蚯蚓體內恩諾沙星殘留的檢測方法研究

丁麗玲，魯曉旭，李銀生，邱江平（上海交通大學農業(yè)與生物學院，上海200240）

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蚯蚓體內恩諾沙星殘留的檢測方法研究

丁麗玲，魯曉旭，李銀生*，邱江平
（上海交通大學農業(yè)與生物學院，上海200240）

摘要：為進一步研究恩諾沙星對蚯蚓的生態(tài)毒理，建立了用熒光檢測高效液相色譜法測定蚯蚓體內恩諾沙星殘留量的檢測方法。以0.1 mol·L-1磷酸液（pH12）+乙腈=1+3（V/V）作為提取液，脫脂，濃縮，再用流動相溶解。液相色譜條件：熒光檢測器，激發(fā)波長280 nm，發(fā)射波長450nm。流動相：0.025 mol·L-1磷酸/三乙胺緩沖液（pH3.0）+乙腈=83+17（V/V）。恩諾沙星標準曲線范圍5～500 ng·mL-1，對其進行3種濃度回收率測定，回收率在81%～88%之間，平均回收率為84.5%，變異系數(shù)10%以內，恩諾沙星的最低檢出限為2 ng·g-1。對蚯蚓進行恩諾沙星濾紙染毒，濃度分別為0.16、1.6、16、32 μg·cm-2，每個濃度設置4個平行，對照為不加恩諾沙星的超純水，48 h后檢測各個濃度下蚯蚓體內恩諾沙星的平均含量分別為1.53、16.81、113.32、120.83 μg·g-1。可見，蚯蚓對外源恩諾沙星有較好的吸收，但當外源藥物濃度達到一定程度后，對恩諾沙星的吸收量將不再無限制增加，且趨于穩(wěn)定，驗證了該測試方法是簡單、快速、可行的。

關鍵詞：恩諾沙星；蚯蚓；高效液相色譜法；回收率；濾紙染毒

丁麗玲，魯曉旭，李銀生,等.蚯蚓體內恩諾沙星殘留的檢測方法研究[J].農業(yè)環(huán)境科學學報, 2016, 35（2）：403-408.

恩諾沙星（Enrofloxacin，EF）又名乙基環(huán)丙沙星，屬于第三代氟喹諾酮類（Fluoroquinolones，F(xiàn)Qs）合成抗菌藥，是第一個動物專用的FQs藥物。它具有抗菌譜廣、殺菌力強、作用迅速、體內分布廣、副作用小及與其他抗生素間無交叉耐藥性等特點，廣泛應用于畜牧、水產養(yǎng)殖業(yè)。有研究表明恩諾沙星進入動物體后，其原形及活性代謝產物會隨排泄物排出體外。由于恩諾沙星是一種廣譜抗生素，它進入到土壤環(huán)境后，可能對生態(tài)系統(tǒng)的結構和功能產生影響[1-3]。

藥物殘留對環(huán)境的影響是近年來國際上新興的研究領域[4-5]。獸藥殘留已逐漸成為人們普遍關注的一個社會焦點。近年來，人們越來越關注藥物通過人和動物的排泄物進入環(huán)境后，在環(huán)境中蓄積、遷移和轉化，以及在食物鏈中逐漸濃縮，進而對各種生物和人類健康造成的潛在危害[6]。

蚯蚓作為土壤動物中最大的常見類群之一，是土壤可持續(xù)利用的關鍵生物種。蚯蚓對土壤系統(tǒng)有重要的生態(tài)作用，是生態(tài)系統(tǒng)的重要物質分解者，同時也是展開土壤污染生態(tài)風險評價的重要指示生物[7-8]。蚯蚓經常被作為載體對可能造成土壤環(huán)境污染的化學物質進行測試，并根據(jù)這些化學物質對蚯蚓的毒害程度來評價其對土壤生態(tài)系統(tǒng)可能的危害程度[7-10]，故本文選取蚯蚓作為靶動物進行研究。

近年來，國內外對氟喹諾酮類藥物的殘留檢測方法報道較多，有熒光分光光度法[11]、酶聯(lián)法[12-13]、液相色譜法等，所測的靶動物不同，前處理和色譜測定條件也不相同[17-21]。但蚯蚓體內恩諾沙星的檢測方法以及恩諾沙星對蚯蚓的影響尚未見報道。本文旨在建立一種簡單、快速、可靠的檢測恩諾沙星在蚯蚓體內殘留量的方法，并運用所建立的檢測方法進行了濾紙接觸試驗驗證，結果表明該方法在蚯蚓體內恩諾沙星殘留的實際檢測中應用良好，為后續(xù)研究蚯蚓對恩諾沙星的吸收動力學以及毒理反應等奠定了基礎。

1　材料與方法

1.1試驗動物

赤子愛勝蚓（Eiseniafoetida），在適宜環(huán)境條件中預養(yǎng)一段時間，然后挑選體重為300～400 mg、環(huán)帶明顯且大小一致的健康成蚓進行試驗。

1.2儀器和設備

高效液相色譜儀（附熒光檢測器），美國Thermo，SURVERY PLUS；色譜柱Halo C18，4.6 mm×150 mm，2.7 μm；電子分析天平，梅特勒-托利多（METTLER TOLEDO），MX5；離心機，德國SIGMA，3K30；勻漿機，F(xiàn)LUKO，F(xiàn)A25；恒溫水浴氮吹儀，上海啟全儀器科技有限公司，PHC-12R；MX-S可調式漩渦混勻儀，美國SCILOGEX。

1.3試劑和溶液

恩諾沙星分析標準品（純度100.0%）、恩諾沙星原粉（純度≥98%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司。乙腈為色譜純；磷酸（≥85%）、正己烷、正丙醇、三乙胺、氫氧化鈉、乙酸、無水乙醇等均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。試驗用水為超純水。

1.3.1 0.1 mol·L-1磷酸溶液（pH12）

吸取85%的磷酸6.8 mL，加超純水稀釋至1000 mL，滴加1 mol·L-1氫氧化鈉溶液調pH至12。

1.3.2提取液

取0.1 mol·L-1磷酸溶液（pH12）100 mL，乙腈300 mL，充分混合，放置待溶液澄清后，過濾即得。

1.3.3流動相

0.025 mol·L-1磷酸/三乙胺緩沖液（pH3.0）+乙腈=83+17（V/V），超聲脫氣處理。0.025mol·L-1磷酸/三乙胺緩沖液（pH3.0）：取85%磷酸1.7 mL，超純水稀釋至1000mL，用三乙胺調節(jié)pH至3.0，過0.22μm微孔濾膜。

1.4液相色譜條件

色譜柱見1.2所述；柱溫25℃。熒光檢測器檢測波長：激發(fā)波長280 nm、發(fā)射波長450 nm。流動相流速300 μL·min-1。進樣體積2 μL。

1.5標準曲線的繪制

1.5.1標準儲備液

準確稱取2.000 mg恩諾沙星標準品于10 mL棕色容量瓶中，以流動相溶解并定容，配制成200 μg· mL-1恩諾沙星標準儲備液，于4℃避光保存。

1.5.2標準工作液

吸取990 μL流動相于1.5 mL棕色進樣瓶中，加入10 μL標準儲備液，漩渦混勻，制成2 μg·mL-1標準工作液。

1.5.3標準曲線各濃度工作液

用流動相將標準工作液分別稀釋成10、20、50、100、250、500 ng·mL-1的系列工作液。

1.6蚯蚓體內恩諾沙星的提取

取蚯蚓三條，稱重（約1.0 g），剪碎置于15 mL離心管中，按1：4（W：V）加入提取液4 mL，勻漿；勻漿液以4000 r·min-1離心10 min，收集上清液，殘渣再用上述方法重復提取一次，合并兩次上清液；加入4 mL正己烷，充分漩渦混勻，4000 r·min-1離心5 min；用注射器吸取下層清液于離心管中，加入2 mL正丙醇，于50℃水浴中以氮氣吹干溶劑；用1 mL流動相溶解后轉入1.5 mL離心管中4000 r·min-1離心5 min，取上清液過0.22 μm微孔膜，裝入棕色進樣瓶中，取2 μL進行HPLC分析。

1.7回收率及變異系數(shù)的測定

取蚯蚓三條，稱重，剪碎，分別添加10、50、250μL的標準工作液（1.5.2），制得恩諾沙星濃度分別為20、100、500 ng·g-1的蚯蚓樣品。每個濃度水平4個重復，按上述1.6的方法進行提取、脫脂、濃縮和進樣分析。取恩諾沙星峰面積值（y）代入標準曲線回歸直線方程中，得到回歸后的恩諾沙星濃度（x）。計算相應濃度的平均回收率、相對標準偏差（RSD）及變異系數(shù)。

1.8濾紙接觸法測定蚯蚓對恩諾沙星的吸收

（1）清腸：取直徑15 cm的培養(yǎng)皿，在底部鋪上2層濾紙，加適量水，以剛好浸沒濾紙為宜。挑選具有環(huán)帶、個體大小相似的健壯蚯蚓，用水清洗后用濾紙清除體表泥土雜物。放在濾紙上，用塑料薄膜封口，并用解剖針扎孔，然后放置于人工氣候箱中清腸24 h。

（2）染毒：參照OECD標準化濾紙染毒法[14]，在直徑15 cm的培養(yǎng)皿底鋪一層濾紙，以剛好鋪滿皿底為宜。將恩諾沙星用無水乙醇配成0.02、0.2、2、4 mg· mL-1系列濃度，對照組為不加恩諾沙星的無水乙醇。各取5.652 mL倒入培養(yǎng)皿中，剛好浸潤濾紙，于暗室中揮發(fā)至干，然后逐一加入5.652 mL超純水，使染毒組濃度分別為0.16、1.6、16、32 μg·cm-2。每個濃度設置4個重復。

（3）放入蚯蚓：將清腸后的蚯蚓沖洗干凈并用濾紙吸干蚯蚓體表的水分，放入培養(yǎng)皿中。每個處理放入蚯蚓5條，用塑料薄膜封口，并用解剖針扎孔。

（4）培養(yǎng)：將培養(yǎng)皿放入人工氣候箱中培養(yǎng)。箱中為標準實驗條件：溫度（20±1）℃，濕度75%±2%，光暗比為12 h/12 h[15]。

（5）檢測：48 h后，每個重復各取3條大小、重量盡量相同的蚯蚓，清洗、吸干體表水分后，稱重。然后按1.6的方法處理并進行HPLC分析。將恩諾沙星的峰面積（y）代入標準曲線回歸方程中，計算出相應處理組蚯蚓體內恩諾沙星的含量（x）。

2　結果與討論

2.1檢測方法的確定以及色譜條件的優(yōu)化

2.1.1樣品前處理

在樣品處理中，采用了勻漿、離心、脫脂、濃縮的提取過程[16，21]。從測定效果來看，達到了將恩諾沙星從樣品中分離的目的，操作簡單、方便。

2.1.2流動相的選擇

在反相HPLC中，優(yōu)化流動相的組成是控制保留時間和選擇性最方便的方法。氟喹諾酮類藥物具有可質子化的氮原子和可離解的羥基，在水溶液中通常以離子形式存在。選用適當離子對試劑有利于分離，該類藥物的離子對流動相有四丁基溴化銨與磷酸、三乙胺與磷酸、乙酸銨與檸檬酸等[21]。已報道的氟喹諾酮類的各種HPLC分離方法的基本體系是C18/乙腈-甲醇-磷酸鹽緩沖液。氟喹諾酮類藥物是酸堿兩性化合物，其解離狀態(tài)和流動相中的溶解性在整個pH區(qū)域內隨pH變動而增大或減小。根據(jù)Rogstad等[22]報道，恩諾沙星在酸性pH2.0～2.8范圍內，顯示熒光強度最大。綜合考慮到恩諾沙星在酸性流動相中熒光強度較高和柱中填料對pH的耐受性，我們選擇pH為3.0。本文采用了0.025 mol·L-1磷酸/三乙胺緩沖液（pH3.0）[18-21]。結果顯示以0.025 mol·L-1磷酸/三乙胺緩沖液（pH3.0）+乙腈=83+17（V/V）作流動相體系分離效果較好，其基線平穩(wěn)，色譜峰良好（圖1中a曲線），且配制方便、快捷。

圖1　恩諾沙星標準色譜圖、空白蚯蚓樣品和加標樣品色譜圖Figure 1 Chromatograms for enrofloxacin standard，blank and spiked samples

2.2蚯蚓樣品中恩諾沙星的色譜行為

在1.4所設計的色譜條件下，HPLC基線平穩(wěn)，恩諾沙星保留時間為11～12 min。蚯蚓樣品中雖有雜峰出現(xiàn)，但無干擾峰，與藥峰分離良好，見圖1中b、c曲線（空白蚯蚓樣品和加標樣品的色譜圖）。

2.3標準曲線

將繪制標準曲線用的工作液（1.5.3）依次從低濃度到高濃度，按照液相色譜條件（1.4）進行測定，每一濃度測定4次。按其所得峰面積的平均值和對應的標準溶液濃度作標準曲線圖，見圖2，并計算回歸方程及相關系數(shù)。結果顯示：恩諾沙星在10～500 ng·mL-1濃度范圍內呈良好的線性關系，線性回歸方程為：

y=0.105 1x+0.136 2，R2=0.999 7

在上述樣品處理方法及色譜操作條件下，以信噪比S/N=3計，測得恩諾沙星的最低檢出限為2 ng·g-1。

圖2　恩諾沙星標準曲線圖Figure 2 Standard curve for enrofloxacin

2.4回收率及變異系數(shù)

對恩諾沙星進行3種濃度回收率測定，結果見表1。平均回收率在81%～88%之間，總平均回收率為84.5%，總平均變異系數(shù)為3.46%。可見該檢測方法的準確度與精密度良好。

表1　恩諾沙星回收率測定結果（n=4）Table 1 Recovery percentages of enrofloxacin（n=4）

2.5濾紙接觸法中恩諾沙星在蚯蚓體內的吸收情況

濾紙接觸法是標準的蚯蚓生態(tài)毒理學測定方法之一，簡便快捷，可用于快速判定毒物毒性的大小。實驗過程中0.16 μg·cm-2與1.6 μg·cm-2濃度組以及對照組中蚯蚓的存活率約為100%，16 μg·cm-2濃度組蚯蚓的存活率為95%，32 μg·cm-2濃度組蚯蚓的存活率為85%。這說明濾紙接觸法中恩諾沙星對蚯蚓的LC50遠大于32 μg·cm-2，高于多種重金屬或農藥[23-25]，說明恩諾沙星對蚯蚓是低毒的，符合一般規(guī)律。因為獸藥可用于動物，毒性一般低于農藥或重金屬[15]。

濾紙染毒48 h后，蚯蚓體內的恩諾沙星吸收濃度見圖3。由圖3可知，當染毒濃度小于16 μg·cm-2時，蚯蚓體內恩諾沙星的吸收量隨染毒濃度變化明顯，染毒濃度越高，蚯蚓吸收越多。染毒濃度1.6 μg· cm-2的吸收量是0.16 μg·cm-2吸收量的11.0倍，16 μg·cm-2的吸收量是1.6 μg·cm-2吸收量的6.7倍。然而，隨著濃度的繼續(xù)升高，蚯蚓體內恩諾沙星的吸收量趨于穩(wěn)定。32 μg·cm-2濃度組中蚯蚓對恩諾沙星的吸收量與16 μg·cm-2濃度組相比已沒有顯著差異（P＜0.05）。濾紙接觸法主要是通過體表接觸吸收毒物，可見蚯蚓通過體表對外源恩諾沙星有著較好的吸收，且這種吸收具有一定的劑量-效應關系。當外源藥物濃度達到一定程度后，其吸收量不再繼續(xù)增加，而是趨于穩(wěn)定。這為進行下一步慢性毒性試驗和土壤染毒試驗，進一步評價恩諾沙星的生態(tài)毒理提供了參考。

圖3　濾紙染毒48 h后蚯蚓體內恩諾沙星的吸收量（平均值±標準差，n=4）Figure 3 Absorption of enrofloxacin by earthworms exposed to filter paper for 48 h（Mean±SD，n=4）

3　結論

本實驗采用高效液相色譜法分析檢測蚯蚓體內恩諾沙星的含量，對該方法的色譜條件進行了研究探索，最終確定采用Halo C18色譜柱，0.025 mol·L-1磷酸/三乙胺緩沖液（pH3.0）+乙腈=83+17（V/V）作為流動相，柱溫為25℃，熒光檢測器激發(fā)波長280 nm、發(fā)射波長450 nm，流動相流速300 μL·min-1，進樣體積2 μL。在該實驗條件下所測得的樣品有良好的分離度，并通過最低檢出限和加標回收率的檢測，驗證了該方法的穩(wěn)定性和準確性。恩諾沙星的最低檢出限為2 ng·mL-1。標準曲線線性范圍為10～500 ng·mL-1，線性相關系數(shù)為0.999 7。在加標回收率檢測中平均回收率為84.5%，平均變異系數(shù)為3.46%。

將建立的方法實際應用于濾紙接觸法中蚯蚓對恩諾沙星的吸收測定。結果表明，蚯蚓對外源恩諾沙星有著較好的吸收，但當外源藥物濃度到達一定程度后，吸收量不再無限制增加，而是趨于穩(wěn)定。本文建立的測試方法為進一步進行恩諾沙星對蚯蚓的生態(tài)毒理研究奠定了基礎，濾紙接觸吸收試驗的結果驗證了該檢測方法的可行性，也為相關試驗提供了參考。

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A detection method for enrofloxacin residues in earthworms

DING Li-ling, LU Xiao-xu, LI Yin-sheng*, QIU Jiang-ping
（Department of Agriculture and Biology, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200240, China）

Abstract：An assay method using high performance liquid chromatography（HPLC）with fluorescence detection was established to quantify enrofloxacin residues in earthworms. The extraction solution comprised 0.1 mol·L-1phosphoric acid（pH12）+ acetonitrile（1+3,V/V）. The initial extracts were defatted, evaporated, and re-dissolved in mobile phase consisting of 0.025 mol·L-1phosphoric acid/triethylamine buffer （pH3.0）+ acetonitrile（83+17,V/V）. The fluorescence detector excitation wavelength was 280 nm, and the emission wavelength 450 nm. The linear range of the standard curve was 5～500 ng·mL-1. The recoveries of 3 concentration groups were between 81% and 88% with an average of 84.5% and the coefficient of variation was less than 10%. The detection limit of enrofloxacin was 2 ng·g-1. Earthworms were exposed to filter papers soaked in enrofloxacin with concentrations of 0, 0.16, 1.6, 16 μg·g-1and 32 μg·cm-2, and 4 replicates in each case. After 48 hours of exposure, the average enrofloxacin concentration in earthworms was 0, 1.53, 16.81, 113.32 μg·g-1and 120.83 μg·g-1, respectively. These results show that the absorption of enrofloxacin by earthworms increased linearly up to 1.6 μg·cm-2exposure concentration, and then asymptotically to a maximum of approximately 120 μg enrofloxacin·g-1earthworm tissue.

Keywords：enrofloxacin; earthworm; HPLC; recovery rate; filter paper exposure

*通信作者：李銀生E-mail：yinshengli@sjtu.edu.cn

作者簡介：丁麗玲（1991—），女，浙江紹興人，碩士研究生，研究方向為生態(tài)毒理。E-mail：987530144@qq.com

基金項目：國家自然科學基金項目（31172360）

收稿日期：2015-09-20

中圖分類號：X503.22

文獻標志碼：A

文章編號：1672-2043（2016）02-0403-06

doi:10.11654/jaes.2016.02.027