生物修復石油污染土壤研究進展

詹亞斌，馬立安

(長江大學生命科學學院，湖北 荊州 434025)

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生物修復石油污染土壤研究進展

詹亞斌，馬立安

(長江大學生命科學學院，湖北 荊州 434025)

石油作為一種重要的能源，在被大量開采、運輸和使用的同時，帶來了嚴重的污染。利用微生物修復與降解石油烴類污染物成為當前治理石油污染最為理想的有效方法。介紹了營養成分、接種量、pH、石油含量、溫度、培養轉數等對降解過程的影響以及微生物在修復石油污染土壤中的應用研究進展。

石油污染；石油降解菌；微生物修復

石油作為現代工業的命脈，已被全世界廣泛使用。石油在開采、運輸、加工、儲存過程中不可避免地會發生石油泄露事故，造成土壤及水體的嚴重污染[1]。石油進入土壤之后，會破壞土壤結構，影響土壤通透性，改變土壤理化性質。石油若是進入到地下水，就會污染地下水源，影響生活、生產用水，從而危害人類的健康。同時，石油中的可溶性成分溶解到水中會形成持久性污染，增加了修復的難度[2,3]。石油污染情況日益嚴重，世界各國的科研工作者都十分重視石油污染土壤的修復技術研究，各國紛紛制定土壤修復計劃[4]。

生物修復(主要指微生物修復)是一種新興清潔技術，與物理、化學修復污染土壤技術相比，它具有成本低、不破壞生長所需要的土壤環境、操作簡單、處理效果好、無二次污染等特點，越來越引起人們的關注。早在1989年，美國阿拉斯加海域受到大面積石油污染后，首次大規模應用生物修復技術，這是生物修復技術發展的里程碑[5]。國內的研究起步較晚，到20世紀90年代，才有油區開展石油污染土壤修復技術研究[6]。

生物修復技術是在生物降解的基礎上發展起來的，可以通過環境因素的最優化而加速自然生物降解速率。生物修復技術被劃分為原位生物修復(投菌法、生物培養法、生物通氣法及地耕處理等)[7]和異位生物修復(預制床法、厭氧處理法、堆肥法及生物反應器等)[8]2種。原位生物修復費用較低，但較難控制。Misshra等[9]采用投加微生物加營養物質的原位生物修復技術對4000m2的石油污染土壤進行修復，結果證明是可行的。陳立等[10]采用原位生物修復技術修復陜北石油開采區的石油污染土壤，證明該修復技術在陜北黃土區石油污染土壤修復的有效性。原位生物修復方法難以滿足要求時，異位生物修復技術就成為一個重要的選擇。將污染土壤移離原地放入池子，投加菌種、營養物，還可以調節pH或者加入碎秸稈、麩皮增加污染物中的空隙，這樣有利于微生物對污染物的降解。張紅巖等[11]利用自行設計生物堆肥設備對廢棄油基鉆井泥漿進行為期90d的生物堆肥試驗。研究發現“廢棄油基鉆井泥漿+鋸末+營養物+微生物”堆肥方案的處理效果最佳，石油類降解率高達87.0%。

1 石油降解菌的篩選與分離

土壤中存在著大量的能夠利用有機物的微生物，主要有細菌、真菌、放線菌等，它們具有氧化分解有機物的能力。在許多條件下，降解菌馴化時間長、生長速度慢、代謝活性不高，并且很不穩定，因此篩選一些穩定高效降解污染物的菌種，是生物修復的必然要求。

石油組成成分十分復雜，目前已分析出大約 600 種烴類，還有數千種組分無法辨認[12]，單一微生物不可能完全完成石油的降解過程，必須通過多種不同功能的微生物共同作用，構建復合菌群，才能盡可能地實現石油污染物的完全降解。不同菌株之間往往存在協同與拮抗作用，在構建復合菌群時，必須考慮菌株之間的相互關系。將降解不同組分的菌株復配在一起，提高菌群對石油降解的效率。李寶明等[13]從勝利油田井、煉油廠附近以及煉油廠排污口采集石油污染土壤，篩選得到236株能在以石油作為唯一碳源的培養基中生長的石油降解菌株，在構建菌群時發現，用4株單菌構建的菌群降解效果最好，5d內石油降解率可以達到55.5%，比單一菌株在相同條件下降解率提高了15.5%。

2 影響微生物降解石油的因素

總石油烴(TPH)的微生物降解是一個極其復雜的過程，其降解效率不僅僅取決于微生物的群落和組成，還與TPH存在的數量和狀態、周圍環境等眾多因素有關。在篩選過程中，有許多因素會影響微生物對石油的降解率。其中主要包括營養成分、接種量、pH、溫度、石油含量、培養轉速等。土壤的結構、母質、含水率也對微生物的降解率有很大的影響，可以適當地添加營養物質，例如添加桔梗木屑擴大土壤孔隙度，添加適量水分保障微生物快速生長繁殖，以便達到好的降解效果[10]。

2.1 營養成分

石油污染土壤中有機碳含量很高，氮磷含量很少。為了達到較好的修復效果，在向石油污染土壤添加氮(N)、磷(P)等營養物時，必須首先確定營養鹽的形式、濃度以及適當的比例。選擇合適的培養基配方，有利于降解菌篩選、分離和馴化工作的開展。

無機鹽構成細胞和酶的組成成分、酶的激活劑以及維持適宜的滲透壓，鹽分主要通過影響降解微生物的代謝活性來影響石油降解效率。李燕妮[14]在試驗中發現高濃度鹽分含量對微生物降解石油有很大的抑制作用，即隨著鹽分含量的增加，微生物對石油的降解性能逐漸下降。

同一油田中篩選的石油降解菌，其耐鹽度也是有所差異的。張帆[15]篩選了5株菌，在研究中發現1株菌的最適鹽濃度為0，3株菌的最適鹽濃度為0.5%，還有一株菌的最適鹽濃度為1%。在高于或者低于最佳鹽度時，各菌株的生物量和降解率都明顯降低。

有些石油污染土壤含鹽量較高，為此，必須篩選高效耐鹽石油降解菌。吳濤[16]從黃河三角洲鹽漬化石油污染土壤中分離出2株高效耐鹽石油降解菌，經鑒定為惡臭假單胞菌和沙雷氏菌，耐鹽范圍分別為0.5%～6.0%和0.5%～7.0%。

不同的微生物其最適氮源是不一樣的。張帆[15]篩選了5株菌，在研究中發現，當氮源分別為KNO3、NaNO3和NH4Cl時，菌株的石油降解率都不相同。也有微生物能適應多種氮源，馬強[17]篩選了2株菌能夠利用NH4Cl、NaNO3、(NH4)2SO4、NH4NO3等氮源，降解效率都在70%以上。篩選所得的石油烴降解菌能夠利用K2HPO4和KH2PO4為磷源，降解效果比單獨應用K2HPO4或KH2PO4要好一些，主要可能是由于K2HPO4/KH2PO4(1∶1)體系對降解過程中選擇性培養液的pH能起到很好的緩沖作用，從而為降解菌提供了一個穩定的降解環境。

2.2 接種量

接種量主要通過影響微生物的調整期來影響生物對石油的降解率。接種量小時，微生物調整周期長，降解速率慢；接種量大時，微生物調整周期較短，降解速率快；但是接種量也不宜太大，李燕妮[14]發現當接種量低于或高于7%，菌群對石油的降解作用均不同程度地降低。其原因主要是，當接種量較低時，由于微生物不能快速而又充分的利用搖瓶中的碳源，表現為石油降解率的降低，且當接種量較大，由于微生物數量較大，對營養物質的需求增大，使得搖瓶中的營養物質相對供應不足，不能使微生物的數量進一步增長，從而使得石油降解率降低。

有些微生物的石油降解率決定因素并不是接種量，謝云[18]在研究中發現，當接種1%～10%的菌量，都具有很好的降解率。從經濟方面考慮，將最佳接種量定為1%。

2.3 pH

pH是影響生物降解石油烴的重要因素，不同的菌株有各自適宜的pH，pH還能夠影響微生物的生物活性，pH過高或者過低都不利于微生物對石油污染物的降解，因此確定菌株降解原油時的最適pH是非常重要的。可以向土壤中添加適量的酸堿緩沖液調控土壤的pH，由此達到微生物高效降解石油的目的。

大多數石油降解菌適合在pH為7.0的環境中生存，張帆[15]、馬強[17]、徐馮楠[19]在研究中發現pH為7時，菌株的生物量最大，降解率也最高。一些菌株適合在中性偏酸的環境中生存，謝云[18]篩選得到2株菌，降解率在pH 6～7之間達到最高為60%以上。部分菌適合在偏堿性的環境中生存，阮志勇[20]研究發現，當pH為8時，反應體系中微生物的活菌量達到一個較高值，此時石油的去除率也達到最高值。李燕妮[14]也篩選了1株適宜生存在中性偏堿性pH為9的環境中的石油降解菌，石油降解率最高為39.98%。

2.4 石油含量

石油濃度對微生物降解有很大的影響，低濃度石油通常不會對普通微生物產生毒害，還可以刺激嗜油微生物的生長。石油濃度過高會抑制微生物活性，對微生物有毒害作用[10]。

徐馮楠[19]研究發現石油的降解率與初始濃度成反比的關系。高濃度石油會影響營養和氧的傳遞，從而影響微生物的活性。研究中發現，石油濃度越大，油滴殘留的越多。這可能是石油組分中某些微生物對揮發性的烴類抗毒性作用小，這些揮發性烴類是優良的類脂質溶劑，它們能破壞細胞膜與細胞壁的類脂質，從而抑制了微生物的降解。另外，當石油濃度過大時，培養液中空氣的通透性變差，溶解氧減少，好養菌不能良好地生長，致使降解率下降。

2.5 溫度

溫度通過影響蛋白質、核酸等生物大分子的結構和功能以及細胞結構來影響生物生長、繁殖和新陳代謝。徐馮楠[19]和阮志勇[20]通過測定菌液D600nm值和原油降解率，以確定菌株降解石油最適溫度。結果顯示，高溫和低溫都不利于菌株生長以及對石油的降解。

我國北方某些油田在開采過程中污染了土壤，此時就需要耐低溫石油降解菌來降解土壤中的石油。趙全[21]從曝氣池污泥中分離、篩選得到在低溫條件下能以石油烴類物質為唯一碳源、能源的且具有良好降解性能的耐低溫瓊式不動桿菌。

2.6 培養轉數

培養轉數可以間接反映通氣量，不同類型的微生物對氧的需求是不同的。培養轉數對菌株的生長和石油降解有一定影響，活菌量和石油降解率隨著轉速升高而升高，但是到達一定的轉速，活菌量和石油降解率維持不變。

培養轉數也不是越高越好，謝云[18]在研究中發現，當培養轉數較小時，石油烴培養基中的溶解氧含量較少，不能支持細菌的生長，細菌生長受到一定的抑制；當培養轉數高于200r/min時，培養轉數過快導致菌體細胞受到損傷，降解菌的降解酶合成和代謝受到抑制，從而影響到降解菌的原油降解率。

3 微生物降解石油污染土壤的研究進展

篩選石油降解菌后，將其投入石油污染土壤中去，研究微生物對污染土壤中石油的降解效率。孫先鋒等[22]利用生物刺激和生物強化2種方法進行油污土壤生物修復，將篩選得到的枯草芽孢桿菌和銅綠假單胞菌投入到長慶油田污染土壤中，經過60d修復試驗，發現生物刺激在降解飽和烴、降低土壤中溶液表面張力、增加微生物數量、提高土壤酶活性方面優于生物強化，而生物強化則對于石油烴中難降解的芳香烴有很好的降解效果，兩者各有優勢。土著微生物也可以降解石油，但是沒有外加菌劑降解效果好。閆毓霞等[23]利用微生物修復勝利油田含油污泥，使用外加菌劑比利用土著微生物的石油降解率高6.5%。在降解過程中，應根據菌種特性適當添加營養元素。楊茜等[24]將分離篩選的石油降解菌(不動桿菌)接入陜北某油井周圍石油污染土壤，并添加氮磷營養，進行為期8周的生物修復處理，修復期間每天均勻翻動土壤保持透氣性，石油降解率達到57.5%。向油污土壤中投加降解菌可以顯著提高土壤細菌群落的多樣性。細菌群落多樣性結構越復雜，對石油烴的降解效果相對較好。也可以改良土壤的孔隙度，以便微生物能更好地降解污染土壤中的石油。齊建超等[25]將勝利油田表層0～20cm石油污染土壤，自然風干，過100目篩備用，經過改良，按照4%的比例加入混合菌劑，石油烴降解率可達到73%，土壤微生物數量增加，多樣性更為豐富。石油組分復雜，單一菌種降解效果不是很理想，這時候可以考慮構建菌群降解污染土壤中的石油。陳立等[26]從陜北某油田的石油污染土壤篩選石油降解單菌，將其組成菌群。對這些菌群進行放大培養，進行石油污染土壤修復試驗研究，2個試驗區土壤中人為添加石油質量分別為1542 mg·kg-1和1886mg·kg-1時，經過11～32d的原位修復，土壤中石油累計降解率可達69.52%～88.11%，而對照區土壤中人為添加的石油含量變化不大，去除率在20%左右，研究表明，混合菌群降解石油效率高。

4 展望

石油污染土壤的普遍性、危害性在我國已經逐漸引起社會的廣泛關注。我國對石油依賴度逐漸增高，土壤也面臨著更大的污染風險。

針對受石油中輕度污染的農業土壤，需要著力發展能大面積應用的、廉價的、環境友好的生物修復技術和物化穩定技術，實現邊修復邊生產，以保證生態環境安全[27]。篩選出合適的降解菌后，還要提供其適宜的生存環境，以滿足微生物的生長需求，同時土壤的結構、孔隙度及含水率也對微生物的降解效率有很大的影響。在實際降解過程中，要綜合考慮這些因素。

微生物技術處理效果好，費用低，最終產物是CO2、H2O等物質，不產生二次污染，但作為一種新型技術在推廣使用時還面臨許多難題。例如：石油類污染物水溶性差，不利于微生物對其降解；微生物生長緩慢，修復周期長；很難徹底降解石油污染物；污染物濃度過高時對微生物具有很大的毒害作用等。因此，高效、穩定、適應性強、廣譜性的“土著”菌株的篩選與分離以及混合菌群的構建仍是今后研究的重點。

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2016-08-26

詹亞斌 (1991-)，男，碩士生，研究方向為環境微生物。通信作者：馬立安， malian@yangtzeu.edu.cn。

X53;X172

A

1673-1409(2016)33-0052-05

[引著格式]詹亞斌，馬立安.生物修復石油污染土壤研究進展[J].長江大學學報(自科版)，2016，13(33)：52～56.