基于斑馬魚行為變化的水體突發汞污染生物預警技術研究

逯南南，孫韶華，宋武昌，杜娟娟，賈瑞寶

(1．山東省城市供排水水質監測中心，山東濟南250021;2．山東建筑大學市政與環境工程學院，山東濟南250101)

基于斑馬魚行為變化的水體突發汞污染生物預警技術研究

逯南南1，孫韶華1，宋武昌1，杜娟娟2，賈瑞寶1

(1．山東省城市供排水水質監測中心，山東濟南250021;2．山東建筑大學市政與環境工程學院，山東濟南250101)

針對突發水污染事件難以準確預警的現狀，通過模擬水體突發汞污染事件，開展了以生物魚行為變化為基礎的水質生物預警技術研究。以正常水體中斑馬魚的行為變化為基礎，采用高速攝像跟蹤技術，解析了突發汞污染(0．1 mg/L)水體中斑馬魚游動行為(游動速度、高度、轉彎次數、加速度)和通訊行為(平均距離、分散度)等行為指標的變化，結果表明:綜合評價指標水質健康指數6 h內無法預警，以游動高度作為水體突發汞污染事件的監測預警指標，可將預警時間縮短至3 h。

汞;突發水污染;斑馬魚;行為變化;生物預警技術

近年來水體突發污染事故頻發，嚴重威脅飲用水安全。傳統的實驗室檢測因監測頻率低、耗時長等問題難以滿足水質預警要求，而水質在線監測技術目前已被廣泛應用于水源地、河流、污水處理廠等水質的監測，其中基于水體中污染物暴露下魚的行為變化的在線生物監測技術是進行水質預警的一種有效手段［1-3］。Belding等首次利用對魚的呼吸行為的監測實現了水中污染物的預警，之后對魚的運動行為(游泳速度、綜合行為強度等)、逃避行為(浮頭行動、急速游動等)、通訊行為(平均距離、分散度等)等指標的監測被應用于水質的在線預警［4-6］。

汞是我國《重金屬污染綜合防治“十二五”規劃》中重點防控的重金屬之一，可以通過多種途徑進入人體引起神經毒性、腎臟毒性、生殖毒性、免疫毒性和胚胎發育毒性等多系統損傷。歷史上曾發生過多次水體汞污染突發事件，如20世紀50年代日本熊本縣的“水俁病”事件引發上百人死亡;20世紀80年代，由于化工企業含汞廢水偷排，我國松花江一些江段汞含量大幅超標;我國錦州灣五里河也曾發生嚴重的水體汞污染，河水汞含量超標最高達400余倍［7］。汞及其化合物的環境行為以及其引發的生態環境和健康問題，一直備受人們的廣泛關注，大量的調查研究表明，國內一些主要的河流、湖泊存在不同程度的汞污染［8-10］。因此，開展水體中突發汞污染生物預警技術研究，實現對突發污染事件的早期預報，可縮短應急響應時間，保障飲用水安全。

本文采用斑馬魚作為受試魚種，以無機汞為污染物，利用高速攝像跟蹤技術，通過對魚群游動行為和通訊行為等多項行為指標的實時監測，考察污染物對斑馬魚行為的毒性效應和該技術對汞突發水污染的預警效果，為基于魚類行為學的生物預警技術在水質突發污染事件中的應用提供基礎數據和分析方法。

1 材料與方法

1．1 試驗材料

試驗中所用斑馬魚購自國家斑馬魚資源中心(China Zebrafish Resource Center)，本實驗室飼養繁殖，養殖水溫為25℃ ±1℃，pH值為7．2～7．6，使用增氧泵持續曝氣，保證充足的溶解氧(近飽和水平)，光照黑暗比為10 h∶14 h，每天投喂1次，試驗前24 h不喂食，選取體長3 cm±0．2 cm的魚進行試驗。

試驗中所用藥品均為色譜純及以上。

1．2 試驗方法

1．2．1 斑馬魚急性毒性試驗

按照《水質 物質對淡水魚(斑馬魚)急性致死毒性的測定》(GB/T 13267—91)中的要求進行斑馬魚急性毒性試驗。

1．2．2 汞污染水體斑馬魚行為變化監測

采用流水式試驗(流速為2 L/h)開展汞污染水體斑馬魚行為變化的研究。以氯化汞配制汞污染水體(濃度以Hg2+計)，養殖用水為對照組，使用水質毒性生物監測儀(由深圳水務集團開天源自動化工程有限公司生產)對斑馬魚行為變化進行監測，該監測系統示意圖見圖1。5條監測用斑馬魚被置于尺寸為400 mm×75 mm×300 mm(長×寬×高)長方體測試箱內(材質為亞克力)，前置的CCD攝像實時跟蹤記錄每條魚的行為變化，并通過運動行為解析軟件計算斑馬魚的運動行為參數(游動速度、高度、轉彎次數、加速度)和通訊行為參數(平均距離、分散度)［11］。為避免生物鐘對斑馬魚行為的影響，所有批次試驗進行時間均為上午9:00至下午3:00，同時通過溫控裝置保持進水溫度恒定，排除水溫對斑馬魚行為的影響。

圖1 斑馬魚行為監測系統示意圖Fig．1 Experimental setup for behavioral measurement of zebrafish

1．2．3 數據分析

本文利用統計軟件SPSS21．0進行Probit模型線性回歸，計算得出各個作用時間下污染物對斑馬魚的半致死率LC50和95%的置信區間，并采用單因素方差分析法進行試驗組間數據的差異顯著性檢驗。

2 結果與討論

2．1 斑馬魚急性毒性試驗

通過斑馬魚的急性毒性試驗，獲取了Hg2+對斑馬魚不同暴露時間的半致死濃度(LC50)及其95%置信區間，見表1。由表1可見，試驗結果與黃毅、汪紅軍等的研究結果相似，其中黃毅［12］發現Hg2+對斑馬魚的LC50-24h為0．20 mg/L，汪紅軍等［13］研究表明Hg2+對斑馬魚的LC50-96h為0．14 mg/L，而本試驗Hg2+對斑馬魚的LC50-48h為0．19 mg/L。本文定義LC50-48h為1個毒性單位(1 TU)，并選取亞致死濃度劑量0．1 mg/L(國標限值的100倍，約0．5TU)進行后續的汞突發污染的模擬試驗。

表1 斑馬魚不同暴露時間的半致死濃度(LC50)及其95%置信區間Table 1 Hg2+concentrations causing 50%(LC50)of mortality on the tested zebrafish population after different time exposures with corresponding 95%confidence limits

2．2 汞污染水體斑馬魚行為變化

2．2．1 綜合評價指標

水質健康指數是由多項行為參數的監測數據計算得到的用于水質安全判定的一項綜合評價指標，其取值范圍為0～100，水質健康指數為60以上時表示水質正常，低于60時監測系統則報警。本試驗得到0．1 mg/L的汞污染水體中斑馬魚連續暴露6 h，其水質健康指數的變化情況見圖2。由圖2可見，根據監測系統推薦的報警限值，本試驗在0．1 mg/L的汞污染水體中斑馬魚連續暴露6 h，其水質健康指數與對照組相比變化不大，未發生報警。因此，需要對單項行為指標進行分析，以期找到對汞敏感性高的指標，從而縮短對突發事件的報警時間。

圖2 汞污染水體中水質健康指數的變化Fig．2 Changes of water quality index in Hg2+polluted waterbody

2．2．2 斑馬魚游動行為指標

圖3 汞污染水體中斑馬魚運動行為的變化Fig．3 Swimming activity changes of zebrafish under Hg2+exposure

表2 斑馬魚游動行為指標的差異性分析Table 2 Summary of statistical comparisons with behavioral endpoints under Hg2+exposure

正常水體中斑馬魚的游動速度、高度、轉彎次數、加速度保持相對穩定，本試驗得到0．1 mg/L的汞污染水體中斑馬魚連續暴露6 h，其運動行為的變化情況見圖3和表2。由圖3和表2可見，本試驗在0．1 mg/L的汞污染脅迫下，斑馬魚的游動速度經歷了一個先增大后恢復再減小的過程，表現出明顯的行為調節反應。暴露后短時間內斑馬魚的游動速度增大，第1個小時內試驗組游動速度平均值為41．00 mm/s，高于對照組的38．07 mm/s，此為水生生物對環境壓力所表現的“回避行為”，是魚類感知到污染物后的第一反應，其表現形式和維持時間長短受污染物的種類及濃度的影響，“回避行為”也被應用于水質監測和預警［14］;在暴露后的第2個小時，試驗組斑馬魚的游動速度與對照組相差不大，從第3個小時開始試驗組斑馬魚的游動速度逐漸減小，至暴露后的第5個小時試驗組斑馬魚的游動速度顯著低于對照組［見圖(a)和表2］。在Hg2+污染水體中，斑馬魚更傾向于在水箱頂部游動，游動高度在持續暴露下有明顯增大的趨勢，整個試驗中，對照組斑馬魚的每小時平均游動高度在94．96～132．62 mm之間，試驗組斑馬魚從暴露后的第3個小時開始，游動高度增大到250 mm以上，與對照組相比差異顯著［見圖3(b)和表2］;斑馬魚轉彎次數的變化與游動速度基本保持一致，只是試驗組與對照組斑馬魚的統計學差異出現在暴露后的第6個小時［見圖3(c)和表2］;而兩組魚的加速度變化無明顯的規律性［見圖3(d)和表2］，因此在后續的統計學分析中不再考慮此項指標。

2．2．3 斑馬魚通訊行為指標

Chew等［15］研究表明，正常水體中魚群的運動軌跡分布整齊且有規律，當環境改變時，魚群分布會發生變化，可作為監測外界環境壓力的有效指標。汞污染水體暴露中，斑馬魚感知到污染物存在后會有短暫的集群反應，魚之間的平均距離和分散度有明顯減小的現象。本試驗得到0．1 mg/L的汞污染水體中斑馬魚連續暴露6 h，其通訊行為的變化情況見圖4。由圖4可見，在暴露的前3 h，試驗組斑馬魚的平均距離和分散度與對照組相比顯著減小，3 h后逐漸恢復，與對照組相比無顯著性差異。

圖4 汞污染水體中斑馬魚通訊行為的變化Fig．4 Communication patterns of zebrafish under Hg2+exposure

3 結論與展望

(1)汞突發污染水體中，斑馬魚的游動速度短時間內增大，至暴露后的第2個小時恢復到暴露前的水平，之后游動速度逐漸下降，整個變化趨勢符合環境壓力模型。

(2)利用綜合評價指標水質健康指數進行水質預警，0．1 mg/L汞污染水體中6 h內未發生報警，而通過對斑馬魚游動行為和通訊行為等多項指標的分析，選取游動高度作為汞污染后的斑馬魚行為異常指標，可將預警時間縮短到3 h。

(3)探索不同種類污染物暴露下魚體更為靈敏的行為反應信號，獲取精確的分析數據并優化分析方法，在水質突發污染的初期及時做出預警并實現污染物的初步定性將是未來工作的重點。

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Technology of Behavior-based Biological Warning of Sudden Mercury Pollution in Water

LU Nannan1，SUN Shaohua1，SONG Wuchang1，DU Juanjuan2，JIA Ruibao1
(1．Shandong Province City Water and Drainage Water Quality Monitoring Center，Jinan250021，China;2．School of Municipal and Environmental Engineering，Shandong Jianzhu University，Jinan250101，China)

In view of the present situation that early warining of sudden water pollution is difficult，this paper simulates sudden mercury pollution to conduct the research on biological early warning technology based on fish behavior．Based on the behavior changes of zebrafish in normal water，the paper captures and analyzes the swimming behaviors(swimming speed，swimming depth，turning frequency and accelerated speed)and fish school behaviors (average distance，dispersion)of zebrafish under 0．1mg/L mercury exposure by high-speed photography tracking technology．The results show that early warning of mercury pollution could not be identified in six hours by comprehensive evaluation index，namely，water quality health index．By taking the swimming height as the monitoring indicator for sudden mercury pollution of waterbody，early warning time could be shortened to three hours．

mercury;sudden water pollution;zebrafish;behavioral change;biological warning technology

X52;X17

ADOI:10．13578/j．cnki．issn．1671-1556．2016．05．011

1671-1556(2016)05-0069-04

賈瑞寶(1968—)，男，博士，研究員，主要從事飲用水安全保障領域的關鍵技術研發和工程應用研究。E-mail:jiaruibao68@ 126．com

2016-03-11

2016-03-31

山東省自然科學基金項目(ZR2014CP019);國家水體污染控制與治理科技重大專項項目(2012ZX07404-003);直飲水科技惠民示范工程項目(2013GS370202)

逯南南(1984—)，女，碩士，工程師，主要從事飲用水安全保障方面的研究。E-mail:nanwang316@163．com