復方總黃酮對小鼠慢性酒精性睪丸損傷的作用研究

查文良,柯志強,高　卉,白育庭

(湖北科技學院1.糖尿病心腦血管病變湖北省重點實驗室、2.臨床醫學院，湖北 咸寧　437100)

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復方總黃酮對小鼠慢性酒精性睪丸損傷的作用研究

查文良1,2,柯志強1,高卉2,白育庭2

(湖北科技學院1.糖尿病心腦血管病變湖北省重點實驗室、2.臨床醫學院，湖北 咸寧437100)

中國圖書分類號：R-332；R284.1；R322.64；R697.2

摘要:目的探討復方總黃酮對慢性酒精睪丸損傷小鼠的保護作用。方法100只SPF級C57BL/6小鼠隨機分為5組：正常對照組、慢性酒精組、酒精+低劑量藥物組、酒精+高劑量藥物組、藥物對照組，每組20只。采用酒精濃度遞增梯度法建立小鼠慢性酒精睪丸損傷模型，同時用復方總黃酮進行干預治療，連續6個月，測定睪丸組織中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)以及睪酮含量。HE染色觀察組織形態學變化，電鏡觀察其超微結構改變。結果慢性酒精組小鼠睪丸組織中MDA含量明顯升高，SOD活力以及睪酮含量下降，與正常對照組比較差異有顯著性(P<0.05)；此外，睪丸生精上皮結構破壞，支持細胞和各級生精細胞均有退化變性，復方總黃酮可呈劑量依賴性地逆轉上述改變。結論復方總黃酮對慢性酒精睪丸損傷小鼠的保護作用可能與其抑制脂質過氧化和提高睪酮活性密切相關。

關鍵詞：復方總黃酮；酒精；睪丸；睪酮；精子發生；氧化損傷

不育癥是影響男女雙方家庭的全球性問題，據估計我國的不育癥發病率約在10%左右，其中男性所導致的不育者不少于不育夫婦的50%。大量的動物實驗和臨床研究表明，長期飲酒可以改變睪酮分泌以及精子發生，從而導致不育[1-3]。迄今為止，乙醇引起睪丸功能障礙的具體機制尚未闡明，但酒精代謝過程中產生的自由基以及引起的氧化反應已得到多數學者的認可。復方總黃酮由本實驗室自行提制，主要成分是葛花和枳棋子，經體外實驗證明其有良好抗氧化效果。本文擬通過制備慢性酒精睪丸損傷小鼠模型，探討復方總黃酮對其的保護作用及其可能的作用機制，為探討慢性酒精所致男性不育的發病機制及尋求有效的治療藥物提供理論依據。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物SPF級♂ C57BL/6小鼠，由武漢大學動物實驗中心提供，動物許可證號：SCXK(鄂)2008-0004。小鼠適應性喂養在恒溫(23±2) ℃、濕度50%～60%、人工照明明暗各12 h的飼養室內，標準飼料和自來水自行取用。

1.1.2藥品與試劑復方總黃酮(主要成分葛花、枳棋子等，由本實驗室自行提煉)；紅星二鍋頭白酒(60%,北京紅星股份有限公司)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒購自南京建成生物研究所；小鼠睪酮酶聯免疫檢測試劑盒購自北京北方生物技術研究所；其他均為市售分析純。

1.1.3主要儀器低溫超速離心機(Scan Speed公司)，分析天平(Sartorius公司)，多功能酶標儀(美國Bio-Tek公司)，顯微鏡(OLYMPUS公司)。

1.2方法

1.2.1實驗分組及給藥方法100只SPF級C57BL/6 ♂小鼠隨機分為5組，分別為：① 正常對照組：以蒸餾水為飲水源；② 慢性酒精組：以白酒為唯一飲水源。給予酒精濃度分別為10% (第1～4周)、14% (第5～8周)、18%(第8～12周)、22%(第13周～6個月) 的紅星二鍋頭酒；③ 酒精+低劑量藥物組：慢性酒精攝入小鼠給予10 g·kg-1·d-1復方總黃酮進行灌胃；④ 酒精+高劑量藥物組：慢性酒精攝入小鼠給予20 g·kg-1·d-1復方總黃酮進行灌胃；⑤ 藥物對照組：正常小鼠給予20 g·kg-1·d-1復方總黃酮進行灌胃。

1.2.2指標測定

1.2.2.1生化測定采用ELISA試劑盒測定睪丸組織中睪酮含量，生化檢測試劑盒測定睪丸組織中蛋白含量、SOD活力和MDA含量。

1.2.2.2病理學檢測取睪丸部分組織，用4%多聚甲醛固定24 h，常規石蠟包埋切片，HE染色，光鏡下觀察睪丸的形態結構。

1.2.2.3超微結構檢測取米粒大小睪丸組織，2.5%戊二醛和1%餓酸雙重固定，丙酮脫水，Epon812包埋，鉛鈾染色，透射電鏡觀察。

2結果

2.1睪丸組織中生化指標以及睪酮的變化Tab 1結果顯示，慢性酒精組SOD活力明顯降低，而MDA含量明顯升高，與正常對照組比較差異具有統計學意義(P<0.05)；此外，睪丸組織中睪酮的含量也出現明顯下降(P<0.05)，而復方總黃酮可升高SOD活力和睪酮含量，同時降低MDA含量，具有良好的劑量依賴性(P<0.05)。

Tab 1　Effect of compound flavones on SOD activity,

**P<0.05vsnormal control；#P<0.05vschronic alcohol

2.2睪丸組織學改變正常對照組小鼠睪丸組織中生精細胞與支持細胞在管腔內有序排列，且精原細胞規則地緊貼于生精小管的基膜，向內依次為初級精母細胞、精子細胞、精子；慢性酒精組可見生精上皮有不同程度的損傷，生精周期分期不清，精子發生多停止在初級精母細胞或精子細胞階段，管腔內無精子，可見大量生精細胞脫落；睪丸間質細胞變性、壞死，數量減少；復方總黃酮治療組生精小管損傷程度明顯輕于慢性酒精組，尤其是大劑量治療組生精小管結構接近正常，見Fig 1。

2.3睪丸超微結構改變正常對照組生精小管固有膜結構完整，睪丸生精上皮內處于不同周期的生精細胞有序排列，支持細胞結構正常，生精細胞胞間橋和支持細胞連接復合體完整，線粒體豐富。慢性酒精組可見細胞內溶酶體增加，支持細胞滑面內質網出現變性退化，胞質空泡樣變常見，支持細胞間連接復合體斷裂，生精上皮排列紊亂。而復方總黃酮治療組睪丸損傷明顯減輕，尤其是大劑量治療組生精上皮超微結構接近正常，見Fig 2。

3討論

早在1997年Villalta等[4]對無癥狀慢性酒精中毒男性的精液進行分析，發現長期酗酒男性精子數量減少、精子活動率下降以及精子畸形增多。此后Muthusami等[5]進一步研究發現，慢性飲酒將影響男子激素水平和精子質量，嚴重者可致不育。這些研究結果表明酒精可明顯影響精子的質量和數量，而決定精子質量改變的獨立因素是乙醇的攝入量。

氧化應激在酒精所致的睪丸損傷中扮演著重要角色。酒精及其代謝物乙醛可以在體內產生自由基，自由基易攻擊細胞膜上的不飽和脂肪酸，從而誘發脂質過氧化，睪丸中的線粒體膜和精子均富含不飽和脂肪酸，容易受過氧化攻擊產生活性氧，進而影響精子功能[6]。SOD作為體內抗氧化的主要酶之一，MDA作為脂質過氧化反應的終產物，可反映組織細胞膜損傷受自由基攻擊的程度。本實驗結果表明，慢性酒精攝入小鼠與正常對照組比較MDA明顯升高，而SOD活力下降，提示睪丸清除氧自由基能力下降，氧化損傷發生。研究發現，具有抗氧化活性的藥物如門冬氨酸鳥氨酸[7]、杏子[8]等均可通過提高抗氧化酶如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶的活性，而有效防止乙醇誘導的大鼠睪丸損傷。

Fig 1　Influence of compound flavones on testicular histomorphology in chronic alcohol mice

Fig 2　Influence of compound flavones on ultrastructure changes in chronic alcohol mice

睪丸的功能除生成精子外，還有一種重要的功能就是合成并分泌雄激素(主要是睪酮)。睪酮由睪丸間質細胞分泌，睪丸組織內睪酮濃度遠高于外周血清睪酮濃度，其濃度變化比后者能更好地反映睪丸的睪酮合成功能，而且睪丸組織內睪酮直接參與精子發生[9]。本實驗結果顯示，慢性酒精攝入小鼠睪丸中睪酮水平明顯低于正常對照組，表明其睪酮合成明顯減少，提示慢性乙醇中毒可能對睪丸功能有一定的損害。

葛花作為傳統的解酒藥物，我們前期研究發現，葛花提取物可通過抑制氧化應激水平從而對糖尿病心肌病產生保護作用[10]。王金鳳等[11]研究發現，葛花總黃酮通過其抗氧化作用以及下調心肌β-ARK1mRNA的表達，抑制小鼠急性心肌缺血損傷。此外，復方枳棋子制劑可通過增加小鼠肝組織中乙醇代謝酶活性，從而產生較好的解酒及中樞保護作用[12]。本實驗室通過在葛花提取物的基礎上加入枳棋子解酒成分，旨在提高復方總黃酮的抗氧化和解酒作用。本研究結果顯示，復方總黃酮不僅可減輕慢性酒精攝入小鼠睪丸生精小管的損傷，同時可提高抗氧化能力以及睪酮的合成。

綜上所述，酒精作為睪丸的一種毒物，可使睪丸生精小管損傷，生精細胞退化，并使睪丸間質細胞變性、壞死，睪酮合成減少。復方總黃酮通過抑制氧化應激水平、提高睪丸中睪酮含量，從而對慢性酒精所致的小鼠睪丸損傷具有保護作用。

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Protective effects of compound flavones against alcohol-induced testicular injury in mice

ZHA Wen-liang1,2，KE Zhi-qiang1，GAO Hui2，BAI Yu-ting2

(1.HubeiProvinceKeyLaboratoryonCardiovascular,CerebrovascularandMetabolicDisorders,HubeiUniversityofScienceandTechnology,2ClinicalMedicalCollege,HubeiUniversityofScienceandTechnology,XianningHubei437100,China)

Abstract :AimTo study the protective effect of the compound flavones on chronic alcohol induced testicular damage in mice.MethodsOne hundred SPF C57BL/6 mice were randomly divided into 5 groups: normal control group, chronic alcohol group, alcohol+low-dose drug group, alcohol+high dose drug group, and drug control group. Chronic alcohol testicular injury model in mice was established by intragastric administration of increasing dose of alcohol every four weeks for 6 months, meanwhile compound flavone intervention was in process. The activity of super oxide dismutase(SOD), the levels of malondialdehyde(MDA)and testosterone in testicular tissue were measured. HE staining was used to observe testicular histomorphology, and ultrastructure changes were detected by electron microscope. ResultsIn chronic alcohol group, MDA content was obviously increased, while SOD and testosterone levels were decreased compared with normal control group(P<0.05). In addition, germinal epithelium, support cells and sperm production at all levels showed degraded degeneration in chronic alcohol group. However, compound flavonoids could successfully reverse alcohol-induced testicular damage in a dose-dependent way.ConclusionThe compound of flavones may have therapeutic potential for alcohol-induced testicular injury through inhibiting lipid peroxidation and increasing the level of testosterone.

Key words:compound flavones; alcohol; testes; testosterone; spermatogenesis; oxidative damage

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1978(2016)02-0285-04

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.02.026

作者簡介：查文良(1980-)，男，博士，副教授，研究方向：男科學,通訊作者，E-mail：xyzwl800@163.com

基金項目：湖北省教育廳青年項目(No Q20152803)；湖北科技學院科研項目(No zx1205)

收稿日期:2015-11-12,修回日期:2015-12-08

網絡出版時間：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160125.1557.052.html

網絡出版地址：2016-1-25 15:57

◇復方藥物藥理學◇