ETS2基因表達與肝細胞肝癌術后復發的相關性及機制研究

吳其肯，劉玉君，陳紅旭，王海江，王利平，梅勇(.舟山市婦幼保健院外科，浙江舟山36004，.中國人民解放軍第四一三醫院外科，浙江舟山36004)

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ETS2基因表達與肝細胞肝癌術后復發的相關性及機制研究

吳其肯1，劉玉君1，陳紅旭2，王海江1，王利平2，梅勇2
(1.舟山市婦幼保健院外科，浙江舟山316004，2.中國人民解放軍第四一三醫院外科，浙江舟山316004)

[摘 要]目的 探究E26轉錄因子2(E26 oncogene homolog 2，ETS2)與肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)術后復發的相關性以及其分子機制。方法 利用熒光定量PCR(qRT-PCR)技術與Western blotting檢測ETS2基因在HCC術后兩年內復發的8例患者以及10例未復發患者癌組織樣本內的表達差異。同時，利用斯皮爾曼等級相關計算ETS2表達與樣本臨床及病理資料間的相關性。然后利用三種交叉驗證實驗(留一交叉驗證、十折交叉驗證以及蒙特卡羅交叉驗證)分析ETS2的表達對HCC樣本(本研究18例樣本以及ArrayExpress數據庫76例樣本)的術后復發預后的分型準確性。此外，進一步預測ETS2下游調控基因，并分析下游調控基因顯著參與的生物學功能以及信號通路，探究ETS2可能的分子機制。結果 ETS2基因在術后復發的HCC樣本中顯著高表達，且其表達與血管侵襲(r=0.451，P=0.021)、有無包膜(r=0.324，P= 0.047)、病理分級(r=0.422，P=0.024)以及臨床分期(r=0.404，P=0.026)間存在顯著的相關性。通過交叉驗證實驗發現ETS2對HCC樣本有較好的分型準確性[本研究樣本:81%(79%～82%)、78%(76%～79%)、75%(74%～76%)；數據庫樣本:62%(59%～63%)、63%(61%～63%)、62%(60%～63%)]。通過對ETS2下游調控基因的功能富集分析發現，ETS2基因顯著參與到細胞增殖、凋亡、分化以及血管增生等HCC術后發展相關的功能與通路中。結論 ETS2基因表達與血管侵襲、有無包膜、病理分級以及臨床分期顯著相關，兩套數據的分型準確性結果說明其可做為HCC術后復發的潛在分子標記物，且其是HCC術后復發相關分子機制中重要的參與者。

[關鍵詞]E26轉錄因子2(ETS2)；癌，肝細胞；術后復發；分子標記物

Correlation and mechanism between ETS2 expression and postoperative recurrence of hepatocellular carcinoma WU Qi-ken1, LIU Yu-jun1, CHEN Hong-xu2, WANG Hai-jiang1, WANH Li-ping2, MEI Yong2.1Department of Surgery, Zhoushan Maternal and Child Care Service Centre, Zhoushan, Zhejiang 316004, China;2Department of Surgery, the 413rdHospital of PLP, Zhoushan, Zhejiang 316004, China

Abstract ObjectiveTo explore the correlation and mechanism between E26 oncogene homolog 2 (ETS2) expression and postoperative recurrence of hepatocellular carcinoma (HCC).MethodsETS2 expression difference between 8 postoperative recurrence of HCC patients and 10 no recurrence of HCC patients was detected by qRT-PCR and Western blotting.Meanwhile, correlation between ETS2 expression and the clinical pathological indicators were calculated by Spearman rank correlation.Then, the classi■ed power of ETS2 for two datasets (18 samples from this study and 76 samples from ArrayExpress database) were analyzed by three cross-validation algorithms (leave-one-out cross validation (LOOCV), 10-fold cross validation (10-fold CV), montecarlo cross validation (MCCV)].Moreover, the downstream genes regulated by ETS2 were predicted, and then biological functional enrichment analysis was used to detect the functions and processes related to these regulated genes.ResultsETS2 gene was high expressed in postoperative recurrence of HCC patients, and significantly correlated with angiogenesis (r=0.451, P=0.021), tumor capsule (r=0.324, P=0.047), pathological grade (r=0.422, P=0.024) and clinical stage (r=0.404, P=0.026), and ETS2 had a high prediction accuracy for classi■ed HCC[samples from this study:81% (79%～82%), 78% (76%～79%), 75% (74%～76%)； samples from ArrayExpressdatabase:62% (59%～63%), 63% (61%～63%), 62% (60%～63%)].Functional enrichment analysis showed that genes regulated by ETS2 were signi■cantly involving in functions of cell proliferation, apoptosis, differentiation, angiogenesis and HCC progression related functions and pathways.ConclusionETS2 expression is signi■cantly correlated with angiogenesis, tumor capsule, pathological grade and clinical stage, which shows a great classi■ed power for recurrence of HCC in two independent datasets, and may be biomarkers of postoperative recurrence of HCC.Moreover, ETS2 plays an important role in HCC progression.

Key words E26 oncogene homolog 2 (ETS2)； hepatocellular carcinoma (HCC)； postoperative recurrence；biomarker

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是臨床上常見的惡性程度極高的一類肝臟腫瘤。目前外科手術切除可以有效延長患者的生存期，然而大約66%的患者會在幾年之內術后復發[1-3]。因此，在HCC尚未出現復發轉移之前，及早預測、診斷，并及時采取有效措施進行防治就成為能否進一步提高HCC治療效果的關鍵。目前，研究已經積累了很多HCC預后相關的臨床病理特征，例如:淋巴血管入侵、囊腫入侵、微衛星損傷以及腫瘤是否單發等。這些臨床病理特征已經開始用于HCC的預后診斷與預測，但其預測能力有限[4-5]。近年來，隨著高通量技術如基因表達譜技術的快速發展和廣泛應用，為研究HCC的分子機理與分子診斷提供了新的方法與思路[6-8]。

E26轉錄因子2(E26 oncogene homolog 2，ETS2)是ETS轉錄因子家族成員之一，屬于細胞信號轉導通路的核效應物，調控下游基因表達。目前已有大量研究發現ETS2蛋白與多種腫瘤的發生發展高度相關，是一個經典的癌基因[9-10]。為了研究ETS2與HCC腫瘤預后的關系，我們分別檢測ETS2基因在HCC術后兩年內復發的8例患者以及10例未復發患者癌組織樣本內的表達，并進一步分析ETS2可調控的下游基因所涉及的生物學功能。

1　材料和方法

1.1HCC組織樣本

樣本取自我院2010年內手術切除的HCC組織樣本，篩選術后兩年內復發的HCC患者組織樣本8例，其中男6例，女2例，年齡58～71歲。篩選術后未復發的HCC患者組織樣本10例，其中男6例，女4例，年齡52～73歲。所有樣本速凍于液氮，-80 ℃冰箱保存。

1.2qRT-PCR分析

利用TRIZol試劑盒(Invitrogen，USA)提取細胞總RNA，具體步驟參考試劑盒說明。采用SYBR Green法檢測ETS2基因的表達。ETS2基因PCR引物(產物＜200 bp，由上海生工)。采用10 μL ABI體系，包括單鏈cDNA 1 μL，SYBR Green Real-time PCR Master Mix 5 μL，上游引物和下游引物各0.45 μL(1 μmol/ L)，再加去離子水3.1 μL。采用ABI Stepone qRTPCR儀檢測。PCR循環參數為:95 ℃(60 s)，95 ℃(15 s)，60 ℃(15 s)，72 ℃(35 s)共40個循環。以β-actin基因作為內參照進行PCR，用計算機軟件(StepOneTMSoftware v3.0)分析各反應的熒光強度得出反應的循環閾值(Cycle threshold，Ct)。使用比較Ct值法計算目的基因的相對表達量。

1.3Western blotting檢測

提取跨膜蛋白，具體步驟參照試劑盒說明書(碧云天公司)。BCA法蛋白定量。SDS-PAGE電泳后將蛋白轉至PVDF膜。膜在5% BSA溶液中室溫孵育1 h以封閉膜上的非特異結合。TBS/T洗膜3次，每次5 min。封閉過的膜加入一級抗體(CST，貨號5513，1:1 000稀釋)4 ℃過夜，抗原抗體結合。TBS/T洗膜3次，每次5 min。加入HRP標記的二級抗體(CST，貨號7074，1:3 000稀釋)以結合一級抗體及HRP標記的抗生物素抗體以結合分子量標準，室溫孵育膜1 h。TBS/T洗膜3次，每次5 min。加入化學發光底物發光，用凝膠成像系統(Chemilumines-cenceimaging system，USA)掃描圖像，Image J分析軟件將圖片上每個特異條帶灰度數值化，統計ETS2蛋白與β-actin的OD比值。

1.4樣本分型準確性分析

為了進一步擴大樣本量證明ETS2基因表達的分型準確性，本研究收集了一套包括76個HCC腫瘤樣本的基因表達譜數據，數據來自歐洲分子生物學實驗數據庫ArrayExpress(編號E-MEXP-84與E-TABM-292)，包括35例術后兩年內復發的HCC患者樣本，41例未復發的HCC患者樣本[11]，其表達譜實驗平臺:Affymetrix GeneChip Human Genome HG-U133A與Affymetrix GeneChip Human Genome HG-U133B。表達譜原始數據預處理均采用基因表達控制臺軟件。采用RMA算法進行數據預處理。然后，使用R語言CMA包[12]分別進行留一交叉驗證、十折交叉驗證以及蒙特卡羅交叉驗證，計算ETS2表達對樣本分型準確性，驗證實驗重復1 000次，得到平均的分型準確率。

1.5統計學分析

使用斯皮爾曼等級相關計算ETS2基因表達值與各臨床指標間的相關性。用TRANSFAC數據庫[13]預測ETS2下游靶基因，共得到65個ETS2調控的靶基因。然后用DAVID數據庫[14]分析靶基因所富集到的GO功能與生物學通路，設定閾值為FDR＜0.05。采用R軟件對結果進行數據分析，組間采用One-Way ANOVA分析。以P＜0.05為統計學檢驗標準。

圖1　ETS2基因在不同組HCC樣本中的表達差異

表1　ETS2表達與臨床病理資料相關性

表2　ETS2基因的分類效能

2　結果

2.1ETS2在HCC組織中的表達

通過qRT-PCR實驗檢測ETS2基因在術后復發與未復發兩組樣本中的表達，結果如圖1A所示，ETS2基因在HCC術后復發樣本中顯著高表達(P=0.014)。同時Western blotting實驗也發現ETS2蛋白表達在術后復發的樣本中有明顯增高(見圖1B)。這些結果說明，ETS2的表達與HCC術后復發明顯相關。

2.2ETS2基因表達與樣本臨床資料相關性

本研究利用斯皮爾曼等級相關計算了ETS2表達值與樣本臨床資料間的相關性，結果如表1所示，ETS2表達與血管侵襲(r=0.451，P=0.021)、有無包膜(r=0.324，P=0.047)、病理分級(r=0.422，P= 0.024)以及臨床分期(r=0.404，P=0.026)存在顯著的相關性，而與年齡、性別、術前AFP值、腫瘤最大徑以及是否單發之間不存在顯著的相關關系。

2.3ETS2基因的分型準確性

本研究分別使用留一交叉驗證、十折交叉驗證以及蒙特卡羅交叉驗證對我院的18個樣本以及ArrayExpress數據庫內76個HCC樣本(35例復發，41例未復發)的表達譜數據進行分型準確性分析，結果如表2所示。對于我院的18個樣本，三種驗證方法的分型準確率分別為81%(79%～82%)、78%(76%～79%)與75%(74%～76%)。對于數據庫中76個樣本，三種驗證方法的分型準確率分別為62%(59%～63%)、63%(61%～63%)與62%(60%～63%)。該結果說明，無論是在我院的樣本還是其他研究的樣本中，甚至在不同檢測方法情況下(基因芯片檢測技術)，針對ETS2的表達的檢測，都可以較好地對HCC術后復發進行預測。因此ETS2可作為HCC術后復發的潛在分子標記物。

2.4ETS2下游調控基因以及相關功能的分析

本研究用利用TRANSFAC數據庫預測ETS2下游的調控基因，得到65個ETS2靶向調控基因。其中包括大量的與腫瘤相關的經典基因，如TP53、FOS以及MYC等[15]。為了進一步分析這些靶向調控基因所涉及的生物學功能與通路，我們利用DAVID數據庫對這65個基因進行功能富集分析，結果如表3所示。這些基因大量富集到“細胞增殖”、”“細胞凋亡”、“細胞死亡”以及“血管生成”等相關的生物學功能，而這些功能都與HCC的發展轉移高度相關[16-17]。同時，我們發現這些基因也富集到了“Jak-STAT信號通路”以及其他腫瘤相關通路。而“Jak-STAT信號通路”已經被大量文獻報道與腫瘤的復發轉移高度相關[18]。

表3　ETS2調控基因的功能富集分析結果(FDR＜0.05)

HCC術后復發是制約HCC外科手術治療效果的重要因素[19-20]。尋找HCC術后復發相關的標記物以及挖掘其相關分子機制，對HCC治療診斷非常重要。隨著

3　討論

高通量、整合性“組學”技術的應用，眾多新型肝癌預后標記物被發現，例如血清樣本的中的預后標記物AFP，組織樣本中的P53，細胞角蛋白10或19等[21-22]。但這些潛在的肝癌預后判斷標記物多來源于科研機構的獨立研究報道，缺乏多中心和規?；炞C資料，還有很多臨床前工作需要開展。

ETS2是腫瘤發展過程中非常關鍵的轉錄因子，參與多種組織的生長發育過程，包括細胞增殖、分化、遷移、凋亡和細胞間相互作用。Wolvetang等[23]研究發現ETS2可通過調控P53基因的表達激活P53相關的腫瘤信號通路，同時Sevilla等[24]發現其與PU.1因子協同顯著增加bcl-x基因的活化，這對巨噬細胞的生存和吞噬功能起著重要作用。在本研究中，ETS2基因在術后復發的HCC組織樣本中表達明顯增高，同時還發現其與血管侵襲、有無包膜、病理分級以及臨床分期顯著相關，這些結果說明ETS2基因表達與HCC的預后顯著相關，其表達越高，腫瘤的臨床以及病理分級越高，且血管侵襲程度加深，包膜更趨向于不完整。

此外，本研究通過對兩套獨立HCC樣本的交叉驗證實驗發現ETS2的表達對HCC術后復發的預準確性與穩定性較好。其中值得注意是本院的18例樣本使用的是PCR技術，而數據庫中的76例樣本使用的是基因芯片技術，而交叉驗證的結果發現，在不同的檢測技術下，ETS2表達對兩套不同的樣本都具有較好的分型能力，這有力證明了該基因具有成為HCC預后的分子標記物的潛力。本研究通過進一步分析ETS2下游調控基因及其參與的生物學功能與通路，結果發現ETS2下游調控基因顯著富集到血管生成、細胞增殖分化與凋亡等生物學功能，更是從側面證明了ETS2基因的表達與血管侵襲、包膜以及臨床病理分級高度相關，也反映出ETS2在HCC的術后復發過程中具有重要作用。

當然，本研究只是基于本院收集的少量樣本，ETS2真正臨床診斷價值的確認，還需要更高樣本量并多中心規?；尿炞C，這也是我們下一步工作的主要方向。此外，我們將進一步篩選其他HCC相關的基因或分子，并與ETS2基因聯合形成HCC預后診斷的分子標記物組合，致力于增加HCC預后預測的普適性以及準確率。

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(本文編輯:魯翠濤)

·論著 基礎研究·

[通訊作者簡介]劉玉君，教授，主任醫師，E-mail:yujunliu66@163.com。

作者簡介][第一吳其肯(1980-)，男，浙江舟山人，主治醫師。

[收稿日期]2015-06-11

[中圖分類號]R735.7

[文獻標識碼]A

DOI:10.11952/j.issn.1007-1954.2016.01.009