異。那么這3種模型ANP、BNP和β-MHC基因表達有無差異呢？目前，同時檢測心肌組織ANP、BNP和β-MHC表達的，AAC法造模動物多采用大鼠和基因改造小鼠；AVF法造模多采用大鼠；ISO多用于誘導體外心肌細胞的表達。由于實驗動物品系的差別、實驗條件的不同，通過目前文獻綜述來比較3種模型ANP、BNP和β-MHC表達差異存在諸多困難。本研究表明，AAC法造模小鼠心肌組織在表達ANP、BNP和β-MHC時優于AVF和ISO法，說明不同的造模方法ANP、BNP和β-MHC表達存在一定的差異性。提示采用AAC法制作的小鼠心肌肥厚模型，在心肌肥厚標志性基因的mRNA和蛋白表達水平上，有著更加明顯的優勢。

本文采用的小鼠是研究心血管系統常用品系C57BL/6，李曉梅等[12]通過比較KM小鼠與C57BL/6兩種品系小鼠的主動脈弓縮窄模型發現，雖然兩種品系的小鼠均產生左室肥厚，但是在手術成功率、心衰發生率以及心肌肥厚出現時間等方面均存在差異。那么，采用不同品系小鼠對腎上腹主動脈縮窄法制作心肌肥厚模型的標志性基因表達是否會產生影響呢？本課題組將會進一步研究。

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Comparison of marker gene expression changes in different mouse models of cardiac hypertrophy

KAN Hong-wei1,2, SI Wen-wen3, YIN Yan-yan1, HE Can1, CHENG Jie3,WANG Chun-yan3,ZHANG Qiong-guang4, YANG Yan1

(1.DeptofPharmacology,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China; 2.AnhuiCenterforFoodandDrugEvaluationandCertification,Hefei230051,China; 3.AnhuiProvincialFoodandDrugInspectionInstitute,Hefei230051,China;4.HubeiProvincialFoodandDrugAdministrationfortheTechnicalReviewVerificationCentre,Wuhan430071,China)

Abstract:AimTo explore the differences in hypertrophic marker genes such as atrial natriuretic peptide (ANP), brain natriuretic peptide (BNP) and β-myosin heavy chain (β-MHC) genes in different models of cardiac hypertrophy. MethodsRespectively using renal abdominal aortic coarctation (AAC), arteriovenous fistula (AVF) and isoproterenol (ISO) methods to establish C57BL/6 mouse model of cardiac hypertrophy. After modeling, each mouse’s body weight (BW), heart weight (HW) and left ventricular weight (LVW) were weighed, and the heart weight (HW/BW) and left ventricular index (LVW/BW) were calculated; myocardium by HE staining, pathological morphological changes were observed; myocardium by immunohistochemistry, ANP, BNP and β-MHC protein expression was observed; myocardium by Real-time PCR detection, ANP, BNP and β-MHC mRNA expression was observed. ResultsCompared with control group, HW/BW and LVW/BW were increased in three models. Through the light microscope, each mouse model showed varying degrees of cardiac hypertrophy. ANP, BNP and β-MHC were increased in the protein and mRNA expression. Compared with AAC group, AVF and ISO groups’ myocardial tissue ANP, BNP and β-MHC expression were decreased in the protein and mRNA expression. ConclusionsThree cardiac hypertrophy models are successful. Cardiac tissue ANP, BNP and β-MHC expression in AAC model exceeds AVF and ISO model.

Key words:mice; cardiac hypertrophy; ANP; BNP; β-MHC; model

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1978(2016)02-0274-05

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.02.024

作者簡介：闞紅衛(1977-)，男，碩士，副研究員，研究方向：心血管和腫瘤藥理學，E-mail:hongweikan@163.com；楊雁(1964-)，女，博士，教授，博士生導師，研究方向：抗炎免疫藥理學，通訊作者，E-mail:yangyan@ahmu.edu.cn

基金項目：安徽省自然科學基金資助項目(No 1308085MH144);創新訓練項目(No AH201310366005)

收稿日期：2015-09-24，修回日期：2015-10-26

網絡出版時間：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160125.1557.048.html

網絡出版地址：2016-1-25 15:57