二甲基硫醚氧化菌的分離鑒定及其對豬糞堆肥的影響

郭彥釗，付瑞敏，2，薛婷婷，谷亞楠，馬瑋超，陳五嶺*（.西北大學生命科學學院，西安70069；2.河南教育學院生命科學系，鄭州450046）

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二甲基硫醚氧化菌的分離鑒定及其對豬糞堆肥的影響

郭彥釗1，付瑞敏1，2，薛婷婷1，谷亞楠1，馬瑋超1，陳五嶺1*
（1.西北大學生命科學學院，西安710069；2.河南教育學院生命科學系，鄭州450046）

摘要：從污水處理廠活性污泥中分離得到一株二甲基硫醚（DMS）氧化菌AM2，經16S rDNA檢測鑒定其為那不勒斯硫桿菌（Thiobacillus neapolitanus）。AM2的最適生長溫度為30℃，最適pH為7.0。以豬糞和秸稈粉為原料進行肥料堆肥試驗，通過檢驗菌株AM2對堆肥過程中DMS排放量、堆肥溫度、可培養微生物和酶活性的影響，來探究菌株AM2對堆肥的影響。結果表明：接入菌株AM2的實驗組DMS釋放量顯著（P＜0.05）少于對照組，在30 d的實驗中有20 d減少60%以上；顯著提高了（P＜0.05）可培養微生物數量，同時將物料溫度高于50℃的天數延長至13 d；實驗各組的脲酶、脫氫酶、過氧化氫酶、蛋白酶和纖維素酶酶活都顯著高于對照組。綜合判斷，菌株AM2能夠有效降低堆肥過程中DMS的排放量并促進肥料腐熟。

關鍵詞：二甲基硫醚；那不勒斯硫桿菌；16S rDNA；豬糞堆肥；酶活

郭彥釗，付瑞敏，薛婷婷，等.二甲基硫醚氧化菌的分離鑒定及其對豬糞堆肥的影響[J].農業環境科學學報, 2016, 35（2）：372-379.

堆肥是處理有機廢棄物的一種理想方法，但堆肥過程會釋放大量的惡臭物質污染大氣，影響周圍居民的正常生活甚至導致疾病。Dai等[1]分析了豬糞堆肥過程中釋放的氣體中主要的致臭物質，二甲基硫醚（DMS）是其中之一。

二甲基硫醚是典型的有機硫惡臭氣體，它在空氣中的含量達到十億分之一便可產生臭味[2]，并且它的產生會抑制堆肥過程中微生物的生長[3]，對肥料的發酵產生不利的影響。目前DMS的生物消除法大都需要裝有活性污泥的氣體吸收設備，這些方法的局限性是沒有在根源上抑制DMS的產生，并且需要氣體收集和吸收設備而增加生產成本，不利于有機肥料產業的發展。相比于現有的方法在堆肥過程中加入特殊微生物，利用微生物的新陳代謝過程將堆肥過程中產生的DMS分解或轉化為其他無臭物質不失為一種新的思路。Wang等[3]從活性污泥中分離得到的一株化能自養硫桿菌（ChemolithotrophicThiobacilli），對通入滴濾塔中的DMS氣體在24 h內可以完全凈化。

本實驗的主要目的是選育出一種能夠在堆肥物料中生存并且能夠氧化利用DMS的菌株。因為微生物和酶是分解有機物的主體[4]，并且物料溫度能夠反映生物活性，所以通過監測堆肥實驗過程中釋放的廢氣中DMS的含量、堆體溫度、微生物量和酶活性，可驗證篩選出的菌株能否應用在實際的堆肥中。

1　材料與方法

1.1材料與培養基

活性污泥取自西安第四污水處理廠；豬糞取自西安鑫源種豬廠。物料性狀如表1所示。

表1　物料性狀Table 1 Basic properties of composting materials

Na2S2O3無機鹽培養基[5]：KH2PO42 g，K2HPO42 g，NH4Cl 0.4 g，MgCl2·6H2O 0.2 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，Na2S2O3·5H2O 8 g，瓊脂20 g，水1000 mL。

牛肉膏培養基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂15 g，水1000 mL。

馬丁氏培養基：KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，蛋白胨5 g；葡萄糖10 g，1%孟加拉紅水溶液3.3 mL，1%鏈霉素溶液3 mL，瓊脂15 g，水1000 mL。

高氏一號培養基：可溶性淀粉20 g，KNO31 g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O0.5 g，NaCl0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，霉菌素0.03 g，K2Cr2O70.02 g，奈啶酮酸0.01 g，瓊脂15 g，水1000 mL。

1.2菌種分離與鑒定

取活性污泥1 g接入200 mL Na2S2O3無機鹽液體培養基中，31℃、180 r·min-1培養24 h，再吸取10 mL培養液轉接入新的Na2S2O3無機鹽液體培養基中，重復3次；利用第3次的培養液在Na2S2O3無機鹽平板培養基上涂平板，31℃恒溫培養72 h后挑取得到的單菌落做純化培養。再利用Na2S2O3無機鹽液體培養基對初篩出的菌株進行復篩，在31℃、180 r·min-1的恒溫搖床培養箱中培養48 h，利用鉻酸鋇分光光度法測定培養基內SO2-4濃度[6]，選出氧化能力最高的一株菌株進行后續研究。

顯微鏡觀察菌體形態，參照微生物學試驗、《常見細菌系統鑒定手冊》[7]和《伯杰氏細菌鑒定手冊》[8]對篩選菌株進行初步的形態學鑒定。提取菌株的總基因組DNA作為模板，使用細菌16S rDNA通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'）和1492R （5'-CTACGGTTACCTTGTTACGAC-3'）進行PCR擴增。PCR反應體系25 μL，熱循環參數如下：94℃預變性3 min，再以94℃變性1 min、55℃退火1 min、72℃延伸2 min為循環，循環30次后，72℃延伸10 min。通過瓊脂糖凝膠電泳回收目的條帶，并與pMD18-T載體連接，轉化E.coli DH5的感受態細胞，菌落PCR驗證后，將其送至上海生工進行測序，所得序列提交NCBI，并和相關種屬進行比對分析，構建系統進化樹（Mega 5.0）[9]。

1.3堆肥實驗方案

實驗設計為單因素4水平3重復。將豬糞與秸稈粉按10：3混合[10]，分別裝入各組通氣發酵桶中，發酵桶示意圖如圖1。向其中三組桶中分別加入100、200、300 mL菌株AM2培養3 d的培養液，剩下一組加入200 mL的無菌Na2S2O3無機鹽培養基作為對照，每5 d徹底翻堆一次，堆肥實驗進行30 d。將溫度傳感器放入距堆肥反應器底15 cm處，設定每天記錄一次肥堆溫度。固體樣品采樣在堆肥實驗開始以及每次翻堆后一天，按照五點采樣法在堆體深約15 cm處采樣，分別在牛肉膏培養基、馬丁氏培養基和高氏一號培養基上通過平板計數法[11]測量細菌、真菌和放線菌數量。

圖1　發酵桶示意圖Figure 1 Composting reactor

1.4樣品分析方法

氣體樣品使用0.5 L鋁塑復合膜氣體采樣袋（大連海得科技有限公司），開啟鼓風機在取樣口充放氣3次再取樣。用裝有火焰光度檢測器（FPD）的氣相色譜（Agilent 7890A氣相色譜儀，毛細管色譜柱Agilent CP-Sil 5 CB for Sulfur Column 30 m×0.32 mm）檢驗樣品中DMS含量，按照文獻[12]操作。DMS減排率=（對照平均值-實驗平均值）/對照平均值。

脲酶活性：苯酚-次氯酸鈉比色法[13]，以1 g土壤中脲酶在37℃環境下24 h內分解尿素所產生的NH3-N的質量表示，單位為mg NH3-N·g-1·h-1。脫氫酶[14]：TTC法，在1 g土壤懸濁液中加入氯化三苯基四氮唑（TTC），24 h后測量所生成的三苯基甲臜（TF）的含量，單位為μg TF·g-1·h-1。過氧化氫酶[15]：紫外分光光度法，以1 g土壤在20 min內所分解的H2O2質量表示，單位為mg H2O2·g-1·20 min-1。蛋白酶：利用1 g土壤在1 min內水解酪蛋白所生成的酪氨酸質量表示蛋白酶的活力，生成1 μg酪氨酸為一個酶活單位，U·g-1[13]。纖維素酶[13]：在1 g土壤懸濁液中加入過量的羧甲基纖維素鈉，50℃培養24 h，測量所生成的葡萄糖質量來表征纖維素酶酶活，單位為mg Glu·g-1·d-1。

利用SPSS20.0軟件在95%的置信區間下對各組進行方差分析，檢驗各組數據間的差異性。數據整理與作圖利用Excel軟件。

2　結果與分析

2.1菌種分離與鑒定

從活性污泥中篩選出5株菌能夠在Na2S2O3無機鹽培養基上生長，分別標記為AM1、AM2、AM3、AM4 和AM5。經單因素方差分析得出，菌株AM2的發酵液中SO2-4含量平均值最大、標準差最小且與其他各菌差異明顯（P＜0.05），如表2所示，表明AM2的氧化硫能力最強且穩定。將其選出進行后續研究，其最適生長條件為30℃、pH 7.0。

提取菌株AM2總基因組進行PCR擴增，PCR電泳結果如圖2所示。凝膠電泳回收擴增序列，得到一段1468 bp長度的16S rDNA，所獲序列提交Genbank進行BLAST。對BLAST結果進行分析，通過Mega 5.0軟件構建系統發育樹如圖3，發現菌株AM2與Thiobacillus屬中的模式種Thiobacillus neapolitanus CIP 104769（JN175334）同源性為100%。結合形態特征鑒定結果，最終將菌株AM2鑒定為那不勒斯硫桿菌（Thiobacillus neapolitanus）。

表2　培養3 d后SO2-4含量Table 2 SO2-4concentrations in compost after 3 days of culture

圖2　菌株AM2的16S rDNA PCR擴增結果Figure 2 PCR amplification results of 16S rDNA in strain AM2

圖3　菌株AM2系統進化樹Figure 3 Neighbor-joining tree based on 16S rDNA sequences of strain AM2

2.2菌株AM2對DMS排放量的影響

DMS排放情況如圖4所示。對照組與加菌各組的DMS釋放量差異顯著（P＜0.05）。在第5 d對照組DMS釋放量開始大幅上升，說明在堆肥前5 d DMS就已經開始在堆體中大量積累，至第10 d對照組達到最大值16.3 mg·m-3。而接菌各組DMS的排放量在前5 d沒有明顯波動并在第5 d之后開始下降。在第8～15 d期間，100 mL組DMS釋放量顯著高于（P＜0.05）200 mL和300 mL組，但仍顯著低于（P＜0.05）對照組；200 mL和300 mL組之間差異不明顯（P＞0.05），但是300 mL組平均值更小。說明菌株AM2的添加對減少DMS的釋放有明顯的作用，就本實驗而言，各接菌量之間差異并不明顯，因此取接菌各組減排率的平均值。從堆肥反應的第8 d開始到第28 d，接菌各組的DMS氣體平均減排率一直保持在60%以上。

圖4　菌株AM2對堆肥過程中DMS排放量的影響Figure 4 Effect of strain AM2 on DMS emissions during composting process

2.3菌株AM2對可培養微生物數量的影響

可培養微生物數量變化見表3。細菌多為單細胞存在[16]、比表面積大、繁殖快，所以細菌在整個堆肥過程數量始終占有絕對優勢。有研究認為真菌對高溫耐性較低[17]，所以其數量最少。接菌各組的細菌數和真菌數的高峰期均提前了5 d，且保持時間較對照組也有所延長。嗜熱放線菌在高溫肥堆中活性較高[18]，所以數量高于真菌。接菌各組和對照組放線菌數量都在第16 d達到最大值。接菌各組可培養微生物數量之間差異不顯著（P＞0.05），但均顯著高于對照組（P＜0.05）。

表3　可培養微生物數量變化Table 3 Changes in population of culturable microbes

2.4菌株AM2對堆肥溫度的影響

圖5為接菌各組與對照組在堆肥反應器中的溫度及環境溫度變化情況。在每次翻堆之后溫度都有一次明顯的上升，且接菌各組能達到更高的最大值。接菌各組之間差異不顯著（P＞0.05），但整個堆肥過程中對照組堆體溫度明顯小于（P＜0.05）接菌的三組。堆體溫度主要來自于微生物新陳代謝的生物熱，較高的堆體溫度表明生物的活性較高[19]，說明AM2能夠提高堆體的生物活性。

2.5菌株AM2對堆肥酶活性的影響

2.5.1脫氫酶

各組脫氫酶酶活隨發酵時間變化趨勢如圖6所示。接菌的三組和對照組變化趨勢有明顯的差異（P＜0.05），但接菌各組之間差異不顯著（P＞0.05），100、200、300 mL組脫氫酶酶活第6 d時迅速上升并在第11 d達到最高值，分別是4.798、5.229、5.053 μg TF· g-1·h-1。第6 d脫氫酶酶活的上升可能與第5 d翻堆使產脫氫酶的微生物數量回升有關，并且脫氫酶酶活的升高與DMS釋放大量減少出現在同一時間點上，推測AM2氧化DMS時需要脫氫酶的參與。對照組脫氫酶酶活則在第16 d達到最大值3.762 μg TF·g-1·h-1。在第16 d之后各組都開始緩慢下降。

圖5　菌株AM2對堆肥溫度的影響Figure 5 Effect of strain AM2 on temperature during composting process

圖6　脫氫酶酶活變化趨勢Figure 6 Changes of dehydrogenase activity during composting process

2.5.2過氧化氫酶

各組過氧化氫酶酶活隨時間的變化如圖7所示。在第6 d下降到最低點，100、200、300 mL組和對照組分別為30.0、29.6、28.7、33.8 mg H2O2·g-1·20 min-1。在堆體高溫期時實驗各組有更高的溫度，所以過氧化氫酶酶活要小于對照組，在第16 d各組的過氧化氫酶酶活均達到最大值，100、200、300 mL組和對照組分別為52.1、53.4、54.3、45.5 mg H2O2·g-1·20 min-1。除在第6 d對照組要明顯高于（P＜0.05）接菌的三組之外，其余時間接菌組都要明顯高于（P＜0.05）對照組，而接菌各組之間沒有明顯的差異（P＞0.05）。

圖7　過氧化氫酶酶活變化趨勢Figure 7 Changes of catalase activity during composting process

2.5.3脲酶

各組脲酶酶活整體趨勢如圖8所示，呈現先下降后上升最后下降并趨于平穩。脲酶酶活的最小值和最大值分別出現在第6 d和第16 d，100、200、300 mL組和對照組的最小值分別是0.351、0.362、0.332、0.412 mg NH3-N·g-1·h-1，最大值分別是0.683、0.718、0.701、0.573 mg NH3-N·g-1·h-1。至第11 d時接菌的三組脲酶酶活已經反超對照組，并在之后的過程中一直明顯高于（P＜0.05）對照組，接菌各組之間沒有明顯的差異（P＞0.05）。

圖8　脲酶酶活變化趨勢Figure 8 Changes of urease activity during composting process

2.5.4蛋白酶

各組蛋白酶酶活的變化趨勢如圖9所示。第6 d是各組蛋白酶酶活的最低點，各組之間沒有明顯差異（P＞0.05）。第11 d之后接菌的三組開始顯著高于（P＜0.05）對照組，但接菌各組之間差異不顯著（P＞0.05）。酶活最大值出現在第16 d，100、200、300 mL組和對照組分別是23.8、24.3、23.6、18.8 U·g-1。

圖9　蛋白酶酶活變化趨勢Figure 9 Changes of protease activity during composting process

2.5.5纖維素酶

各組纖維素酶酶活的變化趨勢如圖10所示。在第6 d各組均下降至最小值，但對照組顯著高于接菌各組。在第16 d各組均達到最大值，100、200、300 mL組和對照組分別為7.6、7.9、8.1、6.9 mg Glu·g-1·d-1，接菌各組之間沒有差異（P＞0.05），但均顯著高于（P＜0.05）對照組。在第21 d之后接菌各組與對照組之間差異不顯著（P＞0.05）。

圖10　纖維素酶酶活變化趨勢Figure 10 Changes of cellulose enzyme activity during composting process

3　討論

二甲基硫醚（DMS）的釋放與蛋白質的分解密切相關[20]，不添加外源微生物的對照組會在第一次翻堆后達到DMS的釋放高峰，而添加AM2的三個實驗組在翻堆之后DMS的釋放量只有小幅的增加。這說明DMS氣體主要積累于堆體內部，翻堆使之大量外泄，與Dai等[1]的實驗結果相符。因為堆體小且添加了秸稈粉使物料堆的通氣性能滿足AM2的生長需求，DMS在添加AM2的各組堆體中被氧化，所以在翻堆時沒有大量的DMS外泄。在第6 d時實驗各組的脫氫酶酶活要顯著高于對照組（P＜0.05），同時實驗各組的DMS釋放量也要顯著低于對照組（P＜0.05）。脫氫酶是氧化酶類，而那不勒斯硫桿菌的硫代謝特性是將低價硫氧化成硫單質或SO2-4[21]，據此推測脫氫酶有可能參與到DMS的轉化利用中。

發酵時堆體溫度能在一定程度上反映微生物活動狀況，溫度越高說明微生物活性越高。實驗各組在試驗中堆體溫度均顯著高于對照組（P＜0.05），同時實驗各組的脫氫酶在實驗前期就顯著高于對照組，推測外源微生物AM2的加入使脫氫酶酶活升高，一方面參與DMS的轉化，另一方面參與其他有機物的分解而產生更多生物熱。實驗各組均有13 d溫度達到50℃以上，而對照組只有9 d，雖然都達到無害化標準[22]，但實驗組的高溫保持得更長，可將無害化進行得更徹底，而且其中有12 d在50～60℃之間，這是大多數菌適宜的發酵溫度[23]，所以實驗組的高溫發酵更有助于肥料腐熟。

微生物是肥料發酵的主體，在第3～4 d堆體經歷了第一次高溫，在此期間有大部分非耐熱微生物被殺死，從而選擇出耐熱菌，此時微生物總數迅速下降。在第5 d時對堆體的充分翻堆使溫度迅速下降，含氧量也迅速增加，此時為微生物數量的回升提供了一次短暫的機會，相應地細菌數量在第6 d時較實驗開始有所增加。因為AM2有效減少了有抑菌作用[3]的DMS的產生，所以實驗各組的細菌數一直顯著高于對照組（P＜0.05），說明AM2的添加促進了細菌數量的增加。真菌的數量在第6 d都有所下降，說明第5 d的翻堆沒有使真菌恢復至開始水平，同時對照組在第6 d處于DMS釋放的高峰期，其真菌數量受溫度和DMS的雙重制約，因而顯著低于（P＜0.05）接菌的各組，直到度過高溫期和DMS釋放高峰期才在第16 d達到數量的最高值，而且仍然低于同期的接菌各組。各組的放線菌數量差異不顯著（P＞0.05），說明放線菌對DMS有一定抗性。但是由于細菌和真菌的差異導致接菌的各組堆體溫度、酶活性、菌體活性等理化生指標都優于對照組，致使放線菌數量在第6～21 d略高于對照組。

堆肥中的酶活性決定著微生物分解有機物的能力[24]，所以堆肥過程中酶活性的變化趨勢可以作為堆肥進程的指向性指標。有機物的降解多為脫氫氧化過程，脫氫酶和過氧化氫酶都是氧化酶類，可以用來表征微生物降解有機物的活性[25]。在堆肥初期脫氫酶酶活有所上升，而此時的DMS釋放量下降明顯，可能與添加的菌株AM2氧化DMS有關。過氧化氫酶的下降與堆體的高溫有關，高溫抑制了產過氧化氫酶微生物和酶本身的活性[26]。脲酶活性先降后升，與譚小琴等[25]的結果相符，脲酶酶活與微生物量呈正相關[27]，脲酶酶活在最低時微生物量也處于較低水平，而到第16 d左右，三大類微生物含量和脲酶酶活均在最高時期，并且接菌各組都要顯著高于對照組，說明接入的AM2能夠促進微生物生長。蛋白酶酶活在第11～21 d活性最大，可能與此時蛋白質快速分解有關。纖維素酶對堆體中C/N有很大的影響，可能由于實驗各組有較高的堆體溫度，在實驗前期纖維素酶酶活要低于對照組，而只在第16 d時高于對照組，說明AM2對纖維素酶影響不大。

4　結論

從活性污泥中得到一株能夠在Na2S2O3無機鹽培養基上生長的菌株AM2，通過對其16S rDNA序列分析，確定為那不勒斯硫桿菌（Thiobacillus neapolitanus）。通過堆肥實驗證實AM2能夠有效減少DMS的釋放量，增強有關酶活性，促進肥料的腐熟。

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Isolation and identification of a DMS-oxidizing bacterium and its impacts on swine manure composting

GUO Yan-zhao1, FU Rui-min1,2, XUE Ting-ting1, GU Ya-nan1, MA Wei-chao1, CHEN Wu-Ling1*
（1.The College of Life Sciences, Northwest University, Xi'an 710069, China; 2.Department of Life Science, Henan Institute of Education, Zhengzhou 450046, China）

Abstract：A DMS-oxidizing bacterial strain AM2 was isolated from activated sludge by using streak plate method, and was identified as Thiobacillus neapolitanus. Its optimum temperature and pH were respectively 30℃and 7.0. Impact of the strain AM2 on swine and straw mixture composting was examined by monitoring DMS outputs, temperature, culturable microorganism population and enzyme activity in the compost. Compared with control, inoculation with AM2 not only significantly（P＜0.05）decreased DMS outputs with over 60% reduction for 20 days during 30-day experimental period, but also significantly（P＜0.05）promoted culturable microbe population. Compost temperature maintained above 50℃for 13 days during the experimental period. Activities of dehydrogenase, urease, catalase, protease and cellulose were significantly（P＜0.05）higher in DMS-inoculated than in control groups. To sum up, the strain AM2 can effectively reduce DMS emissions during composting process and promote compost maturity.

Keywords：dimethyl sulfide; Thiobacillus neapolitanus; 16S rDNA; swine manure composting; enzyme activity

*通信作者：陳五嶺E-mail：wulingchen@yeah.net

作者簡介：郭彥釗（1989—），男，陜西西安人，在讀碩士，從事農業及環境微生物學研究。E-mail：guoyanzhao1204@163.com

基金項目：農業部科技成果與轉化項目（2012GB2 G000451.）；陜西省重大科技創新項目（2009ZKC04-16）

收稿日期：2015-07-28

中圖分類號：X172

文獻標志碼：A

文章編號：1672-2043（2016）02-0372-08

doi:10.11654/jaes.2016.02.023