藏藥二十五味驢血丸對痹癥(類風濕關節炎)大鼠的治療作用及其機理探討

胡華剛，陶 黎，吳佳瑩，趙宏艷，肖 璇，李岳澤，劉梅潔，汪文來，徐斯凡，潘靜華，何 堅，鞠大宏△

(1.中國中醫科學院博士后科研流動站，北京 100700;2.中國中醫科學院中醫基礎理論研究所，北京 100700;3.中國醫學科學院北京協和醫學院藥用植物研究所，北京 100193;4.中央民族大學中國少數民族傳統醫學研究院，北京 100081;5.福建中醫藥大學康復醫學院，福州 350108)

藏藥二十五味驢血丸對痹癥(類風濕關節炎)大鼠的治療作用及其機理探討

胡華剛1，2，陶 黎2，吳佳瑩2，趙宏艷2，肖 璇3，李岳澤2，劉梅潔2，汪文來2，徐斯凡4，潘靜華2，何 堅5△，鞠大宏1，2△

(1.中國中醫科學院博士后科研流動站，北京 100700;2.中國中醫科學院中醫基礎理論研究所，北京 100700;3.中國醫學科學院北京協和醫學院藥用植物研究所，北京 100193;4.中央民族大學中國少數民族傳統醫學研究院，北京 100081;5.福建中醫藥大學康復醫學院，福州 350108)

目的:探討藏藥二十五味驢血丸對膠原誘導性關節炎大鼠的治療作用及其機制。方法:選用雌性SD大鼠60只，按隨機數字表法分為空白對照組和造模組，再將造模成功的大鼠隨機分為CIA模型組、甲氨蝶呤組、二十五味驢血丸低、中、高劑量組，連續給藥4周。結果:與模型組比較，二十五味驢血丸使CIA大鼠的AI評分和腫脹肢體的腳掌厚度顯著降低，并可使CIA大鼠血清中IL-17A的含量顯著降低，使TGF-β1含量顯著升高。結論:二十五味驢血丸對膠原誘導的大鼠關節炎具有顯著的治療效果，其可能通過調控Th17/Treg細胞平衡從而達到治療類風濕關節炎的作用。

二十五味驢血丸;干黃水;類風濕關節炎;Th17/Treg平衡

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以關節滑膜炎為特征且逐漸導致軟骨及骨關節進行性破壞和不可逆性殘疾的自身免疫性疾病，并伴有并發癥，極大地影響了患者的生命質量［1］。

藏醫對類風濕關節炎有系統而深入的認識，《四部醫典》就將該類疾病單列成章節加以詳細論述。二十五味驢血丸(，藏文名:珍才尼埃日布)是具有國家批準文號的藏醫經典方劑，始載于《四部醫典》，是藏醫用于治療RA的主要藥物［2］。雖然二十五味驢血丸具有顯著的臨床療效［3-5］，但目前尚未見到有關其作用機制方面的研究報道。本文以II型膠原誘導的關節炎(collageninduced arthritis，CIA)大鼠作為RA模型，研究二十五味驢血丸對類風濕關節炎的治療作用，并初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選用6周齡SPF級SD雄性大鼠60只，由軍事醫學科學院實驗動物中心提供(動物許可證號SCXK(軍)2012-0004)，飼養于中央民族大學動物實驗室。

1.1.2 主要試劑與儀器 主要試劑:牛II型膠原(貨號20022，批號150394);不完全弗氏佐劑(貨號7002，批號150057);美國 Chondrex公司產品;戊巴比妥鈉(批號P3761);Sigma公司;大鼠白細胞介素(IL)-17A ELISA試劑盒(貨號BMS635，批號118323013);美國affymetrix公司;大鼠轉化生長因子(TGF)-β1ELISA試劑盒(貨號CSB-E04727r，批號T02039922);武漢華美生物工程有限公司;二十五味驢血丸(批號1506114);青海省格拉丹東藥業有限公司;甲氨蝶呤(批號150701);通化茂祥制藥有限公司。主要儀器:粉碎機，北京中西遠大科技有限公司;單反相機，日本佳能公司;200目鋼篩，上虞市建化儀器廠;數顯游標卡尺，上海工具廠有限公司;Multiskan Mk3酶標儀、Well wash 4 Mk2洗板機，美國Thermo公司;K15離心機，德國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及處理［6］適應性喂養1周后隨機選取8只作為空白對照組，其余的大鼠用尾根部皮下注射II型膠原與不完全弗氏佐劑混合物的方法誘導出類風濕關節炎大鼠模型(CIA模型)，空白對照組不做任何處理。

第2次免疫7 d后，根據關節炎指數(arthritis index，AI)評分標準對關節炎的嚴重程度進行0～4級別評分。將單個肢體AI評分大于2分的大鼠按隨機數字表法分為CIA模型組、陽性藥組、二十五味驢血丸低、中、高劑量組各8只。

將二十五味驢血丸粉碎后過200目篩，制成混懸液。按照《藥理實驗方法學》第四版中的換算公式，將人的劑量換算成大鼠的劑量。二十五味驢血丸低、中、高劑量分別是150、300、600 mg/kg，每天灌胃1次，連續4周。陽性藥為甲氨蝶呤(3 mg/(kg ·week))，空白對照組和模型組給等體積雙蒸水。

1.2.2 取材 給藥4周后戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈取血，2500 r/min離心，20 min后取血清，分裝后－80℃保存。

1.2.3 指標的檢測 ①給藥后每隔3 d進行AI評分［7］。0分:正常;1分:1個或多個趾關節紅或紅腫;2分:踝關節以下中度紅腫;3分:包括膝關節在內的嚴重紅腫;4分:包括膝關節在內的完全紅腫，關節變形、殘廢;②給藥后每隔6 d用數顯游標卡尺測量各組大鼠腫脹肢體腳掌厚度的同時測量大鼠體質量;③按試劑盒說明測定血清 IL-17A和TGF-β1含量。

1.2.4 統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件進行統計分析，以均數±標準差(±s)表示，若數據為正態分布時釆用單因素方差分析，方差齊性時組間兩兩比較，采用LSD檢驗;若方差不齊則用其項下Tamhane’s T2(M)進行檢測;若數據為非正態分布時，采用非參數檢驗Kruskal-Wallis單因素ANOVA(k樣本)(W)，組間兩兩比較采用Stepwise step-down檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 二十五味驢血丸對CIA大鼠AI評分影響

表1圖1顯示，與CIA模型組比較，給藥第4天，二十五味驢血丸高劑量組大鼠的AI評分顯著降低(P＜0.05);給藥8 d后，二十五味驢血丸使類風濕關節炎大鼠的AI評分顯著降低(P＜0.01)，甲氨蝶呤組和二十五味驢血丸給藥組之間比較差異無統計學意義。

表1 二十五味驢血丸對CIA大鼠AI評分的影響(±s)

表1 二十五味驢血丸對CIA大鼠AI評分的影響(±s)

注:與模型組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組 別 鼠數 給藥前 給藥4 d 給藥8 d 給藥12 d 給藥16 d 給藥20 d 給藥24 d 給藥28 d空白對照組80 0 0 0 0 0 0 0模 型 組 8 3.67±0.35 3.61±0.24 3.54±0.39 3.40±0.39 3.30±0.26 3.25±0.35 3.08±0.49 3.00±0.33甲氨蝶呤組 8 3.64±0.38 3.14±0.38 2.69±0.37＊＊2.38±0.23＊＊2.25±0.27＊＊2.21±0.39＊＊2.05±0.28＊＊2.00±0.32＊＊低劑 量 組 8 3.65±0.34 3.45±0.37 3.00±0.27＊＊2.59±0.20＊＊2.50±0.27＊＊2.44±0.32＊＊2.33±0.25＊＊2.21±0.27＊＊中劑 量 組 8 3.63±0.35 3.32±0.41 2.83±0.35＊＊2.50±0.33＊＊2.39±0.33＊＊2.33±0.35＊＊2.14±0.24＊＊2.11±0.22＊＊高劑 量 組 8 3.69±0.26 3.07±0.19* 2.81±0.26＊＊2.42±0.20＊＊2.33±0.26＊＊2.25±0.27＊＊2.11±0.29＊＊2.04±0.27＊＊

2.2 二十五味驢血丸對CIA大鼠腫脹肢體腳掌厚度的影響

表2顯示，與空白對照組比較，模型組大鼠腫脹肢體的腳掌厚度顯著增加(P＜0.01)。給藥2周后與模型組比較，二十五味驢血丸可使CIA大鼠腫脹肢體的腳掌厚度顯著降低(P＜0.01)，甲氨蝶呤組和二十五味驢血丸給藥組之間比較差異無統計學意義。給藥3周后，二十五味驢血丸低、中、高劑量組大鼠腫脹肢體的腳掌厚度與空白對照組比較差異無統計學意義。

2.3 二十五味驢血丸對CIA大鼠體質量的影響

表3顯示，與空白對照組比較，CIA大鼠的體質量均顯著降低。給藥4周后，甲氨蝶呤組大鼠體質量顯著高于模型組大鼠(P＜0.05)，二十五味驢血丸的中、高劑量組大鼠體質量顯著高于模型組(P＜0.01)，二十五味驢血丸給藥組和陽性藥組比較差異無統計學意義。

表2 二十五味驢血丸對CIA大鼠腫脹肢體腳掌厚度的影響(±s)

表2 二十五味驢血丸對CIA大鼠腫脹肢體腳掌厚度的影響(±s)

注:與空白對照組比較:#P＜0.05，##P＜0.01;與模型組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 鼠數 給藥前 給藥1周 給藥2周 給藥3周 給藥4周空 白 對 照 組 8 6.09±0.86 6.53±0.59 6.64±0.43 6.79±0.48 6.86±0.54模 型 組 8 8.49±1.10## 9.31±1.40## 9.23±0.86## 8.89±1.12## 8.41±0.71##甲 氨 蝶 呤 組 8 8.41±1.06## 8.56±1.01## 7.50±0.53#＊＊ 7.32±0.79＊＊ 7.11±0.36＊＊低 劑 量 組 8 8.32±0.68## 9.06±1.09## 8.19±0.52##＊＊ 7.39±0.42＊＊ 7.20±0.42＊＊中 劑 量 組 8 8.57±0.72## 8.67±0.49## 7.80±0.34##＊＊ 7.28±0.40＊＊ 7.12±0.77＊＊高 劑 量 組 8 8.32±0.66## 8.58±1.07## 7.66±0.64##＊＊ 7.21±0.64＊＊ 7.07±0.53＊＊

表3 二十五味驢血丸對大鼠體質量的影響(±s)

表3 二十五味驢血丸對大鼠體質量的影響(±s)

注:與空白對照組比較:#P＜0.05，##P＜0.01;與模型組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 例數 給藥前 給藥1周 給藥2周 給藥3周 給藥4周空 白 對 照 組 8 335.82±12.87 374.81±20.13 425.33±18.48 447.10±15.37 462.55±21.17模 型 組 8 283.21±14.48## 307.74±14.64## 331.06±13.31## 363.89±14.01## 363.82± 9.58##甲 氨 蝶 呤 組 8 283.88±29.18## 311.01±39.74## 353.26±25.20## 377.99±16.00## 387.78±12.51##*低 劑 量 組 8 284.81±25.28## 306.09±31.66## 349.54±23.87## 375.47±22.55## 383.48±18.17##中 劑 量 組 8 283.18±19.62## 310.24±17.96## 355.16±14.30## 380.46±10.43## 394.31± 8.84##＊＊高 劑 量 組 8 283.88±23.50## 313.02±22.22## 360.85±19.83## 381.38±18.51## 401.32±15.49##＊＊

圖1 末次給藥前各組大鼠AI評分觀察

2.4 二十五味驢血丸對CIA大鼠血清中IL-17A和TGF-β1水平的影響

表4顯示，與空白對照組比較，模型組大鼠血清中IL-17A水平顯著升高，TGF-β1水平顯著降低(P＜0.01)。與模型組比較，二十五味驢血丸可使CIA大鼠血清中IL-17A含量顯著降低的同時，血清中TGF-β1的含量顯著升高(P＜0.05)。

表4 二十五味驢血丸對CIA大鼠血清中IL-17A和TGF-β1水平的影響(±s)

表4 二十五味驢血丸對CIA大鼠血清中IL-17A和TGF-β1水平的影響(±s)

注:與空白對照組比較:#P＜0.05，##P＜0.01;與模型組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 例數 IL-17A的含量(pg/ml) TGF-β1的含量(ng/ml)空白對照組8 0.52±0.04 34.15±2.88模 型 組 8 1.09±0.11## 27.96±3.69##甲氨蝶呤組 8 0.58±0.11＊＊ 35.91±3.99*低 劑 量 組 8 0.65±0.09* 37.11±3.34*中 劑 量 組 8 0.58±0.09＊＊ 37.45±3.65＊＊高 劑 量 組 8 0.52±0.07＊＊ 37.52±3.41＊＊

3 討論

RA屬于藏醫“真布”病，是藏醫臨床常見病［3］。藏醫認為［8-10］，若人久居或勞作于寒濕之地，長期過量進食油脂之物，或精神壓抑或生活不規律等因素，導致人體三大因素(龍、赤巴、培根)失衡，進而使精華不化、清濁不分，飲食精微未在本位成熟而變成“黃水”，致使“黃水”激增。“黃水”擴散至骨關節、肌肉和筋絡后腐蝕關節、肌肉、骨骼和筋脈，從而導致RA的發生。藏醫對RA的治療以“干黃水”為主，同時調節“三大因素”的平衡［8］。“干涸黃水”是藏醫治療RA的方法論，而二十五味驢血丸是藏醫“干黃水”用于治療RA的主要藥物。CIA大鼠模型是經典的評價實驗藥物抗炎和免疫抑制作用的動物模型［11］。本實驗研究結果表明，二十五味驢血丸不但對類風濕關節炎大鼠具有顯著的治療作用，還能增加CIA大鼠的飲食，這與藏醫臨床研究的結果相符。

現代醫學研究表明，Th17/Treg細胞失衡在RA的發病機制中扮演著非常重要的角色［12-14］。Th17細胞是近年發現的一類新型CD4+T細胞亞群，能特異性高水平地分泌白細胞介素-17A(interleukin-17A，IL-17A)。IL-17A可刺激滑膜細胞表達IL-6/ IL-8，這些因子能募集中性粒細胞、未成熟的樹突狀細胞、T細胞在關節滑液中聚集，擴大炎癥反應［15-16］，還可刺激滑膜細胞分泌多種血管因子促進血管翳的形成［17］。IL-17A作用于骨髓基質細胞，使其大量表達核因子κB受體活化因子配體(RANKL )，RANKL與破骨細胞的前體細胞和破骨細胞表面受體結合，促進破骨細胞的分化、成熟，加快骨吸收［18］。Treg細胞是具有免疫抑制作用、維持免疫耐受自然發生的專職免疫調節細胞，能控制免疫應答強度，減輕對機體組織損傷［19］。Treg細胞分泌的轉化生長因子-β1(TGF-β1)在誘導初始T細胞分化為成熟Treg細胞的同時，還能抑制免疫效應細胞的增殖和分化，抑制細胞因子的產生及其免疫調節作用［20］。

CIA大鼠體內存在Th17/Treg細胞分化失衡，Th17細胞數量顯著大于Treg細胞的數量［21］。本實驗研究發現，二十五味驢血丸和甲氨蝶呤皆可使CIA大鼠血清中IL-17A的含量顯著降低，TGF-β1的含量顯著升高。孫夢怡等［22］研究發現，甲氨蝶呤可以有效降低小鼠關節炎的發病率及平均關節炎指數。流式細胞術檢測顯示，甲氨蝶呤組Th17細胞比例顯著降低，Treg細胞比例顯著增加。本實驗研究結果與此具有一致性，表明二十五味驢血丸可能通過調節Th17/Treg細胞的平衡從而達到治療類風濕關節炎的作用，但二十五味驢血丸治療類風濕關節炎的具體機制尚需進一步研究。

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Discussion of Treating Effects and Its Mechanism of Tibetan Medicine Twenty-five Flavor Lvxue Pills to Bi Syndrome(Rheumatoid Arthritis)

HU Hua-gang1，2，TAO Li2，WU Jia-ying2，ZHAO Hong-yan2，XIAO Xuan3，LI Yue-ze2，LIU Mei-jie2，WANG Wen-lai2，XU Si-fan4，PAN Jing-hua2，HE Jian5△，JU Da-hong1，2△
(1.Postdoctoral Research Station，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China;2.Institute of Basic Theory for Chinese medicine，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China;3.The Institute of Medicinal Plant Development，Peking Union Medical College，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 10193，China; 4.Institute of Chinese Minority Traditional Medicine，Minzu University of China，Beijing 100081，China;5.Fuzhou of Fujian University of Traditional Chinese Medicine and Rehabilitation Medicine，350108，China)

Objective:To explore the therapeutic effect and mechanism of tibetan compound prescription of Ershiwuwei lvxue pills on Collagen-Induced Arthritis(CIA)rats.Method:Eight rats were randomly selected as blank control group from sixty SD female rats which were six weeks old，and other rats as Rheumatoid arthritis model group.The successful model rats were randomly devided into CIA group，positive drug(MTX)group，low dose ershiwuwei lvxue pills group，medium dose ershiwuwei lvxue pills group and high dose ershiwuwei lvxue pills group.Every group was eight rats.The blank control group and the CIA model group were fed with equal volume of double distilled water for four weeks.The contents of IL-17A and TGF-β1 in serum were measured by ELISA after the rats were killed.Result:Compared with CIA group，the AI scores and paw thickness of the Ershiwuwei lvxue pills groups obviously decreased.Compared with CIA group，the level of IL-17A in serum of ershiwuwei lvxue pills groups decreased obviously while the level of TGF-β1 increased evidently.Conclusion:Ershiwuwei lvxue pills has a obviously therapeutic effect on CIA rats and may play the role of the treatment of RA through regulating the balance of Th17/Treg cells.

ershiwuwei lvxue pills;Dry yellow water;Rheumatoid Arthritis;Th17/Treg balance

R593.22

:B

:1006-3250(2016)08-1053-04

2015-12-16

胡華剛(1983-)，男，山東濟寧人，醫學博士后，從事傳統醫藥治療痹癥的基礎研究。

△通訊作者:何 堅，男，副教授，從事骨關節疾病的中醫康復研究，Tel:18960818819;鞠大宏(1963-)，男，遼寧鳳城人，研究員，醫學博士，從事中醫防治痹癥(類風濕關節炎和骨質疏松癥)的臨床與基礎研究，Tel:010-64089025，E-mail: judahong@sohu.com。