MST與水環境生物源污染定量化溯源

郭　萍，李紅娜，李　峰（中國農業科學院農業環境與可持續發展研究所清潔流域團隊，北京100081）

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MST與水環境生物源污染定量化溯源

郭萍，李紅娜，李峰
（中國農業科學院農業環境與可持續發展研究所清潔流域團隊，北京100081）

摘要：微生物溯源技術（Microbial source tracking，MST）通過靶標生物標記定位污染來源，為難以確定污染來源的非點源生物源污染監測提供了技術手段。基于微生物溯源技術從定性到定量化的發展歷程，介紹了MST技術的產生、發展與特點以及MST在水環境污染監測與管理中的應用；重點論述了擬桿菌（Bacteroides spp.）基因標記水環境定量化溯源的研究進展，集中分析了溫度、光照、鹽度等環境因子對擬桿菌基因標記環境衰變的影響以及環境因子與定量化溯源結果準確性的相關關系，并據此判定環境生物因子可能對基因標記環境衰變結果存在一定的影響。依據目前定量溯源研究與應用現狀，提出了提高擬桿菌定量溯源準確性和廣泛性的研究重點和應用前景。

關鍵詞：微生物溯源技術；生物源污染；定量化溯源

郭萍，李紅娜，李峰. MST與水環境生物源污染定量化溯源[J].農業環境科學學報, 2016, 35（2）：205-211.

生物源污染包括養殖場廢水和生活污水，由于這類廢水中的糞尿污染物攜帶大量的腸道微生物，具備了微生物溯源的可行性。由于眾多的生物污染源具有非點源排放的特性，通過目標污染環境其他非生物成分很難準確定位污染源，給污染管理和治理工作造成了一定的難度。微生物溯源技術（MST）以其無需對污染物人為標識、污染源分類定位快速而引起研究者極大的興趣，21世紀以來，美國、加拿大、澳大利亞、日本及歐盟部分發達國家紛紛開展了利用微生物溯源技術監測水體生物源污染的研究和應用工作，并逐漸提高污染檢測的定量化水平，為水環境污染管理和疾病防治提供了科學依據[1-8]。我國近幾年也開始了相關的研究工作，并在方法的適宜性研究與應用方面取得了一定的進展。

本文梳理了微生物溯源技術從起源、定性到定量化的發展，重點論述了定量化溯源指示微生物擬桿菌及其水環境定量化溯源的研究進展。擬桿菌作為主要的腸道微生物菌群，以其環境的不可繁殖性和較強的宿主鑒別能力成為定量化溯源的研究重點。針對目前擬桿菌定量化溯源的研究結果與進展，提出深入全面研究其他污染指標、環境因子與定量化檢測結果的相關關系，提高定量化檢測與溯源結果的準確性，將有助于微生物溯源技術在環境尤其是水環境定量化溯源中更廣泛的應用。

1　 MST技術起源與發展

1.1 MST技術起源

MST技術最早產生于水體糞便污染樣品的診斷。20世紀60年代末70年代初有學者提出以糞大腸菌群（Fecal coliform，FC）和糞鏈球菌（Fecal streptococ cus，FS）的比例區分人類和其他動物源糞便污染，兩者比例大于4（FC/FS＞4）確定為人源的污染，小于0.7 （FC/FS＜0.7）確認為其他動物源的污染[9-10]。90年代研究細化了其他動物源污染，提出當FC/FS＞4時可以認為是人源糞便污染，0.1＜FC/FS＜0.6是畜禽養殖排泄物造成的污染，而當FC/FS＜0.1時則認為是野生動物糞便污染[11]。但也有研究發現這種方法得到的結果并不能完全準確診斷污染源，因為糞大腸桿菌和糞鏈球菌的生長速率和生存能力不同，兩者的比率會隨著體外存續時間的延長而發生變化[12-13]。因此，美國公共健康協會（American Public Health Association，APHA）便不再推薦以FC/FS的比率來區分人類和動物來源的糞便污染。如何篩選到有效的生物標記并建立生物源污染診斷的適宜方法再次激發了人們的研究興趣。

1.2 MST技術發展

篩選MST微生物宿主特異性生物標記的廣泛研究始于20世紀80年代[14-16]，Scott等[17]提出理想指示微生物應該具備能夠反映水體污染情況、不是致病菌、能夠快速檢出、容易計數、和致病菌存在較密切聯系、非目標環境土著微生物等特點，并據此建立了指示微生物的篩選標準。篩選出的微生物包括大腸菌群（Total coliforms）、糞大腸菌群（Fecal coliforms）、大腸桿菌（E. coli）和腸球菌（Enterococci）這類溫血動物腸道及糞便中普遍存在的細菌，研究與應用最多的當屬大腸桿菌和腸球菌，這類細菌的監測結果可以作為環境樣品是否受到生物源污染的判別依據。

研究結果認為定量化溯源指示微生物應符合以下條件：（1）只存在于靶標污染源中，即宿主特異性標準；（2）靶標污染源中的濃度或者含量要足夠多，即檢測靈敏度標準；（3）已知不同污染源生物標記的環境存續性和增殖能力，即定量分析的可比性標準[2]。

擬桿菌（Bacteroides spp.）在眾多的候選指示菌中受到了更多的關注，并成為定量化溯源研究的主要指示微生物。擬桿菌作為腸道中的主要厭氧菌群，具有數量眾多，在環境中不可繁殖，同時具有較高分類水平的宿主特異性基因標記，因此以擬桿菌特異性生物標記為基礎的定性與定量溯源技術得到了快速發展[36-37]。Bernhard和Field[3]最先在MST技術中利用了擬桿菌特異性生物標記。目前針對人、雞、狗、加拿大雁、馬、反芻動物和豬糞便的溯源方法已經先后建立并應用到實際的水環境監測中[38-47]。王顯貴等[48]建立了qPCR定量檢測模擬水體中豬源擬桿菌特異性生物標記的方法，以宿主特異性引物定量識別檢測水體中豬源擬桿菌16S rRNA基因拷貝數，從而確定豬源擬桿菌污染量，以進一步明確水體受豬場廢水污染的程度。該方法以混合污水進行試驗時，表現出了很好的特異性，能夠排除其他寄主來源擬桿菌的干擾。

當然，即使不依賴培養建庫的生物標記也具有一定的時空差異[49]，所以更好地了解基因標記的環境持續性、時空變異性、基因標記與其他污染指標的定量關系顯得尤為重要，這也成為近幾年和今后的研究重點。

2　 MST水環境生物源污染監測

絕大多數水體對生物源污染非常敏感，因為生物源污染不僅能通過娛樂水體和飲用水引起人類疾病，而且能破壞水體生態環境產生富營養化、引起水生生物毒害。目前，重金屬和抗生素也成為我國生物源污染的威脅。因此利用MST明確水體生物源污染來源和污染貢獻率對于水環境污染治理和病害防治方法的建立非常關鍵。

2.1 MST與其他污染指標的相關性

MST在國外主要用于娛樂水質監測、健康和最大污染負荷管理，主要針對水環境中與人類健康相關的致病微生物[1，50-52]，研究熱點集中在一些與致病微生物或某些病癥關系相對比較清楚的指示微生物，例如大腸桿菌和腸球菌等。但是隨著對病原菌與指示微生物關系的深入研究，也出現了不同程度的分歧，大部分結果認為它們之間存在相關性[53]，但也有研究者認為它們之間不存在相關性或相關性很低[6，38，54]。研究結果的差異與所選擇的指示微生物生物標記和環境條件都有一定的關系，為提高結果的可靠性和準確率，在實際應用中應結合環境條件進行多標記印證。

盡管生物源污染緊密伴隨著富營養化和水生生物毒害，但是目前生物標記與生物源污染相關的氮、磷、重金屬和抗生素等的相關性研究和應用仍然比較少。Weidhaas等[55]以短桿菌（Brevibacterium sp.）LA35基因為家禽糞便生物標記，通過qPCR技術確定了該生物標記與家禽糞便、徑流、地表水和地下水中糞便指示微生物和重金屬的相關性，并且發現該生物標記拷貝數與大腸桿菌、腸球菌、砷、銅、磷和鋅的濃度有共變關系，因為只要在能夠檢出該生物標記的徑流樣品中，指示微生物和砷、銅、磷、鋅的濃度也較沒有檢出生物標記的樣品中高。目前國內未見利用微生物對水體中相關指標進行溯源的研究報道。盡管氮磷是生物源污染的主要成分，但尚未見應用微生物溯源技術對水體中氮磷富營養化物質進行溯源的報道。

無論如何，要明確水環境生物源其他監測指標與指示微生物生物標記的相關性，生物標記在環境因子影響下定量檢出的準確性是進一步研究的關鍵。

綜上，分析兩罪犯罪構成要件的不同之處，我們很容易將二者區分，并清晰探知嫖宿幼女罪在刑法分則中所處位置的意義，它與強奸罪有重合部分，但又各司其職，屬于特別法與一般法的關系。

2.2擬桿菌與水環境污染定量化溯源

擬桿菌是水環境定量化溯源研究與應用相對集中的指示菌，目前應用研究的關注點主要集中在擬桿菌環境存續性和衰變方面。盡管目前建立了許多人類和動物糞便的基因特異性標記，但由于基因標記的環境持續性差異，雖然在定性層面上的研究結果相對比較一致，但是不同地理區域的定量溯源結果差異相對比較大。即使同一地區，如果對于擬桿菌基因標記水環境衰變機制不十分清楚，也可影響擬桿菌基因標記定量溯源技術在實際水環境的應用效果[56-58]。由于擬桿菌在環境中的不可繁殖性，其基因標記環境持續性的本質就是擬桿菌基因標記在水環境中的衰退，尤其是在生物因子和非生物因子交互作用影響下的衰退。目前相關性的研究報道主要集中在水環境非生物因子對指示菌和特異性基因標記衰變速率的影響方面[7，37，49，59-61]，且研究結果也不盡相同，有的甚至截然相反。

有研究認為不同寄主來源的擬桿菌基因標記的環境行為趨勢一致，其中以溫度與基因標記環境存續量的負相關關系最為一致[48，62-64]，盡管不同的研究結果在二者的相關程度上有差異，但并不影響相關結論的一致性。而與基因標記環境存續量相關的其他環境因子的研究結果卻不盡相同，有的甚至完全相反，比如鹽度、光照對擬桿菌基因標記持續性的影響、擬桿菌基因標記與活菌細胞和可培養菌群的相對衰變速率等。

Marti等[42]認為水中的溶解氧和溫度都對豬源宿主特異性擬桿菌生物標記的穩定性影響較大。Okabe 等[7]研究結果表明寄主特異性基因標記在不同鹽度水體中的行為特征沒有差異，只與溫度相關。Okabe以可培養脆弱擬桿菌作為擬桿菌參照，研究了擬桿菌人源特異性基因標記Human-Bac1、豬源特異性基因標記Pig-Bac2、牛源特異性基因標記Cow-Bac2等在不同的溫度和鹽度水環境條件下的衰變行為，在低溫（4℃）高鹽（海水）的環境中存續時間較高溫（30℃）低鹽（淡水）下的持續時間長，同時基因標記與活菌的衰變速率無差異，明顯低于可培養大腸菌群和脆弱擬桿菌的衰變速率。Bae等[63，65-66]利用加入PMA（疊氮溴化丙錠，Propidium monoazide）和不加入PMA提取DNA，研究了擬桿菌活細胞與基因標記的衰變，結果表明基因標記的持續時間（177 h）遠高于活細胞（28 h），并且在海水中的衰變速率要快于淡水。Okabe與Bae關于基因標記與活菌衰變速率研究結果的差異來源于二者選用的方法和參照活菌體系不同，Bae以與基因標記相同的活菌作為比較對象，加入非活菌DNA檢出抑制劑PMA，研究結果較以可培養活菌作參照更接近實際情況。

Walters等[67]分別以DNA和cDNA為模板的qPCR （quantitative PCR）和RTPCR（real-time PCR）方法檢測了擬桿菌基因標記和擬桿菌細胞的持續性，認為基因標記的衰變快于活菌細胞，兩者均快于大腸桿菌和腸球菌等指示菌，與Okabe和Bae的研究結果都不相同，可能與所選擇的基因標記和檢測方法不同有關，但基因標記的衰變快于或者高于活細胞的結論有待進一步的研究印證。同時Walters等的研究結果認為光照對基因標記沒有影響，而高溫（30℃）環境下的衰變速率遠高于低溫（4℃）環境，進一步為基因標記與溫度負相關的研究結論提供了支撐。Dick等[59]以污水構建擬桿菌通用基因標記AIIBac、人基因標記BacH、HF183及大腸桿菌的環境衰退速率研究體系，認為在恒定的溫度（15℃）下，不同光照、底泥等環境因子的處理效果沒有顯著差異，但基因標記都會出現比較快速的衰變，明顯高于大腸桿菌，與Walters等的研究結果相一致。Tambalo等[68]采用0.45 μm微孔濾膜過濾水樣提取DNA研究了基因標記的環境衰變，結果表明人擬桿菌基因標記BacH、反芻動物基因標記BacR、牛特異性基因標記CowM2等在自然水環境中衰減99%的時間少于8 d，明顯快于大腸桿菌15 d以上的衰減期，同樣得出了基因標記衰變速率快于大腸桿菌等指示菌的結論。這一結果與大腸桿菌的環境可繁殖性不無關系。

Ekaterina等[69]利用0.2 μm濾膜過濾水體提取DNA，研究了人基因標記BacH和反芻動物基因標記BacR在水環境中遷移和衰變特征，認為各基因標記之間無差異，溫度是影響衰變的關鍵因子，基因標記的衰退速率與溫度成正比，但不受光照的影響，并且基因標記相對于總大腸菌群和腸球菌的衰變沒有顯著差異。其他的研究結果既有支持光照不會影響基因標記衰變的觀點[59，63，67，70]，也有支持基因標記在光照條件下較黑暗條件下衰退更快的觀點[61-62]。光照影響擬桿菌基因標記和擬桿菌衰變的不同結論，以及擬桿菌活菌和基因標記衰減相對快慢的不同結論差異，可能與研究體系中的其他生物因子相關，而關于其他生物因子如何在不同環境條件下影響了基因標記衰變的研究相對較少。

目前關于生物因子對擬桿菌和擬桿菌基因標記衰變和持續性的影響也有一些初步的研究報道。Kreader[71]認為溫度是影響擬桿菌基因標記環境持續性的關鍵因子，并提出原生生物捕食也是重要的影響因素，證據就是當地表水用放線菌酮-真核生物抑制劑和0.45 μm濾膜過濾處理后，其中擬桿菌基因標記的持續周期會明顯延長，由此推斷擬桿菌基因衰變可能與真核生物的捕食相關。Kobayashi等[72]以18S rRNA監測水體中各種原生動物也得到了同樣的結果。有些研究也在擬桿菌基因標記衰變與其他生物捕食相關方面給出了一些推斷性結論[8，61，70]。盡管以上的研究結果為生物因子和非生物因子對基因標記環境持續性或者衰退的影響提供了一些證據，但生物因子對基因標記衰變的影響仍然有待深入，尤其是生物因子與非生物因子的互作機制，及其對基因標記環境衰變的影響機制都還是未知數。

國內在水環境微生物溯源監測方法和應用方面也做了初步探索研究，馮廣達[73-74]和張曦[75]等應用大腸桿菌和擬桿菌的相關基因標記分析了水源和飲用水的污染路徑，并證明了水源周邊的養豬場是造成水源和飲用水污染的重要污染源；馮雯雯[76]應用腸球菌的抗生素抗性對近海岸水域的污染源進行了比對分析，明確了在不同污染源分類水平下溯源結果的準確率。

2.3 MST技術發展前景

微生物溯源技術作為一種新興的環境監測手段以其環境友好性、監測源廣泛、靈敏度高、樣品需求量少等優點展示了很好的發展前景。在實際應用中要考慮以下幾點：

（1）適宜技術的選擇：利用微生物進行溯源時要結合自己的目的和所具備的條件、實驗要求等多方面因素選擇合適的溯源技術。此外多種溯源技術結合使用，相互驗證能夠提高實驗結果的可信度。

（2）環境參數的綜合考慮：因為目前的研究結果還難以給出明確的環境應用參數，所以要建立應用范圍廣、結果準確可信、成本低、省時省力的環境應用溯源技術還需進一步深入研究基因標記與環境參數的相關性，不斷完善檢測的靈敏度和準確性，提高診斷結果的準確性。

（3）提高定量化水平：微生物溯源技術雖然被廣泛應用到水環境監測中，所反映的信息仍然在“水體是否被污染與被什么污染”這個層面上，而“不同污染源的貢獻率”信息很少，所以定量化的MST技術有待進一步的發展和應用。

（4）提高MST的信息量：目前的微生物溯源技術主要是針對水體中致病微生物的監測，對水體中的有毒有害物質和氮磷有機物等溯源監測的研究幾乎沒有開展，因此開展利用生物溯源技術對水體中的有毒有害物質和氮磷有機物等監測溯源的研究具有很大的發展空間。

總體來說，我國微生物溯源研究和應用工作開展較晚，技術相對落后，大多處于定性化水平，加強微生物溯源有關的研究和應用工作，可加快微生物溯源技術在我國水體污染定位中的應用，豐富我國水污染監測手段，提高水污染管理效率。

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Microbial source tracking（MST）and quantitative tracking of biological fecal contamination in water environment

GUO Ping, LI Hong-na, LI Feng
（Agricultural Clean Watershed Research Group, Institute of Environment and Sustainable Development in Agriculture, Beijing 100081, China）

Abstract：Microbial source tracking（MST）provides an accessible method for tracking the non-point contamination from biological sources, for it allows practitioners to discriminate among many possible sources of fecal contamination in the environmental waters by identifying the target biomarkers. In this paper, the origin, development process from qualitative to quantitative, characteristics and environmental applications of MST technology were briefly reviewed. The screening criteria of microbes as indicators were developed. Bacteroides spp. as one of the accepted indicators showed some advantages in quantitative MST because this microbe couldn't reproduce in vitro environment according to the criteria. The research on quantitative source tracking with Bacteroides spp. gene marker under different conditions has made a great progress. The research has been focused on the development of Bacteroides spp. gene-markers and their application to contamination source tracking at a quantitative level in water environment. The effects of environmental factors such as light, dark, temperature etc. on the decay of gene marks, and the correlation between gene-marker decay rate and different environmental factors were analyzed. The reported literatures showed that biological factors in the vitro environment greatly impact the MST technique. Improvements of accuracy and application scope of MST in the water environment were proposed.

Keywords：microbial source tracking（MST）; biological-source contamination; quantitative source tracking

作者簡介：郭萍（1967—），博士，研究員，主要從事環境污染與修復方面的研究工作。E-mail：pingguo120@hotmail.com

基金項目：國家科技重大專項“水體污染控制與治理”（2008ZX07425-002）

收稿日期：2015-08-07

中圖分類號：X52

文獻標志碼：A

文章編號：1672-2043（2016）02-0205-07

doi:10.11654/jaes.2016.02.001