基于正交設計的不同針刺因素對腎陽虛大鼠HPG軸影響的實驗研究*

閔志云，程立紅，閔友江△，丁李立強，張 輝，裴 佳

(1.江西中醫(yī)藥大學，南昌 330006;2.江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，南昌 330006)

基于正交設計的不同針刺因素對腎陽虛大鼠HPG軸影響的實驗研究*

閔志云1，程立紅2，閔友江2△，丁李立強1，張 輝1，裴 佳1

(1.江西中醫(yī)藥大學，南昌 330006;2.江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，南昌 330006)

目的:以皮質酮腎陽虛動物模型為研究對象，采用正交設計研究多個針刺參數(shù)，探索影響針刺療效的主次因素和針刺參數(shù)的最佳組合。方法:采用L9(34)正交表對4個參數(shù)(穴位、捻針角度、頻率、時間)3水平安排試驗，運用計算機控制針刺手法儀進行干預，通過ELISA檢測血清T、垂體LH的水平和RT-PCR檢測下丘腦中GnRH mRNA的表達，以比較上述4個參數(shù)的主次及每一參數(shù)不同水平的優(yōu)劣。結果:對針刺療效的影響由大到小依次為穴位、捻針角度、時間、頻率，其中穴位是影響針刺療效的主要因素，而捻針角度、頻率、時間都是次要因素。結論:針刺治療腎陽虛大鼠的最佳參數(shù)為A3B3C2D2，即針刺腎俞、捻針90°、頻率120次/min、捻針60 s;本研究中穴位的選擇對療效的影響最大，其次為捻針角度，再次是捻針時間，影響最小的為捻針頻率。

正交設計;腎陽虛;T;LH;GnRH

針灸通過扶正祛邪、疏通經(jīng)絡、調和陰陽作用治療疾病，其扶正祛邪的作用又是通過針灸補虛與瀉實的效應來達到。大多學者認為，針灸補虛瀉實效應和補瀉手法、穴位具有相對特異性與機體的狀態(tài)、刺激量大小等因素有關［1-4］。而刺激量的大小又與針刺強度(提插捻轉頻率、捻轉角度、提插幅度、針具粗細、針刺深淺)和針刺時間(行針時間、留針時間、針刺次數(shù)或療程、針刺間隔時間)相關［3］。但對于針刺補瀉效應與刺激量、穴位具有相對特異性是否相關，針刺刺激量如何做到定量，影響針刺療效的主次因素，能否獲取最佳針刺療效等多個因素最佳組合等問題目前研究［5-7］還有不足之處。筆者為進一步科學、客觀、定量研究針刺療效與不同針刺因素的關系，故在實驗性腎陽虛大鼠模型的基礎上，采用L9(34)正交表對影響針刺療效的4因素(穴位、捻針頻率、捻針角度、捻針時間)與3水平安排試驗，通過采用計算機控制針刺手法儀對皮質酮腎陽虛大鼠進行針刺療效影響因素定性定量化實驗研究，現(xiàn)闡述如下。

1 材料

1.1 動物

52只清潔級雄性SD大鼠，體質量200～240 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供(合格證號SCXK(湘)2011-0003)，標準配方桿狀飼料喂養(yǎng)，自由放水。所有大鼠適應性飼養(yǎng)3 d后開始實驗，根據(jù)《實驗針灸學》［8］進行定穴并剪去穴位處毛發(fā)。

1.2 試劑與儀器

氫化可的松注射液(5 ml/25 mg)，天津金耀氨基酸有限公司(批準文號國藥準字 H12020886); Trizol，invitrogen公司;T、LH酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，上海博谷生物科技有限公司;RNaseⅠ，F(xiàn)ermentas公司;SYBR Green PCR試劑盒、逆轉錄試劑盒，Thermo公司。華佗牌一次性針灸針(30號0.5寸)，蘇州醫(yī)療器械廠;移液器，吉爾森P型移液器(Pipetman);酶標儀，芬蘭(Labsystems Multiskan MS)公司;低溫冷凍離心機，Sigma(3K15)公司;針刺手法儀(申請(專利)號 CN200510027586.1，公開(公告)號CN1709215)，上海中醫(yī)藥大學研制;Real-time檢測儀，ABI(ABI-7300)公司。

2 方法

2.1 實驗干預因素設計

表1顯示，因素A(針刺穴位選擇):根據(jù)前期工作基礎，選擇腎俞穴治療腎陽虛證大鼠;選擇前三里作為對照穴位之一;非穴區(qū)擬選擇前三里旁開5 mm處非穴點作為對照穴位之一。

表1 實驗干預因素具體設計方案

表2顯示，影響針刺療效的因素有針刺穴位、捻針角度、捻針頻率、捻針時間。本實驗在皮質酮腎陽虛大鼠模型的基礎上對上述4因素3水平采用正交表安排試驗。查統(tǒng)計表選擇L9(34)正交設計表安排實驗。

2.2 造模、分組和治療方法

2.2.1 分組和造模 52只SD雄性大鼠飼養(yǎng)3 d后按隨機數(shù)字表法分為2組，正常對照組8例，實驗造模組44只。造模方法:每只大鼠按0.03 mg/ (g·bw)劑量肌注氫化可的松，每日1次，連續(xù)肌注10 d。腎陽虛大鼠造模成功后，隨機分成10組，其中9組為針刺實驗組4例，最后1組為模型組8例。

2.2.2 治療方法 治療組大鼠用自制固定器捆綁固定，0.5寸30號毫針刺入穴位5～7 mm，進針后稍提插捻轉再與針刺手法儀連接，按相應干預因素進行針刺手法操作，留針10 min，再手法操作1次，再留針10 min后出針，共治療14 d。正常組與模型組大鼠用相同方式固定20 min，不進行針刺操作。

表2 針刺實驗組9個亞組實驗安排

2.3 指標檢測及方法

2.3.1 標本采集 治療結束第2天處死大鼠。抽取動脈血離心取上清液分裝，－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩囝^、咬骨鉗去顱骨分離垂體和下丘腦組織，液氮中速凍，－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2 血清T(睪酮)、垂體LH(促黃體生成素)檢測 采用ELISA方法測量其濃度，按照試劑盒說明書進行操作。

2.3.3 下丘腦GnRH(促性腺激素釋放激素) mRNA表達檢測 采用RT-PCR方法檢測，組織總RNA的抽提按Trizol說明書操作。總RNA中DNA的消除、反轉錄、Real-time PCR擴增、相對mRNA表達水平的計算等操作及方法參考文獻［8］，引物的合成與純化均由上海捷瑞生物科技有限公司提供。GnRH上游引物序列:5'-CGCTGTTGTTCTGTTGAC T-3'，下游引物序列:5'-CTCCTCCTTGCCCATCTC-3'。GAPDH上游引物序列:5'-GCAAGTTCAACG GCACAG-3'，下游引物序列:5'-GCCAGTAGACTCCA CGACAT-3'。

2.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 一般情況觀察

造模大鼠體質量減輕，毛發(fā)失去光澤，弓背、扎堆、反應遲鈍，活動減少，陰囊皺縮，尿量明顯增多;經(jīng)針刺治療后大鼠食欲增加，體質量加重，活動增加，毛發(fā)漸有光澤，而模型組大鼠整體情況不佳。

3.2 血清T、垂體LH和下丘腦GnRH mRNA表達

3.2.1 模型組分別與針刺實驗組和正常對照組比較 表3顯示，血清 T、垂體 LH和下丘腦GnRH mRNA的表達方面，與正常組比較模型組各指標表達均顯著降低(P＜0.01);與模型組比較，針刺實驗組大鼠血清 T水平表達明顯增加(P＜0.05)，垂體LH與下丘腦GnRH mRNA水平增加更具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

表3 各組大鼠血清T、垂體LH和下丘腦GnRH mRNA表達(±s)

表3 各組大鼠血清T、垂體LH和下丘腦GnRH mRNA表達(±s)

注:與模型組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01

組 別 例數(shù) T(ng/ml) LH(IU/L)GnRH mRNA正常組8 6.62±0.64 10.92±0.81 13.55±1.84針刺實驗組 36 5.34±0.951) 10.02±0.932) 8.22±4.212)模型組8 4.35±0.71 8.46±1.25 4.71±1.04

3.2.2 各針刺實驗組組間比較 經(jīng)直觀分析，R值越大針刺治療效果越好。各針刺因素對血清T水平的影響從大到小依次為穴位選擇、捻針角度、捻針時間、捻針頻率，最佳組合是A3B3C3D2，即針刺腎俞穴，捻針角度90°，頻率60次/min，捻針60 s;各針刺因素對垂體組織中LH水平的影響從大到小依次為穴位選擇、捻針時間、捻針頻率、捻針角度，最佳組合是A2B3C1D1，即針刺前三里穴，捻針角度90°，頻率180次/min，捻針120 s;各針刺因素對下丘腦GnRH mRNA表達的影響從大到小依次為:穴位選擇、捻針頻率、捻針角度、捻針時間，最佳組合是A3B2C2D2，即針刺腎俞穴，捻針角度180°，頻率120次/min，捻針60 s(R值見表4)。結合表5各因素對血清T、垂體LH水平和下丘腦中GnRH mRNA表達影響的方差分析結果，即不同針刺因素影響針刺療效主次的權重和每一針刺因素不同水平優(yōu)劣的權重，各因素影響針刺療效從大到小依次是穴位選擇、捻針角度、捻針時間、捻針頻率，且最佳組合是A3B3C2D2，即針刺腎俞穴，捻針角度90°，頻率120次/min，捻針60 s。

表5顯示，以血清T、垂體LH的水平和下丘腦中GnRH mRNA的表達為觀察對象進行上述4因素3水平間比較的方差分析結果顯示，穴位選擇對血清T含量、下丘腦中GnRH mRNA表達的影響都是主要因素(P＜0.01和P＜0.01)，對垂體LH含量的影響是重要因素(P＜0.05);捻針角度對血清T、垂體LH含量的影響都是次要因素(P＞0.05和P＞0.05)，對下丘腦中GnRH mRNA表達的影響是重要因素(P＜0.05);捻針頻率對上述3個指標的影響都屬于次要因素(P均＞0.05);捻針時間對血清T、垂體LH含量的影響都是次要因素(P＞0.05和P＞0.05)，對下丘腦中GnRH mRNA表達的影響是重要因素(P＜0.05)。根據(jù)不同因素主次的權重和每一因素不同水平優(yōu)劣的權重綜合分析(3個指標結果不一致的，以其中的2個一致的結果決定)，穴位選擇是影響針刺療效的主要因素，而捻針角度、頻率、時間都是影響針刺療效的次要因素。

表4 4因素3水平正交實驗設計方案及相關指標極差分析

表5 以血清T、垂體LH水平和下丘腦中GnRH mRNA表達為觀察指標的針刺多因素方差分析

4 討論

腎陽虛證是中醫(yī)的常見證型。皮質酮腎陽虛證模型是實驗研究中運用最多且比較成功的動物模型之一。該模型是根據(jù)臨床腎陽虛患者腎上腺皮質功能低下而設計的。基于課題組前期研究［10］及按照陳英華等［12］提出評價腎陽虛動物模型從一般狀態(tài)與實驗檢測、客觀指標、藥物反證幾個方面進行評價的科學設想，表3實驗結果表明，本實驗皮質酮腎陽虛證動物模型通過氫化可的松肌肉注射的方法是成功的。

本實驗分別以血清T(testosterone，T睪酮)、垂體LH(luteinizing hormone，LH促黃體生成素)的含量 和 下 丘 腦 中 GnRH(gonadotropin-releasing hormone，GnRH促性腺激素釋放激素)mRNA的表達作為觀察對象進行方差分析，結果表明穴位選擇是影響針刺療效的主要因素。對于腎陽虛證來說，選擇腎俞穴的治療效果要好于前三里和非穴區(qū)。筆者曾從背俞穴的意義、穴名釋義、古文獻、現(xiàn)代神經(jīng)解剖等方面做過分析［10］。黃成等［13］研究發(fā)現(xiàn)，艾灸或針剌老年大鼠“腎俞”能增加其垂體及血清LH、FSH(卵泡生成素)含量，因此認為針灸可使老年大鼠低下的垂體內分泌水平得到恢復。楊廉等［11］研究發(fā)現(xiàn)，溫針灸腎俞穴具有明顯調節(jié)性激素的作用，可以使老年雌性大鼠明顯低下的E2與孕酮含量升高。而前三里是手陽明大腸經(jīng)的腧穴，與腎無直接的關系;從現(xiàn)代醫(yī)學分析，前三里與腎陽虛證的靶腺(腎上腺、甲狀腺、性腺)也沒有直接聯(lián)系，而所選擇的非穴區(qū)更無上述相關聯(lián)系。因此，通過上述分析與本實驗研究結果，腧穴主治作用還是有相對特異性的。

本實驗分別以血清T、垂體LH的含量和下丘腦中GnRH mRNA的表達為觀察對象進行方差分析，結果表明針刺捻針角度、捻針頻率和捻針時間是影響針刺療效的次要因素。捻針角度、捻針頻率和捻針時間是構成針刺刺激量的主要要素之一，但針具的粗細也是構成針刺刺激量的主要要素之一。至于針刺捻針角度、頻率、時間在本實驗中處于次要因素的可能原因是，體質量200 g大鼠的表面積是70kg人的1/56［10］，30號(直徑0.32mm)針灸針作用于大鼠，則相當于一枚直徑為2.39mm的鋼釘作用于人體，刺激量相當大。當相當于鋼釘一樣粗細的針刺入到大鼠體內不需要捻針，刺激量在短時間內可能超出取得療效的刺激量閾值的上限，當再進行捻針時，其捻針的角度、頻率、時間所形成的針刺刺激量的累積，大鼠可能已經(jīng)感受不到了。

本次實驗采用的針刺手法儀只能對針刺捻針的角度、頻率、時間進行定量控制，筆者曾對該儀器的改進做過設想［14］。但由于軟硬件等方面的限制，該針刺手法儀還不能模擬針刺補瀉手法，而針刺補瀉手法很可能與針刺取穴、捻針角度、捻針頻率、捻針時間存在交互作用。由于儀器的原因，針刺補瀉手法沒有作為獨立因素進行研究，這是本實驗的不足之處，但也是我們今后努力的方向。

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Experimental Study on the Effect of Acupuncture on Hpg Axis of Kidney Yang Deficiency Rats Based on Orthogonal Design

MIN Zhi-yun1，CHENG Li-hong2，MIN You-jiang2△，DING Li-li-qiang1，ZHANG Hui1，PEI Jia1
(1.Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang 330006，China; 2.Affiliated Hospital of Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang 330006，China)

Objective:To explore primary＆secondary factors that influences acupuncture effectiveness and the best combination of acupuncture parameters，orthogonal design was adopted to study several acupuncture factors.The rats model of kidney-Yang deficiency made by hydrocortisone as the study objects.Methods:4 influential factors(i.e.selection of acupoints，twisting-rotating angle，twisting-rotating frequency and acupuncture time)plus 3 levels of each factor were arranged to L9(34)orthogonal table.Kidney-Yang deficiency rats were treated by computer controlled acupuncture manipulation device.Serum T and pituitary LH were evaluated by ELISA method and hypothalamic GnRH mRNA expression by real time fluorescent quantitation PCR to illustrate the primary＆secondary factors and the good＆bad of different levels in each factor that could affect the acupuncture effectiveness.Results:Among 4 factors mentioned above，the order for influential factors from major to small was acupoints selection，twisting-rotating angle，acupuncure time and twisting-rotating frequency，among which，selection of acupoints was the major factors，twisting-rotating angle，twistingrotating frequency and acupuncture time all were secondary factors and.Conclusion:The best acupuncture parameters for treating kidney-Yang deficiency rats was combination of A3B3C2D2:selecting Shenshu acupoint(B23)，90°of twistingrotating angle，120tpm of twisting-rotating frequency and 60s of acupuncture time;In this study，selection of acupoints became the biggest influential factor，the next was twisting-rotating angle，the secondary was acupuncture time，and the last one was twisting-rotating frequency.

Orthogonal design;kidney-Yang deficiency;T;LH;GnRH

R245.31

:B

:1006-3250(2016)08-1080-04

2016-02-13

江西省衛(wèi)計委中醫(yī)藥科研計劃項目(2014Z006)(重點課題)-采用正交設計方法研究不同針刺因素對皮質酮腎陽虛大鼠下丘腦-垂體-性腺軸影響的機制

閔志云(1989-)，男，江西南昌人，在讀碩士，從事針灸的臨床與研究。

△通訊作者:閔友江(1975-)，男，江西安義人，副教授，副主任醫(yī)師，醫(yī)學博士，從事運動系統(tǒng)疾病的針灸治療與研究，Tel:13177788362，E-mail:myj2002@126.com。