DNA條形碼技術在肉及其制品中的應用

姜　帥,陳　倩,孔保華

(東北農業(yè)大學食品學院,黑龍江哈爾濱 150030)

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DNA條形碼技術在肉及其制品中的應用

姜帥,陳倩,孔保華*

(東北農業(yè)大學食品學院,黑龍江哈爾濱 150030)

DNA條形碼技術作為一種新的分子生物學檢測技術在鑒定和區(qū)分各物種和物種間親緣關系方面得到了廣泛應用,該技術能實現對肉的快速、準確檢測。DNA條形碼已成為生物學領域發(fā)展最迅速的一種技術,該技術基于廣泛的物種基因數據庫信息,在肉品研究中具有良好的應用前景。本文簡述DNA條形碼技術的基本原理,并基于DNA水平上與其他相關技術進行比較,綜述其在物種鑒定、肉品質量安全、商業(yè)欺詐等方面的應用,并對該技術在今后肉品科學研究中的應用進行展望。

DNA條形碼,肉品科學,物種鑒定,質量安全

條形碼技術是實現銷售時點信息系統(POS系統)、電子數據交換(EDI)、電子商務及供應鏈管理的技術基礎,是在計算機應用基礎上產生和發(fā)展的一種可以自動識別的鑒定技術,可實現對信息的自動掃描,能夠有效、快速準確的采集數據。同黑白相間的商品條形碼相似,Hebert[1]于2003年在生物學領域提出來的“DNA條形碼”也用于”身份識別”,只不過DNA條形碼技術是基于DNA水平上存在于動植物和微生物中。DNA條形碼與其他的分子測序技術相比,優(yōu)點在于擴大了應用范圍和提高了標準化水平。本文從DNA條形碼技術的原理出發(fā),介紹其在肉品物種鑒定中的應用,分析比較其與其他生物分子測序技術的優(yōu)劣,對DNA條形碼技術未來進一步的創(chuàng)新和發(fā)展提供依據。

1　DNA條形碼技術原理

DNA條形碼技術主要是指一段能夠代表本物種的、有足夠變異的、標準的、易擴增且相對較短的DNA片段,利用腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和鳥嘌呤(G)4個堿基在基因中的排列順序來識別物種,與DNA條形碼數據庫的基因進行比較能夠準確的鑒定區(qū)分各物種和物種間親緣關系。DNA條形碼以分子生物學為基礎,選擇能夠擴增絕大多數的動物物種的線粒體基因為目的基因[2],進行基因擴增和測序。線粒體基因由于是母系遺傳的單倍體,沒有內含子,沒有等位基因重組,且比核基因進化速度快,為最佳的DNA鑒定目標。對于大多數動物物種提取線粒體DNA上的一段蛋白質編碼基因長度650堿基對(bp)的區(qū)域編碼細胞色素C氧化酶亞基I(Cytochrome oxidase subunit I,COI),該DNA序列變異性大、易擴增、相對保守、具有系統進化信息,采用聚合酶鏈式反應(PCR)特異性擴增COI基因序列并進行測序。比對條形碼數據庫BOLD或者GentBank里的基因信息[1],利用DNAstar、DNAMAN等軟件對線粒體COI基因序列進行分析,計算不同物種的堿基組成及種間遺傳距離和種內遺傳距離,不同物種的種間距離明顯大于種內距離,分別利用鄰接法和最大簡約法繪制系統進化樹,在系統發(fā)育樹中,推測具有一定相關性的個體聚集在一起,系統發(fā)生樹的特征在于通過特性相關的個體聚集成簇推斷其為同一物種,從而與其他物種區(qū)別開,并且每個簇被假定為代表一個獨立的物種,根據同源性關系,從而確定生物標本。DNA條碼已成功地用于鑒定食品中的物種,包括肉類和海鮮[3],在食品認證和食品追溯中有著廣泛的應用。

2　DNA條形碼技術在肉品物種鑒別中的應用

DNA條形碼技術的最大優(yōu)勢在于能實現分子數據的快速采集。基于形態(tài)學特征鑒別物種耗時且許多情況下如在親緣物種間的鑒定也是不準確的,在要求精確度較高的一些情況必須采用基于分子生物學水平上的鑒定。首先,在受損傷不完整的生物體中,基于器官或者組織(如貨物,食品和胃提取物)的基因片段來鑒別生物類別,DNA條形碼成為食品工業(yè)、法醫(yī)科學、防止非法貿易及偷獵和保護瀕危物種(如漁業(yè)、樹木和森林)中的重要工具。其次,由于生物生長發(fā)育的各個時期的外觀形態(tài)不同,常用的檢測方法難以將其很好的區(qū)分,可能將處于幼齡期和處于成熟期的同一物種未匹配及一些隱形物種(cryptic species,形態(tài)相近而難以鑒別)造成混淆,而DNA條形碼能很好地解決具有多態(tài)性生命周期或者有顯著表觀性差異的物種。

2.1DNA條形碼技術在海洋魚類中的應用

DNA條形碼成功的應用到魚類及魚肉類制品,為確保海鮮產品的安全性、真實性和質量,歐洲食品法律對從捕魚船只或者水產養(yǎng)殖廠到消費者餐桌整個食品鏈,實施質量管理和加工產業(yè)鏈控制的原則[4]。保證產品真實性對消費者健康方面有著重要的意義,特別是針對含有物種特異性過敏原的魚類[5-6],這些魚類大多來自歐洲以外的一些地區(qū),可能是由于對污染水域缺乏控制[7],導致魚體內的病原體和重金屬積累。甲基汞中毒主要由于魚的食用,這種金屬的生物鏈積累可能會增加人心肌梗死和神經損傷的風險[7],消費者必須通過權威的食品認證來進行食品消費,否則可能會影響信教者的宗教習俗,例如,鯰魚魚片可能被當成價值較高的鱘魚來銷售,這也會增加穆斯林誤食教規(guī)禁食肉類的風險[8]。

目前市場上的加工或者預處理的魚類產品，尤其是當形態(tài)特征已被刪除時很難進行鑒定,海鮮標簽必須包括商業(yè)名稱、學名、地理區(qū)域、制造方法以及作為產品是否先前已經凍結。根據物種間的序列相似關系,DNA條形碼技術可將海產品鑒定到種屬水平。Wong[9]等對市場上的海產品進行檢測,發(fā)現隨著物種DNA數據庫的不斷完善和檢測技術的不斷發(fā)展,物種匹配度已達到97%以上,產品與標簽不符率約為25%。基于食用魚肉制品的可追溯性,DNA條形碼將成為法醫(yī)鑒定的有利工具[10]。線粒體的COX1區(qū)域基于物種特異性和種間距離的差異能夠很好的區(qū)分魚類(98%的海洋物種和93%的淡水物種能夠被成功鑒定)[11]。

李新光等[12]用DNA條形碼技術對市場上的凍鱈魚片和烤魚片樣品進行鑒定,結果表明市場上的凍鱈魚片存在將“白鱈魚”標識為價格較低的“銀鱈魚”的現象;烤魚片樣品與其標簽存在一半以上的不符,其中還有黑鰓兔頭鲀等體內含有毒素的魚類,可造成人體中毒情況。用COI序列的相似度將不同品種的鱈魚與其易混淆魚進行區(qū)分。Ward等[13]用COI基因中的655 bp片段對北大西洋、地中海和澳大利亞南部海域的魚類進行比較,除海魴(Zeus faber)和大西洋叉尾帶魚(Lepidopus caudatus)有明顯的種內差異及可能存在隱存種外,其它87%的魚類種內差異都很小。緯度差異會導致北極地區(qū)鮭科魚類依據形態(tài)難以辨別,同一物種生長發(fā)育的不同階段也難以區(qū)分。Filonzi等[7]用DNA條形碼技術對市場上魚類的COI基因和細胞色素b(Cyt b)基因進行直接測序,結果表明32%的樣品與標簽不符,這些替代的物種中有26%的樣品存在著嚴重的商品欺詐,主要由來自非洲尼羅的羅非魚取代地中海石斑魚。王敏[14]等應用DNA條形碼技術鑒別深圳批發(fā)市場和超市零售魚肉制品的種類來源,判別其產品標簽是否正確。本研究調查的77份魚肉制品均能擴增出特異性條帶,經過列比對后相似度均在98%以上,28份樣品與產品標簽標示不符,“錯貼”率高達36.36%,其中所有標示“龍俐魚”的商品都是低價的“巴丁魚”。說明DNA條形碼技術可以精準地對各種凍魚、魚片以及魚柳樣品進行鑒定,可用于魚肉制品的來源物種鑒定。DNA條形在海鮮食品中得到廣泛的應用,主要是海鮮物種的數量較高,比其他物種更喜歡聚居,特別是在深加工食品中,傳統的鑒定方法鑒別困難,基于DNA的分子鑒定可以有效的鑒別不同物種。

2.2DNA條形碼技術在鑒別摻假肉制品中的應用

野味因具有低脂肪、低膽固醇、高蛋白、味道鮮美和口感好等特點[15]消費量一直在增加,其在商業(yè)市場中有著極高的經濟價值,錯貼標簽的情況時有發(fā)生,可能是許多不法商家為謀取經濟利益將較低價值的肉混入到較高價值的野生肉中進行的商業(yè)欺詐,肉產品在屠宰、加工、運輸過程中處理不當造成的交叉污染,跨物種雜交物種性狀相似度極高造成的DNA的鑒別困難,野牛肉和牦牛肉[16]制品就存在這樣的情況。

Charles等[17]對美國市場上的肉制品的細胞色素C氧化酶亞基I的658堿基對進行鑒定,與BOLD和GenBank生命條形碼數據庫進行比對,研究表明18.5%的樣品存在錯貼標簽的可能,確定有9.3%的樣品非法的含有受保護的瀕臨滅絕的物種[18]。類似于以前對美國和土耳其的非野生肉類產品(包括香腸、碎肉、肉丸、腌肉和干肉制品等)進行調查,其中報告貼錯標簽率分別為16.6%[19]和22.0%[20]。研究發(fā)現貼錯標簽可能是由于缺少市場的產品監(jiān)控,商家追求高利率而在產品中摻假。相比海鮮,肉制品貼錯標簽在目前的研究比率低于北美Wong[9]報道的25.3%海鮮制品。

消費者用食品標簽來幫助他們選擇想要的產品,不論是出于宗教目的(標明清真食品認證標記則不含有豬肉)、是否含有過敏原、食品安全、還是公平貿易的原因,消費者都有權利了解自己所購買的產品是否符合要求、以及自己是否受到商業(yè)欺詐。在南非的一個研究測試加工肉制品中發(fā)現,68%含有的物種的樣品并沒有在包裝標簽上聲明[21]。此外,歐洲的摻假馬肉丑聞,聯合國宣布在產品標記為100%的牛肉中發(fā)現摻假馬肉并且含有馬肉的產品占61%[22]。這并不是無意的由于加工設備處理造成的交叉污染或者是屠宰運輸過程中的偶然情況,而是明顯的商業(yè)欺詐行為。同樣,在愛爾蘭調查測試多個牛肉漢堡、碎牛肉產品和意大利臘腸,發(fā)現37%的產品包含未申報的馬肉和85%的產品包含未標明的豬肉[23]。當然如果樣品與實際標簽存在少量不符,也不排除只是偶然,在碎肉中常見的多個物種的存在,實際表明,有極大的可能性是由于這些零售商在加工出售各物種的肉制品時共用一臺設備,未及時處理適當的清潔樣品設施所造成的交叉污染[20]。

Kane等[24]通過在線肉類分銷商獲得標簽來自于澳大利亞標記為袋鼠的混合品種樣品,與GenBank進行比較,結果顯示與西部灰袋鼠遺傳相似度為96%。實時熒光定量PCR表明樣品中混合有牛肉、牛肉與袋鼠肉。袋鼠碎肉制品價格為牛肉的二倍,很可能是商家用價格相對低廉的牛肉替代昂貴的袋鼠肉而獲得高的利潤。Kane運用DNA條形碼和實時PCR結合技術對美國市場在售的碎肉制品進行鑒定,結果顯示21%的樣品存在錯標現象,其中一個樣品和標簽完全不符,碎肉制品中包含有牛肉、羊肉、火雞肉、豬肉和美國禁止食用的馬肉;從樣品的購買渠道看,從當地肉品經銷商那購買的樣品錯標率達18%,當地超市的錯標率僅為5.8%,而從網上零售商購得的樣品錯標率達35%。由此不難看出,商品的購買渠道越正規(guī)出現的錯標現象就越少,也說明了在食品市場中食品溯源對于食品認證的重要性。

DNA條形碼技術也應用于設計簡單的教學實驗,謝莉萍[25]等用PCR擴增從樣品中提取的DNA片段,再結合瓊脂糖凝膠電泳進行分離鑒定,根據DNA分子量的大小與Genbank數據庫信息進行測序比對,從而快速鑒定出肉品成分。

3　基于DNA分子水平上鑒定肉及肉制品的其他方法

基于DNA的檢測技術應用最廣最普遍,優(yōu)勢在于DNA分子較穩(wěn)定,能耐壓耐熱,序列保守性強,能夠用于加工產品的檢測。主要有限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(PCR-RFLP)、實時定量熒光PCR(Real-time PCR)、多重引物PCR(Multiplex PCR)和變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)等。

變性梯度凝膠電泳技術具有分辨率高、加樣量小、重復性好、節(jié)約時間等優(yōu)點,被用于微生物等領域分類鑒定。梁慧珍等[26]用提取線粒體中的16S rRNA基因進行PCR擴增,構建DGGE鑒定參考階梯,通過豬牛羊及雞鴨鵝各種DNA擴增條帶在凝膠中遷移不同距離而被清晰分開。但電泳圖中條帶易受DNA濃度和PCR延長反應程度[27]的影響,可能需要進行TA克隆測序。

實時熒光定量PCR技術結合光譜技術的高精確定量、PCR高靈敏性和DNA雜交的高特異性優(yōu)點,直接探測PCR中熒光信號的變化,對特定區(qū)段擴增產物進行定量分析,不需電泳或PCR后處理步驟。朱燕等[28]用實時熒光定量PCR技術研究中國黃牛背最長肌中capnl mRNA表達量與宰后3 d的牛肉嫩度相關性。然而,實時PCR測定具有比常規(guī)PCR使用更昂貴物種特異性引物和探針的缺點[29],昂貴的儀器設備和受過訓練的專業(yè)人士也限制了該技術的使用[30]。

Safdar等[31]運用多重PCR技術,對市場上的牛、綿羊、山羊和魚類肉用飼料同時進行篩選,對飼料樣品的熱處理和殺菌條件進行評價,每個物種檢測限為0.01%。Kitpipit等[32]選擇細胞色素c氧化酶I(COI),以及12S rRNA基因運用多重PCR技術進行引物設計,能同時識別豬肉、羊肉等六種常用食用的肉類品種。該方法能同時測定多個物種,經濟快速、可重復性好且特異性高。

4　DNA條形碼技術在應用中存在的問題

DNA條碼技術能夠提供規(guī)范的物種鑒別方法,但仍存在一定的局限性,僅適用于肉類成分單一、加工條件比較溫和的肉制品的鑒別[3]。肉制品在加工過程中的高溫高壓、滅菌、酸堿度的改變等條件可引起樣品模板DNA的斷鏈或降解,用PCR擴增DNA片段時增加不同肉類品種交叉反應的可能性[33],并且許多制品中還加入油、鹽及各種添加劑,導致DNA提取率降低或者抑制PCR反應,影響DNA鑒定物種的準確性[34]。在這些情況下,常規(guī)的方法主要有物種特異性PCR技術、多重PCR技術、實時熒光定量PCR技術等,與DNA條形碼技術相結合可以克服僅能識別單一物種的缺陷,在鑒定領域也取得了廣泛的應用。此外,DNA條形碼技術還可以和形態(tài)學、生態(tài)學等其他特征結合使用[35-36]。

5　展望

DNA標記可檢測有機材料中的微量成分,可檢測生物中低濃度低含量的摻假物的存在,DNA分子標記和基于PCR的方法已迅速成為食品監(jiān)管領域最常用的工具,這些非連續(xù)的分子標記物如隨機擴增多態(tài)性DNA(RAPD)標記、擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)標記。DNA條形碼在植物中也有著廣泛的應用,主要是在中草藥資源鑒定、生態(tài)學鑒定、法醫(yī)鑒定等方面,DNA條形碼在微生物領域也展開研究,尤其是在真菌類群上[37]。應用DNA條形碼技術增加對物種關系、種屬界限的認識,對社區(qū)生態(tài)進程和網絡框架進行評估,對生物多樣性開展有效保護及發(fā)現新物種或隱存種等。此外,地方和國家支持DNA條形碼對瀕危物種和商業(yè)用途的動植物的鑒定。DNA條形碼也能為刑事案件、自然災害和人為災害提供有用的依據。DNA條碼技術利用先進的電子信息技術和遺傳學技術,將更快速、低廉地鑒別已知的物種、檢索有關它們的信息及以前所未有的速度發(fā)現并命名新物種[38],成為識別生物多樣性的一個重要的新工具[39],它提供了比傳統的分類工作[40]更快速、準確的分類方法。隨著DNA條形碼技術的不斷發(fā)展,可供參考的數據信息越來越多,最終將建成生命物種多樣性全球數據庫[41]。DNA條形碼技術對傳統的物種系統分類產生巨大的沖擊,只需將收集到的DNA序列片段與國際數據庫中的物種片段直接比對,與所屬物種自行匹配即可[42-43]。

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Application of DNA barcode technology in meat and meat products

JIANG Shuai,CHEN Qian,KONG Bao-hua*

(College of Food Science,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

DNA barcoding as a novel molecular biologic technology has been widely used in the identification of distinguishing genetic relationship among species. This technology can be fast and accurate to detect the quality of meat products. DNA barcode has become one of the frontier areas of the most rapidly developing biologic technology,and it is based on a wide range of species gene database information,so it has good prospects in the meat science study. The basic principles of DNA barcode technology was discussed in this review and compared with other technologies based on DNA level. The DNA barcode technology’s application in species identification,meat quality,safety analysis and commercial fraud were involved in this paper. The application of DNA barcode technology also was prospected in the future meat science.

DNA barcode;meat science;species identification;quality and safety

2016-01-18

姜帥(1992-)，女，在讀碩士研究生，研究方向：畜產品加工，E-mail:18846826946@163.com。

孔保華(1963-)，女，教授，研究方向：畜產品加工，E-mail:kongbh@163.com。

國家自然科學基金(31471599)；黑龍江省應用技術研究與開發(fā)重點計劃(GA15B302)。

TS251

A

1002-0306(2016)16-0379-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.067