木質素過氧化物酶降解四環素機理的研究

李星星，鮑建國，冷一非，劉 穎，郭 慧，鄭 進

(1．中國地質大學(武漢)環境學院，湖北武漢430074; 2．湖北理工學院環境科學與工程學院，湖北黃石435003)

木質素過氧化物酶降解四環素機理的研究

李星星1，2，鮑建國1，冷一非1，劉 穎1，2，郭 慧1，鄭 進2

(1．中國地質大學(武漢)環境學院，湖北武漢430074; 2．湖北理工學院環境科學與工程學院，湖北黃石435003)

為探究過氧化物酶對四環素類抗生素的降解機理，以白腐真菌Phanerochaete chrysosporium表達的木質素過氧化物酶(LiP)粗酶為研究對象，研究其產酶條件及其降解四環素(TC)的機理。結果表明:低濃度Mn2+可促進產酶，碳源、氮源限制是產酶的重要條件;降解反應進行10 min后，H2O2消耗至閾值0．045 mmol/L，LiP對TC的降解停止，其降解率達到82%;TC降解反應趨于平衡時，補加TC和H2O2后，LiP依然可以高效發揮作用，其二次降解率達到65%;LiP作用于不同初始濃度(10 mg/L、25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L)TC，顯示LiP對不同濃度TC均可有效降解，TC降解率分別為62%、80%、82%和90%;降解產物的抑菌性試驗反映出降解產物較TC母體的抑菌性明顯降低;LC/MS捕獲到6種可能的降解產物E-TC、TP 461、E-TP 461、TP 477、TP 475和TP 445，并推測出LiP降解TC可能的降解途徑。

四環素(TC);木質素過氧化物酶(LiP);抑菌性;降解產物;降解機理

四環素類(Tetracyclines，TCs)抗生素是由放線菌產生的一類廣譜抗生素，其價格低廉，是目前世界上使用最廣泛、用量最大的抗生素種類之一［1］。

在過去數十年中，四環素類抗生素作為人、獸用藥和飼料添加劑被大量使用，這也導致了環境污染化合物的增加［2-3］。由于它們可能和微生物的抗生素抗性有潛在的聯系，其在環境中的殘留受到了廣泛的關注［4］。四環素在使用后，一部分被人體或動物體代謝為低活性的化合物，另一部分約30%～90%以原藥形式或是活性代謝產物的形式由尿液、排泄物、糞便的形式釋放到環境中(地表水、地下水、土壤)［5］。此外，環境中四環素類抗生素的生態風險和潛在毒性的問題也同樣引起研究者的關注［6］，環境中殘留的四環素會導致微生物多樣性的下降，促進了抗生素抗性微生物的發展和演化，對人類飲用水和灌溉用水造成潛在的威脅，同時也會引起人類腸道菌群的紊亂，增加感染風險，從而影響人類的健康［7］。

針對環境中四環素污染問題的研究主要集中在其環境地球化學行為、生物堆肥和活性污泥中的降解效率、光催化以及高級氧化等物理和化學技術的研究方面［8］，而四環素的生物降解、酶降解的研究則較為薄弱。目前越來越多的研究表明生物酶能用于許多特殊污染物的降解，隨著生物科學技術的發展，更多廉價高效的酶被分離純化并應用于特殊污染物的處理中。較傳統的處理技術而言，生物酶處理技術有著諸多的潛在優勢，如可用于難降解有機物的降解，能較好地作用于高濃度或低濃度污染物，反應條件溫和等［9］。近些年來，過氧化物酶受到研究者的廣泛關注，它是由微生物或植物所產生的一類氧化還原酶，通過催化過氧化氫或低分子量有機過氧化物與有機化合物的氧化反應，達到降解有機污染物的目的，如Cooper等［10］發現辣根過氧化物酶能有效降解苯酚; Bhunia等［11］發現過氧化物酶對染料有降解效果。除此之外，過氧化物酶對硝基苯、氯酚、萘酚、多環芳烴等有機污染物降解的可行性也都有報道［12］，如清華大學文湘華教授的研究團隊論證了由白腐真菌產生的兩種過氧化物酶(木質素降解酶和錳過氧化物酶)對四環素的降解可行性［13］。而目前過氧化物酶在四環素類抗生素污染的降解機理卻少有報道。為此，本文以木質素過氧化物酶(LiP)為代表，研究其產酶條件、對四環素的酶促降解條件、解毒效果、降解產物的捕獲以及可能降解途徑的推斷等，為木質素過氧化物酶在四環素類抗生素污染的環境治理提供依據。

1 材料與方法

1．1 化學藥品

四環素(TC)、Tween80、甲醇(色譜純)和乙腈(色譜純)購自上海Aladdin公司;藜蘆醇購自上海源葉生物科技有限公司;其余藥品均為分析純試劑。

1．2 菌種及其培養條件

1．2．1 菌種

白腐真菌Phanerochaete chrysosporiumBKM-F-1767購自中國典型培養物保藏中心(CCTCC)。

1．2．2 培養基

固體培養基:PDA培養基，馬鈴薯浸出液200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L，pH值自然。

液體產酶培養基:基于Tien和Kirk的基礎培養基［14］，以0．2 mol/L酒石酸-酒石酸鈉緩沖液(pH值為4．4)替代琥珀酸二甲酯緩沖溶液，培養基中引入1．5 mmol/L藜蘆醇、1．0 g/L Tween80和0．2 g/L酵母粉，以葡萄糖、酒石酸銨為碳源、氮源。

1．3 試驗方法

1．3．1P．chrysosporium選擇性產LiP的條件

將P．chrysosporium由凍干管接種至PDA固體培養基，37℃培養7～9 d，用無菌水洗滌得到孢子懸液備用。在裝液量為100 mL/250 mL的產酶培養基中加入孢子懸液，控制孢子濃度為1×105個/mL，于37℃、120 r/min恒溫搖床內培養。

碳源、氮源和Mn2+濃度是影響產LiP的重要因素［15-16］，選取葡萄糖、酒石酸銨和 MnSO4為產 LiP的限制因子，每個因子設定兩個水平，共8組組合(見表1)產LiP，選取酶活較高且不產生P．chrysosporium所產的其他酶——錳過氧化物酶和漆酶的組合為選擇性產LiP的條件。在該培養條件下測得酶活高峰時收獲酶液，將培養基于10 000 r/min、4℃離心10 min，上清液即為粗酶液，在冰箱內4℃保存備用，酶活可保持3個月以上。

表1 產木質素過氧化物酶因子水平表Table 1 Combinations of factors and levels for LiP production

1．3．2 LiP對TC的降解

LiP降解TC體系見表2。以加入高溫失活酶為空白對照，降解反應在37℃恒溫搖床內進行，搖床轉速為120 r/min，反應過程避光，所有樣品均設置3個平行樣。通過向樣品中1∶1(V/V)加入二氯甲烷并劇烈振蕩終止酶反應，8 000 r/min、4℃離心3 min，上清液經0．22 μm微孔濾膜過濾，由高效液相色譜法和鈦鹽分光光度法分別測定TC降解過程中TC和過氧化氫(H2O2)的濃度變化。降解反應進行10 min后向反應體系補加初始濃度H2O2，測定降解過程中TC的濃度變化;降解反應進行1 h后向反應體系同時補加TC和H2O2，補加量與初始加入量相同，測定降解反應過程中TC和H2O2的濃度變化。TC降解率的計算公式為

式中:D為TC的降解率(%);C0為空白對照樣中TC濃度(mg/L);Cx為樣品中TC殘留濃度(mg/L)。

表2 LiP降解四環素體系Table 2 Composition of TC degradation system by LiP

1．3．3 LiP降解TC產物的抑菌性

TC及其降解產物的抑菌活性通過牛津杯法進行測定［17］。大腸桿菌在液體營養培養基中37℃振蕩培養至對數生長期收集菌體，用生理鹽水調節OD600= 1．0，備用。將牛津杯置于含大腸桿菌的營養瓊脂平板上，分別加入300 μL待測樣品，將平板轉移至30℃培養箱培養16～18 h后測定抑菌圈直徑。

1．4 分析方法

(1)LiP酶活測定:采用Tien和Kirk方法［14］，定義每1 min氧化1 μmol藜蘆醇成藜蘆醛所需的酶量為1個酶活力單位。

(2)錳過氧化物(MnP)酶活測定:采用Paszczynski方法［18］，定義每1 min氧化1 μmol Mn2+為Mn3+所需的酶量為1個酶活力單位。

(3)H2O2濃度測定:采用鈦鹽分光光度法［19-20］。

1．5 TC濃度測定

TC濃度采用HPLC(Shimadzu LC-06A)進行分析，色譜柱采用C18反相柱(4．6 mm×250 mm，5 μm，Agilent)。色譜分析條件:流動相為67%的0．1M甲酸溶液、22%乙腈和11%甲醇，流速為1 mL/min，柱溫為40℃，進樣量為20 μL，檢測波長為355 nm。

1．6 LiP降解TC產物的LC/MS檢測

取LiP降解四環素體系0 min和10 min的樣品，經固相萃取柱(Oasis HLB，6cc/150 mg，Waters)萃取后備用［21］，采用液相質譜聯用儀(Q Exactive system，Thermo scientific，USA)分析TC的降解產物。色譜分離柱采用C18反相柱(4．6 mm×150 mm，3 μm，Phenomenex)，流動相為67%的0．1 M甲酸溶液、22%乙腈和11%甲醇，流速為0．5 mL/min，進樣量為5 μL;質譜使用電噴霧解離源、正離子模式。數據采集使用質荷比(m/z)范圍為200～600下的全掃描模式。

2 結果與分析

2．1 P．chrysosporium選擇性產LiP的條件

試驗選取對P．chrysosporium產LiP影響較大的限制因子，即碳源(C)、氮源(N)、Mn2+濃度為主要因子，測定3種因子不同組合情況下對P．chrysosporium產LiP的影響，其試驗結果見圖1。

由圖1可見，LiP在第5 d出現酶活，6～7 d達到酶活高峰，在低Mn2+濃度條件下有較高的酶活表現，除高碳高氮低錳條件外，其他低Mn2+濃度條件峰值均大于100 U/L;在低碳低氮低錳條件下LiP酶活表現最好，峰值為138 U/L，其次為高碳低氮低錳條件下LiP酶活峰值為130 U/L，而在這兩種條件下P．chrysosporium所產的另一種酶——錳過氧化物酶也有一定的酶活表現(結果未給出);在低碳高氮低錳條件下檢測到較高的LiP酶活，其峰值為120 U/ L，而P．chrysosporium所產的其他酶——錳過氧化物酶和漆酶的酶活均未被檢出(結果未給出)，該條件下第6 d LiP酶活高峰期收獲酶液即為LiP粗酶液。

圖1 不同限制因子對P．chrysosporium選擇性產LiP的影響Fig．1 Effects of different limiting factors on LiP production byP．chrysosporium

2．2 LiP對TC的降解

2．2．1 LiP降解TC過程中H2O2濃度的變化

LiP對TC的降解及反應過程中H2O2濃度的變化見圖2。由圖2可見，TC在前10 min內被快速降解轉化，其降解率達到82%，之后趨于穩定;同時在前10 min內，隨著TC的快速降解，H2O2不斷消耗，其由初始的0．4 mmol/L迅速降低至0．045 mmol/L;當H2O2的殘留濃度降低至約0．045 mmol/L時趨于穩定，此時TC的降解率也無明顯變化。

圖2 LiP降解TC過程中H2O2濃度的變化Fig．2 Concentration variation of H2O2during TC degradation by LiP

2．2．2 補加H2O2和TC對LiP降解TC的影響

2．2．2．1 補加H2O2

試驗在LiP降解TC反應進行10 min后向體系中補加初始加入量的H2O2，其試驗結果見圖3。由圖3可見，補加H2O后，TC降解率從80%提升至92%。

圖3 補加H2O2對LiP降解TC的影響Fig．3 Effects of H2O2addition on TC degradation by Lip

2．2．2．2 補加H2O2和TC

試驗在LiP降解TC反應進行1 h后向體系中同時補加初始加入量的H2O2和TC，其試驗結果見圖4，降解反應過程中空白對照TC基本未消耗(結果未給出)。由圖4可見:隨著H2O2的消耗，TC濃度降低;補加10 min后，H2O2濃度從補加時的0．45 mmol/L降至0．13 mmol/L，TC濃度從補加時的60 mg/L降至25 mg/L，TC的降解率為58%;補加1 h后，H2O2濃度降至0．045 mmol/L，TC濃度降至20 mg/L，TC的降解率為65%。

圖4 補加H2O2和TC對LiP降解TC的影響Fig．4 Effects of H2O2and TC addition on TC degradation by Lip

2．2．3 LiP對不同初始濃度TC的降解效果

圖5 不同初始濃度TC下LiP對TC的降解效果Fig．5 Degradation of TC with different initial concentrations of TC by LiP

試驗中LiP降解TC體系的其他條件不變，作用于不同初始濃度TC，考察不同初始濃度TC對LiP降解TC的影響，其試驗結果見圖5，反應過程中空白對照TC基本未消耗(結果未給出)。由圖5可見:補加H2O2和TC前，LiP對試驗濃度范圍內(10～100 mg/L)TC的降解呈現出隨著TC初始濃度的增加，TC降解率呈上升的趨勢，即初始濃度為100 mg/L時TC降解率達90%，TC初始濃度為50 mg/L時TC降解率達82%，TC初始濃度為25 mg/L時TC降解率達80%，TC初始濃度為10 mg/L時TC降解率為62%;補加H2O2和TC后，TC初始濃度為100 mg/L的樣品中TC濃度從109．9 mg/L降至27．9 mg/L，其降解率為75%，TC初始濃度為50 mg/L的樣品中TC濃度從56．7 mg/L降至17．1 mg/L，其降解率為69．8%，TC初始濃度為25 mg/L的樣品中TC濃度從28．0 mg/L降至5．0 mg/L，其降解率為82%，TC初始濃度為10 mg/L的樣品中TC濃度從14．8 mg/L降至4．1 mg/L，其降解率為72%。

2．3 降解產物的鑒定

2．3．1 LiP降解TC產物的抑菌性

對LiP降解不同初始濃度(10 mg/L、25 mg/L、50mg/L、100 mg/L)TC以及不同降解時間的樣品進行大腸桿菌的抑菌性試驗，其試驗結果見圖6。由圖6可見，隨著降解反應的進行，抑菌圈直徑減小，其中TC初始濃度為50 mg/L時抑菌圈直徑減小最為明顯，從21．32 mm減小至9．58 mm;TC初始濃度為10 mg/L時抑菌圈直徑變化不大，從11．94 mm減小至8．88 mm。

2．3．2 LiP降解TC的產物鑒定

對LiP降解TC 0 min和10 min的樣品進行降解產物檢測(酶降解體系參照表2)，6種可能的降解產物被捕獲，其質荷比、預測分子量、實測分子量、保留時間等見圖7和表3。TC母體化合物的m/z為445．160 3，保留時間為4．96 min，具有同樣質荷比且保留時間提前(4．42 min)的峰為TC差向異構體E-TC。

圖6 LiP降解TC產物的抑菌性Fig．6 Antibacterial potency of the degradation products of TC by LiP

圖7 LiP降解TC產物(m/z461、m/z477、m/z475、m/z445)提取離子流質譜圖Fig．7 Extracted ion chromatograms of the degradation products by LiP atm/z461(a)，m/z477(b)，m/z475(c)andm/z445(d)

表3 TC及其降解產物的色譜特征Table 3 Characteristics of the parent compound and the degradation products from TC

圖8 LiP降解TC的可能途徑Fig．8 Proposed pathway of TC degradation by LiP

LiP對TC降解的可能途徑見圖8。由圖8可見，TC母體在 C11a加氧發生羥基化反應得到TP461，進一步在C2加氧形成TP477;在C6發生脫水反應、C9發生羥基化反應后形成TP475;最后通過D環C9和C10羥基的氧化和A環C1的脫羰作用形成最終產物TP445。

3 討 論

Mn2+對P．chrysosporium產LiP有顯著的影響，高濃度Mn2+抑制白腐真菌產酶，而低濃度Mn2+能促進LiP的產生。李華鐘等［16］研究表明，適量的Mn2+存在時菌絲球表面形成的褐色沉淀物MnO2可保護LiP不受菌絲產生的H2O2毒害，從而提高LiP的酶活，而在高Mn2+濃度條件下，培養液中產生的過量Mn3+抑制了MnO2的生成，產LiP受阻。低Mn2+濃度時，碳源或氮源限制條件下均能檢測到較高的LiP酶活，而在碳源、氮源充足的條件下LiP酶活較低(見圖1)，說明限碳或限氮是產酶的重要條件［22］，但Lip表達調控機制復雜，受碳、氮調節機制并非固定不變的，在一定情況受培養條件影響，不同的情況最佳碳、氮素含量有所不同［23］。

H2O2濃度是LiP降解TC的關鍵因素，酶降解反應通過H2O2觸發，但過量H2O2會導致LiP失去活性［24］。降解反應體系中需加入適量濃度H2O2，以促使TC降解反應的進行，當H2O2消耗至閾值時(0．045 mmol/L)，額外補加H2O2可以重新啟動降解反應，提高TC的降解率。TC降解反應進行1 h后重新補加H2O2和TC，LiP仍有較強的TC降解效果，5 h后LiP酶活仍穩定在40 U/L，10 h后體系內出現沉淀，LiP酶活降為0 U/L(結果未給出)，此現象表明LiP具有一定的持效性，在一定條件下可以重復利用。

LiP降解TC反應趨于平衡后補加初始加入量的H2O2和TC，初始濃度為10 mg/L、25 mg/L的TC二次降解率高于初次降解率，這主要是因為補加TC和H2O2后TC濃度分別升高至14．8 mg/L和28．0 mg/L;而初始濃度為50 mg/L、100 mg/L的TC二次降解率低于初次降解率，表明LiP雖然具有一定的持效性，但對較高濃度的TC，重復利用降解率下降明顯。

Jiao等［25］、Guo等［26］的研究發現，TC的光降解產物毒性比母體化合物毒性更強。而在本研究中，LiP對不同濃度TC降解后產物的抑菌性降低。同樣，在Suda等［27］的研究中，由白腐真菌所產的多酚氧化酶——漆酶降解TC后產物毒性也有所降低，生物酶降解TC過程中不會產生更強毒性的降解產物，較TC的傳統處理方法有相當的優勢。

TC母體在酸性(pH=3～6．5)條件下，一部分易轉化為其差向異構體E-TC［28］，E-TC在C11a加氧得到E-TP 461。Dalmázio等［29］和Wan等［30］在臭氧處理TC的研究中同樣檢出TP461和TP477，pH值較低時，鄰位供電子官能團的存在使得 TC的C11a-C12雙鍵成為最具活性的反應位點，在該位點發生1，3-偶極加成反應形成TP 461，具有較低電子密度的C2-C3活性位點發生同樣的氧化反應得到TP 477。Vartanian等［31］，Kamel等［32］的研究表明，C6的羥基易發生脫水反應形成更穩定的苯環結構，形成可能的中間產物(m/z為459)。C10的苯酚結構使得鄰位C9易發生加氧羥基化反應，經過C9的羥基化作用形成的鄰苯二酚結構并通過兩電子氧化形成苯氧結構［33］，得到TP473。由于C1-C12a鍵能較C1-C2低，α-斷裂在C12a-C1發生，隨后產生一種雙自由基中間體，通過羰基的脫去形成另一中間體，這一中間體的C12a與C2連接后形成閉環結構［34］，轉化為最終產物TP 445。

4 結 論

(1)研究了不同限制因子對白腐真菌產LiP的影響，并確定了白腐真菌選擇性產LiP的條件，低濃度Mn2+、限碳或限氮有利于產酶，選擇性產LiP條件為低碳高氮低錳。

(2)H2O2的濃度是LiP降解TC反應的關鍵因素，通過補加適量的H2O2可以提高TC的降解率。反應過程中LiP的損失較小，再重新補充 TC和H2O2后，也有相當的TC降解效果，為LiP在實踐中的重復利用打下理論基礎。

(3)LiP對不同初始濃度(10 mg/L、25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L)TC均可有效降解。

(4)LiP降解TC的降解產物較TC母體的抑菌性明顯降低。

(5)檢測出6種可能的TC降解產物，分別為E-TC、TP 461、E-TP 461、TP 477、TP 475和TP 445，并推測了其降解途徑。

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Degradation Mechanism of Tetracycline by Lignin Peroxidase

LI Xingxing1，2，BAO Jianguo1，LENG Yifei1，LIU Ying1，2，GUO Hui1，ZHENG Jin2
(1．School of Environmental Studies，China University of Geosciences，Wuhan430074，China;2．School of Environmental Science and Engineering，Hubei Polytechnic University，Huangshi435003，China)

To study the mechanism of tetracycline antibiotics degradation by peroxidase，this paper chooses the crude enzyme of lignin peroxidase(LiP)from Phanerochaete chrysosporium as the research object，and explores the induction conditions of lignin peroxidase and degradation mechanism of tetracycline(TC)．The results indicate that the limitation of carbon，nitrogen and low concertation of Mn2+are important factors for enzyme production．The degradation reaction of TC terminates when the concentration of H2O2decreases to 0．045 mmol/L，and the degradation rate reaches 82%within 10 min．LiP is still effective by adding TC and H2O2when degradation reaction reaches balance，and the secondary degradation rate is 65%．Lignin peroxidase has a strong ability of TC degradation with different initial concentrations(10 mg/L，25 mg/L，50 mg/L，100 mg/L)，the degradation rate being 62%，80%，82%and 90%respectively．According to oxford cup tests，the transformation products of TC show lower antimicrobial potencies than the parent compound．There are six possible transformation products，namely，E-TC，TP 461，E-TP 461，TP 477，TP 475 and TP 445 using LC/MS in the progress of TC degradation by LiP．Besides，the paper infers the potential degradation pathway of TC by LiP．

tetracycline(TC);Lignin peroxidase(LiP);antimicrobial potency;degradation product;degradation mechanism

X52;X172

ADOI:10．13578/j．cnki．issn．1671-1556．2016．05．010

1671-1556(2016)05-0061-08

鮑建國(1963—)，男，博士，教授，主要從事水污染控制、土壤修復、清潔生產等方面的研究。E-mail:bjianguo@cug．edu．cn

2016-04-13

2016-06-22

國家自然科學基金項目(4137308)

李星星(1991—)，女，碩士研究生，主要研究方向為水污染控制與環境影響評價。E-mail:602307110@qq．com