電針對糖尿病胃輕癱大鼠胃竇Ghrelin和GHSR蛋白及基因表達(dá)的影響*

彭 艷，賀鳳娥，萬全荃，陳 文，劉 琴，易受鄉(xiāng)，林亞平

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院經(jīng)穴與臟腑相關(guān)重點研究室，國家中醫(yī)藥管理局三級實驗室，長沙 410007)

電針對糖尿病胃輕癱大鼠胃竇Ghrelin和GHSR蛋白及基因表達(dá)的影響*

彭 艷，賀鳳娥，萬全荃，陳 文，劉 琴，易受鄉(xiāng)，林亞平△

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院經(jīng)穴與臟腑相關(guān)重點研究室，國家中醫(yī)藥管理局三級實驗室，長沙 410007)

目的:探討電針改善糖尿病胃輕癱(DGP)大鼠胃運動的機制。方法:將48只健康SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為空白對照組、DGP模型組、電針穴位組(模型+電針穴位)、胃復(fù)安對照組(模型+胃復(fù)安灌胃)4組各12只。采用腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)配合高糖高脂飲食建立大鼠DGP模型，電針足三里、三陰交及梁門穴以觀察大鼠血糖、尿糖值和胃排空率，ELISA法檢測血清胰島素(INS)、胃竇組織促生長素(Ghrelin)含量，PCR法測定胃竇部生長素促分泌激素受體基因(GHSR mRNA)表達(dá)。結(jié)果:與空白組比較，模型組大鼠血糖、尿糖值顯著增高，胃排空率、血清INS水平、胃竇Ghrelin及GHSR mRNA表達(dá)降低;經(jīng)電針穴位后，血糖、尿糖值降低，胃排空率、血清INS水平、胃竇Ghrelin及GHSR mRNA表達(dá)增高。結(jié)論:電針足三里等穴位可降低DGP大鼠血糖、尿糖值，促進(jìn)胃排空，這可能與其調(diào)節(jié)血清INS含量、胃竇Ghrelin及GHSR mRNA表達(dá)有關(guān)。

糖尿病胃輕癱;電針;促生長素;生長素促分泌激素受體;胰島素

糖尿病胃輕癱(diabetic gastroparesis，DGP)是一種常見的、慢性的糖尿病合并癥之一，以胃排空延緩為主要病理特征［1］。據(jù)報道，76%糖尿病患者有1種或多種胃腸道癥狀［2］，74.4%的1型糖尿病患者出現(xiàn)DGP［3］。由于胃排空速度是決定餐后血糖濃度的重要因素，因此DGP也影響糖尿病患者的血糖控制，故尋找防治DGP的有效方法具有重要意義。臨床研究證實，針灸治療糖尿病胃輕癱有良好療效，既能改善胃輕癱的癥狀又能降低血糖［4-5］，但有關(guān)基礎(chǔ)研究不足。因此，本研究建立大鼠DGP模型，觀察針刺足三里、梁門、三陰交穴對DGP模型大鼠胃排空率、尿糖值、血糖水平、血清胰島素水平、胃竇組織Ghrelin含量和GHSRmRNA表達(dá)的影響，探討針刺改善DGP的作用機制，為針刺防治DGP提供一定的實驗和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

健康SPF級SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量(231± 10)g共48只，購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司(動物質(zhì)量合格證號43004700002152)。

1.2 藥品與試劑

鏈脲佐菌素(Streptozocin，STZ)(美國Sigama公司)，血糖儀及血糖試紙(美國強生公司)，尿糖試紙(廣州花都高爾寶生物技術(shù)有限公司)，電針儀(華佗牌SDZ-Ⅱ型)，針灸針(蘇州華倫醫(yī)療用品有限公司)，胃復(fù)安(山西云鵬制藥)，酚紅(天津恒興化學(xué)試劑制造有限公司)，氫氧化鈉(湖南匯虹試劑公司)，三氯乙酸(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)，大鼠INS酶聯(lián)免疫試劑盒、大鼠CCK酶聯(lián)免疫試劑盒(南京建成生物工程研究所)，引物設(shè)計軟件Primer 5.0(英駿生物技術(shù)有限公司)，ViiATM7實時熒光定量PCR系統(tǒng) (美國Applied biosystems)，Prism 7900型熒光定量PCR儀(美國Applied biosystems)。

高糖高脂飼料由普通飼料按比例(普通飼料、熟豬油、蔗糖、奶粉、雞蛋之比為58∶15∶20∶5∶2)加工而成。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組 48只大鼠按隨機數(shù)字表法分為空白對照組、DGP模型組、電針穴位組(模型+電針穴位)、胃復(fù)安對照組(模型+胃復(fù)安灌胃)4組各12只。

1.3.2 DGP大鼠造模 所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后禁食12 h，將STZ臨用前用0.1 mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH4.5，4℃)配成2%濃度，按55 mg/kg體質(zhì)量劑量于左下腹腔內(nèi)單次注射(空白組大鼠單次腹腔注射等容量的 0.1 mmoL/L (pH4.5)檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液)，72 h后取尾靜脈血用OneTouch血糖儀和血糖試紙測血糖，即刻血糖≥16.7 mmol/L者作為糖尿病大鼠。之后給予高糖高脂飼料不規(guī)則喂養(yǎng)(即采取單日上午和雙日下午進(jìn)食法)持續(xù)8周，期間檢測血糖＜16.7 mmol/L者予以剔除實驗。DGP造模成功指標(biāo):監(jiān)測大鼠血糖、尿糖，血糖≥16.7 mmol/L、尿糖陽性者;大鼠一般情況及大便性狀與正常對照組有明顯差別者;大鼠胃排空率與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.3.3 穴位及非穴對照點定位 穴位定位參考《實驗針灸學(xué)》［6］常用動物穴位定位法及擬人對照法定位，以胸鎖聯(lián)合和恥骨聯(lián)合連線下1/4與上3/4交點為肚臍。梁門:胸劍聯(lián)合到肚臍連線中點的水平線與鎖骨中線相交處;足三里:膝關(guān)節(jié)后外側(cè)、腓骨小頭下約5 mm處;三陰交:后肢內(nèi)踝尖直上10 mm處。

1.3.4 電針方法 將大鼠仰臥位束縛于鼠板上，定穴后局部剪毛、絡(luò)合碘消毒，采用1寸30號華佗牌針灸針針刺大鼠一側(cè)足三里、梁門、三陰交，針刺深度0.3 cm，再循經(jīng)分別于足三里、梁門、三陰交直下2 mm取一點作為電針連接點(附點)，針刺深度0.2 cm，連接電針治療儀，穴位(或非穴對照點)接負(fù)極，附點接正極，采用疏密波(疏波為10 Hz，密波為50 Hz，疏波時間為10 s，密波時間為15 s)，強度2 mA，電針時間20 min，每日1次，兩側(cè)穴位交替使用，治療后正常進(jìn)食，連續(xù)進(jìn)行15 d電針治療。

1.3.5 干預(yù)方法及標(biāo)本采集 大鼠分組處理:空白組和DGP模型組捆綁20 min不針刺，電針穴位組捆綁電針穴位20 min，胃復(fù)安對照組給予1.7%胃復(fù)安藥液按1 ml/100 g灌胃治療，每天1次，連續(xù)處理15 d。實驗期間大鼠均自由攝食和飲水。于實驗第15天處理后，所有大鼠禁食24 h、禁水2 h，第16天所有大鼠給予10%水合氯醛麻醉后取材;血清采集:腹主動脈采血，常溫放置2～3 h，4℃、3000 r/min離心15 min，取上清液，EP管分裝，－20℃保存，待測INS水平;胃組織處理:大鼠剖腹結(jié)扎賁門及幽門取胃，沿胃大彎切開，用冰0.9%氯化鈉溶液沖洗并收集胃內(nèi)容物，定容20 ml，測胃排空;迅速剪取1塊胃竇組織置凍存管中，液氮中保存，待測Ghrelin及GHSR mRNA含量。

1.4 觀察指標(biāo)

采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，計量資料以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，采用t檢驗；計數(shù)資料以（n，%）表示，采用χ2檢驗，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.4.1 血糖及尿糖值 取尾靜脈血用OneTouch血糖儀及血糖試紙測血糖，用尿糖試紙測尿糖。

1.4.2 胃排空 將收集的20ml胃內(nèi)容物加入0.5 mol/L Na0H 20 ml攪拌混勻，靜置1 h后取5 ml上清液，加入20%三氯乙酸0.5 ml去蛋白，以3500 r/min(離心半徑0.1 m)離心10 min，取上清液用分光光度計在560 nm波長下測定吸光度值(OD)。另取酚紅溶液2 ml，先后加入蒸餾水18 ml、0.5 mol/L NaOH 20 ml、20%三氯乙酸4 ml攪拌混勻，測定吸光度值。胃排空率=(1－實測酚紅吸光度/標(biāo)準(zhǔn)酚紅吸光度)×100%。

1.4.3 血清INS含量測定 按照南京生物建成公司大鼠血清INS酶聯(lián)免疫法(Elisa)試劑盒要求進(jìn)行。

1.4.4 胃竇組織Ghrelin含量測定 按照南京生物建成公司大鼠Ghrelin酶聯(lián)免疫法(Elisa)試劑盒要求進(jìn)行。

1.4.5 實時熒光定量 PCR法測定胃竇部GHSR mRNA的表達(dá) 每組隨機抽取10只大鼠，采用實時定量PCR法，參照檢測試劑盒使用說明書進(jìn)行操作。利用實時定量PCR獲得GHSR基因和βactin基因CT值后，以β-actin為內(nèi)參照，隨機選取22號樣本為對照樣本，用2-△△CT法計算GHSRmRNA的相對表達(dá)量(含量)，△△CT=各組樣本(CT檢測指標(biāo) － CTβ-actin) －對照樣本(CT檢測指標(biāo) －CTβ-actin)，各組基因表達(dá)量/對照樣本基因表達(dá)量= 2-△△CT(單位為/β-actin，ratio)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS19 for Windows統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，所有資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組計量資料采用單因素方差分析，方差齊者用LSD和SNK法，方差不齊者用Tamhane‘s T2或Dunnett’s T3法;非正態(tài)分布數(shù)據(jù)用中位數(shù)(四分位數(shù)間距［M(Q)］表示，采用秩和檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血糖、尿糖值比較

表1 各組大鼠血糖、尿糖值比較(M(Q))

2.2 各組大鼠胃排空率、血清INS含量比較

表2 各組大鼠胃排空率、血清INS含量比較(±s)

表2 各組大鼠胃排空率、血清INS含量比較(±s)

注:與空白對照組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.05，3)P＜0.01

組別 鼠數(shù) 胃排空率(%) 血清INS(mIU/L) 12 66.69±4.41 5.51±0.38 DGP 模 型 組 12 25.46±2.731) 4.45±0.351)電 針 穴 位 組 12 46.14±6.281)3) 5.62±0.262)胃復(fù)安對照組 12 37.13±5.551) 5.70±0.273)空白對照組

表2顯示，與空白組比較，DGP模型組大鼠胃排空率顯著降低(P＜0.01)，血清INS水平降低(P＜0.05);與模型組比較，經(jīng)電針穴位后，電針穴位組大鼠胃排空率及血清INS水平均顯著升高(P＜0.05或P＜0.01);胃復(fù)安組較模型組血清INS顯著升高(P＜0.01)，而胃排空率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。提示DGP大鼠胃排空障礙，血清胰島素水平下降，電針穴位可顯著促進(jìn)胃排空，增加血清胰島素水平，且效果優(yōu)于胃復(fù)安對照組。

2.3 各組大鼠胃竇組織Ghrelin及GHSRmRNA表達(dá)比較

表3顯示，與空白組比較，DGP模型組大鼠胃竇Ghrelin含量及GHSRmRNA表達(dá)顯著降低(P＜0.05或P＜0.01);與模型組比較，經(jīng)電針穴位處理后，大鼠胃竇部Ghrelin含量及GHSRmRNA表達(dá)均顯著升高(P＜0.05或P＜0.01)。提示DGP大鼠胃竇Ghrelin及GHSRmRNA表達(dá)降低，電針穴位可降低其表達(dá)，效果優(yōu)于胃復(fù)安對照組。

表3 各組大鼠胃竇組織Ghrelin及GHSRmRNA表達(dá)比較(±s)

表3 各組大鼠胃竇組織Ghrelin及GHSRmRNA表達(dá)比較(±s)

注:與空白對照組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與模型組比較:3)P＜0.05，4)P＜0.01

組別 鼠數(shù) Ghrelin(ng/ml)GHSRmRNA(/β-actin，ratio)空白對照組10 1765.43±47.59 1.39±0.58 10 1837.33±54.18 1.70±0.65 DGP模 型 組 10 1665.41±20.312) 0.84±0.431)電針穴位組 10 1878.58±48.764) 2.92±1.523)胃復(fù)安對照組

3 討論

胃輕癱是糖尿病的常見并發(fā)癥之一，以胃動力低下為特點，雖然很少危及生命，但降低患者生活質(zhì)量，導(dǎo)致血糖水平不可預(yù)知的變化，并增加食品和藥品的吸收時間［1］。該病發(fā)病率高［7］，尋找防治DGP的有效方法意義重大。目前治療多在控制血糖的基礎(chǔ)上使用促動力藥物治療，以增加胃運動功能［8］，但效果常不理想，長期使用易產(chǎn)生耐藥性，停藥易復(fù)發(fā)，具有一定副作用。針刺療法在治療糖尿病胃輕癱方面具有一定優(yōu)勢［9］，有效率在90%以上［13-15］。近年來，開展了不少針灸治療DGP的臨床研究，但基礎(chǔ)研究不足。因此，本研究建立大鼠糖尿病胃輕癱模型，觀察電針足三里等穴對胃排空的影響并探討其機制，并與電針非穴對照點及促胃動力藥胃復(fù)安進(jìn)行比較。

目前認(rèn)為，DGP的發(fā)病機制主要與高血糖、神經(jīng)病變、胃腸激素變化、微血管及胃腸平滑肌變化等因素有關(guān)［16］，其中高血糖為基礎(chǔ)病因。血糖濃度的增高與胃排空延緩之間互為因果關(guān)系，即血糖增高可以抑制胃排空速度，胃排空抑制又使血糖濃度不易控制［17］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，針灸治療DGP不僅能夠緩解胃輕癱癥狀，對血糖也具有一定的調(diào)節(jié)作用［4-5］。本實驗結(jié)果顯示，電針穴位可有效促進(jìn)DGP大鼠胃排空，改善胃動力，降低血糖及尿糖值。胃復(fù)安組胃排空率有所改善，但與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而血糖、尿糖水平亦無改善。推測由于電針穴位降低DGP大鼠血糖、尿糖水平后，緩解了胃排空障礙，而電針穴位同時有促進(jìn)胃運動的作用，胃排空加快后食物儲留減少，使血糖和尿糖得以控制。

近年來，Ghrelin與消化道運動的關(guān)系越來越引起關(guān)注。Ghrelin主要由胃黏膜的內(nèi)分泌細(xì)胞產(chǎn)生，可促進(jìn)胃的排空和小腸遷移運動［18-19］。Ghrelin與其受體GHSR結(jié)合后可產(chǎn)生廣泛的生物學(xué)效應(yīng)［20］。研究者已在豚鼠胃竇平滑肌細(xì)胞［21］、大鼠小腸肌間神經(jīng)叢神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)，GHSR及 GHSRmRNA表達(dá)［22］為 Ghrelin在胃腸道參與平滑肌細(xì)胞活動調(diào)節(jié)提供了有力證據(jù)。研究表明，Ghrelin與糖尿病胃輕癱的發(fā)病密切相關(guān)。El-Salhy M發(fā)現(xiàn)，胃排空延緩的1型糖尿病患者胃黏膜和十二指腸中Ghrelin的表達(dá)較健康人顯著降低，提示Ghrelin與糖尿病胃輕癱的發(fā)病機制有關(guān)［23］。而采用Ghrelin受體激動劑治療可明顯減輕胃輕癱伴有的惡心嘔吐等癥狀［24］。Chen認(rèn)為，相對于其他參與腸-胰島軸的激素而言，Ghrelin有更重要的地位。糖尿病患者血漿Ghrelin水平表現(xiàn)為“雙向變化”，如糖尿病早期，胃所分泌的Ghrelin量顯著增加，導(dǎo)致攝食過度和胃腸蠕動加快。而糖尿病后期血漿Ghrelin水平可能降低，這可能與厭食、胃腸排空延緩甚至是胃輕癱有關(guān)［25］。此外，Ghrelin還可調(diào)節(jié)胰腺的內(nèi)外分泌功能，影響血糖水平。但關(guān)于Ghrelin對胰島素分泌的調(diào)節(jié)作用目前尚無統(tǒng)一認(rèn)識。也許是由于不同的實驗條件，在大部分研究中Ghrelin表現(xiàn)為抑制胰島素分泌。但也有部分研究發(fā)現(xiàn)，Ghrelin可刺激胰島素分泌［26］。本研究發(fā)現(xiàn)，DGP模型大鼠胃竇組織Ghrelin及其受體GHSRmRNA表達(dá)下降，血清胰島素水平降低;電針穴位后，胃竇組織Ghrelin及其受體GHSRmRNA表達(dá)增加，血清胰島素水平升高。結(jié)果提示，電針穴位可促進(jìn)胃竇部Ghrelin及其受體表達(dá)，促進(jìn)胃竇平滑肌運動，改善胃運動，同時血清胰島素釋放增加，使血糖水平得以控制。

綜上所述，糖尿病胃輕癱的發(fā)病機制與多種因素有關(guān)，如血糖、尿糖、胃排空、血清胰島素水平、Ghrelin及其受體表達(dá)等，且各種因素間相互影響。本實驗結(jié)果表明，與胃復(fù)安和電針非穴位比較，電針足三里等穴位能對以上各因素進(jìn)行綜合調(diào)節(jié)，從而有效改善DGP大鼠胃輕癱癥狀，控制血糖。

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Effect of Electroacupuncture on Ghrelin and GHSR Protein and Gene Expression in Gastric Antrum of Diabetic Rats

PENG Yan，HE Feng-e，WAN Quan-quan，CHEN Wen，LIU Qin，YI Shou-xiang，LIN Ya-ping△
(Major Laboratory of Meridians and Viscera，Tertiary Laboratory of State Administration of Traditional Chinese Medicine，Institute of Acupuncture，Moxibustion and Massage，Hunan University of Traditional Chinese Medicine，Changsha 410007，China)

Objective:To observe the effect of electro-acupuncture on rats with Diabetic Gastroparesis(DGP)and explore its mechanism.Methods:Sixty healthy Sprague Dawley rats were randomly assigned into five groups，namely blank group，model group，electro-acupuncture at acupoints group，electro-acupuncture at non-acupoints group，metoclopramide group，12 rats in each group.The animal model of DGP was established by intraperitoneal injection of streptozotocin(STZ) and high glucose and high fat diet.The Blood glucose，urine glucose and gastric emptying rate were observed.The content of insulin(INS)in serum and Ghrelin in gastric antrum tissue were detected by enzyme linked immunoassay(ELISA).The expression of GHSRmRNA in gastric antrum tissue was detected by RT-PCR.Results:Compared with blank group，blood glucose and urine glucose increased significantly，gastric emptying rate and content of insulin in serum decreased significantly，the content of Ghrelin in gastric antrum tissue and expression of GHSRmRNA decreased significantly in model group.Compared with model group，blood glucose and urine glucose decreased significantly，gastric emptying rate and content of insulin in serum increased significantly，the content of Ghrelin in gastric antrum tissue and expression of GHSRmRNA increased significantly in electro-acupuncture at acupoints group.Conclusions:Electro-acupuncture at Zusanli etc.acupoints could decrease blood glucose and urine glucose，promote gastric emptying，it may be related to the regulative effect of electro-acupuncture on content of insulin in serum，content of Ghrelin and expression of GHSRmRNA in gastric antrum.

Diabetic Gastroparesis;Electro-acupuncture;Ghrelin;GHSR;insulin

R245.9+7

:B

:1006-3250(2016)08-1088-04

2016-02-24

國家自然科學(xué)基金資助項目(81403487)-從胃竇ICC的起搏機制探討電針對糖尿病胃輕癱大鼠胃運動的影響;湖南省高校創(chuàng)新平臺開放基金項目(12 K 088)-基于ghrelin-GHSR-Ca2+信號通路探討電針對DGP模型大鼠胃運動的影響;湖南省教育廳優(yōu)秀青年項目(14B128)-電針對糖尿病胃輕癱大鼠胃竇ICC形態(tài)及起搏功能的影響

彭 艷(1980-)，女，湖南長沙人，副教授，醫(yī)學(xué)博士，從事針灸治病機理的研究。

△通訊作者:林亞平(1956-)，女，教授，博士研究生導(dǎo)師，從事針灸治病機理的研究，E-mail:lyp5381161@126.com。