不同微藻培養方式產生蝦青素及其影響因素的研究現狀

郭曉茜,任丹丹,張繼紅,任先見,汪秋寬

(大連海洋大學食品科學與工程學院,遼寧大連 116023)

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不同微藻培養方式產生蝦青素及其影響因素的研究現狀

郭曉茜,任丹丹*,張繼紅,任先見,汪秋寬

(大連海洋大學食品科學與工程學院,遼寧大連 116023)

蝦青素具有多種重要生理功能,已廣泛引起人們的重視,微藻是蝦青素的主要來源之一。本文綜述了在自養、異養及混養三種培養方式下微藻積累蝦青素的研究現狀及影響因素,并分析了不同培養方式的的優缺點,以期為蝦青素的微藻高效生產提供參考。

微藻,自養,異養,混養,蝦青素,影響因素

微藻的培養方式主要分為自養、異養和混養。自養培養為微藻的主要培養方式,是微藻通過光合作用利用光能和CO2進行生長。微藻的異養培養是指在培養基中添加有機碳源和(或)有機氮源而不依賴光照進行增殖的過程。可進行異養培養的微藻具有生長周期短、生長速率高、生物質濃度高(可達到50～100 g/L)等優點[1]。微藻混養培養是在利用光能和CO2的同時,以有機碳(葡萄糖)作為補充碳源和能源的一種培養方法,可以不受光的限制,從理論上講,能取得較高的產量[2]。異養培養已成為國內外一種快速、大量培養微藻的有效方法和發展方向。由于異養和自養培養條件不同,因而使微藻所含的營養成分發生明顯的變化。

蝦青素(astaxanthin)是一種重要的類胡蘿卜素。它可淬滅單線態氧,清除自由基,阻止脂質過氧化,保護機體免受傷害,預防癌癥發生,還能促進人體免疫球蛋白的產生,具有很高的免疫調節活性[3]。蝦青素抗氧化能力是β-胡蘿卜素的10倍,維生素E的500倍,被譽為“超級維生素E”,在食品及醫藥方面有著廣泛的應用前景。同時它是一種良好的著色劑,在水產養殖等方面具有重要的應用價值[4]。本文對自養、異養和混養三種培養方式下生產蝦青素的研究現狀進行了綜述,以期為微藻高效生產蝦青素提供參考。

1　自養培養方式

雨生紅球藻是天然蝦青素最好的來源之一,目前國內外已采用雨生紅球藻Haematococcuspluvialis通過自養來生產蝦青素[5]。雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)是一種常見的生存于淡水中的單細胞綠藻。在其生長周期中明顯地呈現出兩個階段:在生長條件適宜的情況下該藻以綠色帶鞭毛的可游動細胞形態大量繁殖;在生長環境不利的情況下,綠色游動細胞逐漸喪失鞭毛、細胞壁加厚、形成紅色包囊,同時細胞質油脂小泡中大量積累蝦青素。此藻在不利條件下積累蝦青素,并且具有普通微藻所需營養簡單的特點,因此被認為是生產蝦青素最好的自然資源。雨生紅球藻由于培養周期較長,易受其他藻類和原生動物的污染等不利因素的影響,其大規模的培養一直是蝦青素生產的壁壘[6]。自養培養是目前生產蝦青素的主要培養方式,密閉式光生物反應器光自養培養雨生紅球藻在產率上有較大的提高,培養過程易于控制,可有效避免污染,質量和產量也比較穩定。但由于設備成本高、技術不成熟、光照限制等原因,迄今尚未應用于大規模養殖。開放式戶外大池光自養培養是目前雨生紅球藻大規模商業化生產的主要培養方式,具有設施簡易、投資少、成本低等優點,但具有占地面積大、生長條件難以控制、采收成本高、易受其它生物污染、藻粉質量低等缺點,限制了開放池培養的進一步發展[7]。

影響蝦青素積累的影響因素有很多,如光照、溫度、通氣速率、營養鹽、pH以及一些化學調節劑等,可通過影響雨生紅球藻光合作用效率從而影響微藻的生長。前些年的研究主要是通過改變光照強度、溫度、通氣速率及pH等方式來誘導蝦青素的合成。有文獻報道,當將微藻細胞暴露在氮饑餓、高鹽度、高溫和高光照強度的條件下,就可以促進蝦青素的產生[8]。Minxi Wan等通過改變溫度對自養雨生紅球藻蝦青素積累的情況進行了研究,在光照強度為250 μmol photons m-2·s-1,pH為7.5～8,光暗周期為12 h∶12 h,通氣速率為0.04 vvm條件下的條件下,保持夜間溫度為28 ℃,白天溫度從8～33 ℃開始變化,或者白天溫度保持28 ℃不變,夜間溫度從8～33 ℃開始變化。研究表明當白天培養溫度為23～28 ℃,夜間培養溫度低于28 ℃時刺激夜間蝦青素積累,蝦青素最高含量達2.3 mg/L/d,使蝦青素含量最高達對照組的2.9倍[9]。低溫會抑制微藻的生長繁殖,但有利于類胡蘿卜素的積累,因此當白天溫度高于28 ℃,有利于微藻的生長繁殖,而降低夜間培養溫度有利于蝦青素的積累。據已知報道自養微藻通過向培養基中添加氮、磷、硫、鐵等物質,可以大量積累微藻中的蝦青素,且營養物的種類與蝦青素積累的速率有關。而光照強度和光質也對蝦青素合成產生影響,Del Campo等人報道了當連續增加光照強度時可成倍增加蝦青素的含量[10]。

近5年來,人們對微藻自養積累蝦青素的調節機制已有了較充分的研究和認識,因此通過添加化學調節劑誘導與蝦青素素有關的基因表達來增加藻體蝦青素含量的研究越來越多,也是優化自養產生高含量蝦青素的有效途徑。Boussiba研究發現抑制細胞分裂可誘導蝦青素的積累,這意味著只要有能抑制細胞分裂的任何因素,就可以誘導蝦青素的積累[8]。Yongteng Zhao等通過添加黃腐酸來增加新型雨生紅球藻LUGU中蝦青素含量,當溫度在25 ℃,照明強度在30 μmol photons m-2·s-1,通氣速率為0.01 vvm條件下,研究表明相比于對照組,在添加5 mg/L FA和10 mg/L FA時,使蝦青素含量增加了86.89%和9.87%,最大蝦青素產量為20.82 mg/L[11]。這是由于在培養基中添加FA誘導PDS(八氫番茄紅素脫飽和酶),LCY和CHY(β-胡蘿卜素羥化酶)基因上調,導致蝦青素含量升高。Zewen Wen等研究了通過添加乙醇誘導雨生紅球藻中蝦青素積累和類胡蘿卜素生物合成基因的表達,當光照強度為25 μmol photons m-2·s-1或150 μmol photons m-2·s-1,溫度維持在25 ℃,pH為7的條件下,研究表明在低光照條件下添加3%的乙醇可使微藻中蝦青素生產率達11.26 mg/L/d,是對照組的2.03倍,說明乙醇能有效地誘導蝦青素合成[12]。Zhengquan Gao等研究了通過添加水楊酸誘導雨生紅球藻中蝦青素積累和八種類胡蘿卜素基因的轉錄表達。當光照強度為25 μmol photons m-2·s-1,溫度維持在20 ℃,光暗周期為12 h∶12 h的條件下,研究表明50 mg/L的水楊酸為積累蝦青素的最適濃度,水楊酸能誘導蝦青素積累可能的原因是上調與蝦青素積累有關的8種類胡蘿卜素基因[13]。Yandu Lu等研究了茉莉酮酸甲酯和赤霉素A3通過上調β-胡蘿卜素酮醇酶基因的轉錄誘導雨生紅球藻中蝦青素積累,當光暗周期為12 h∶12 h,溫度維持在25 ℃條件下,高濃度的茉莉酮酸甲酯和赤霉素A3可誘導上調三種不同的bkts基因,致使蝦青素大量積累[14]。S. Kathiresan研究了通過生物合成關鍵酶β-胡蘿卜素酮醇酶(β-carotene ketolase,BKT)來增加雨生紅球藻中蝦青素的含量。結果發現在雨生紅球藻中總類胡蘿卜素和蝦青素的含量相比于對照組高2～3倍[15]。Xinheng Yu等研究了8組23種(抗氧化劑、氧化劑、信號轉導物、金屬離子、植物激素、赤霉素、細胞分裂素和胺類)化學調節劑對雨生紅球藻蝦青素產量的影響。當培養溫度為20 ℃,持續光照強度為20 μmol photons m-2·s-1的條件下,氧化劑和信號轉導物顯著增加雨生紅球藻中蝦青素含量,這說明化學分子可以通過調節細胞內代謝機制來增加蝦青素含量[16]。

利用雨生紅球藻生產蝦青素的關鍵在于:既能提高藻的生物量,又能促進蝦青素的快速合成。之后利用高光照、營養鹽饑餓、細胞分裂抑制物的產生等誘導條件,都可使細胞分裂速度下降,從而導致個體細胞內蝦青素的快速積累。蝦青素的積累和藻細胞的生長往往呈相反趨勢:即當條件適宜藻細胞生長時,蝦青素的合成速率通常較低,蝦青素的快速積累發生在不利于藻細胞生長的環境條件下。

2　混養培養方式

混養培養微藻可作為增加光誘導色素產量的一種有效途徑。混養是吸收CO2和有機碳,同時進行光合作用和呼吸作用,因此在光限制條件下,大多數微藻的混養比生長速率約等于自養和異養比生長速率之和[17]。采用混養培養方式可快速大量的積累蝦青素,但在培養過程中容易滋生大量雜菌,難以實現微藻的高密度培養。目前主要用小球藻Chlorellazofingiensis來混養生產蝦青素。C.zofingiensis是一種單細胞綠藻,屬于綠藻門,綠藻綱,綠球藻目,卵囊藻科,小球藻屬[18]。生長速度快,易培養,抗污染能力強,環境適應能力強,細胞濃度較大,已成為生產蝦青素另一重要的微藻資源。C.zofingiensis的培養方式主要有混合營養培養與異養培養[19]。

Po-Fung Ip等研究了通過混養Chlorellazofingiensis增加蝦青素產量,比較了不同葡萄糖和硝酸鹽濃度對綠藻色素形成的影響,當培養溫度為30 ℃,持續光照強度為130 μmol photons m-2·s-1,pH為6.5的條件下,結果表明在混養培養Chlorellazofingiensis通過添加高濃度葡萄糖和低濃度硝酸鹽易于積累蝦青素,其最高蝦青素產量為12.5 mg/L[20]。有關于對研究Chlorellazofingiensis發現,當光照強度為350 μmol photons m-2·s-1,并且利用氮饑餓的方法積累蝦青素其最高產量為7.49 mg/L[21]。經過比較發現同一藻種,采用相似的培養條件,其積累蝦青素產量的差異是巨大的。采用混養的方式可以大量積累所選藻種的生物量,但是過高的生物量不利于蝦青素的積累。目前有關混養微藻積累蝦青素的文獻比較少,因為采用混養方式積累蝦青素的影響因素很多,其中自養、異養的影響因素均會對自養產生影響,條件難以精確控制。其最大的問題是大規模培養過程中容易滋生大量雜菌,難以實現微藻的高密度培養。

3　異養培養方式

同混養一樣,目前主要用小球藻Chlorellazofingiensis來異養生產蝦青素。異養培養方式具有不受環境和氣候等條件的限制、能夠實現較高的細胞濃度和生產效率,從而降低生產成本、可借鑒和利用較成熟的工業發酵設備和技術等優點[7]。

在異養微藻條件下,細胞內積累蝦青素的主要影響因素為培養基中有機物的濃度和C/N比等。對異養微藻來說,最主要的影響因素是有機物濃度,由于異養微藻具有可吸收有機碳源來滿足自身生長繁殖需要的能力,在提供有機碳源的培養條件下配合脅迫處理方法可以在較短的時間內積累大量的蝦青素[22]。Po-Fung Ip等研究發現當溫度為30 ℃,pH為6.5的條件下,設置三個葡萄糖初始濃度為10、30、50 g/L,初始C/N比為18、55、90、180。在異養培養基中添加葡萄糖濃度為50 g/L時,得到最大蝦青素產量為10.3 mg/L。在無光照條件下,蝦青素的形成取決于培養基中初始C/N比,較高的C/N比有利于蝦青素的形成,最高可達1.2 mg/g[23]。Po-Fung Ip等還通過添加活性氮過氧亞硝酸鹽(RNS)和活性氮中間體硝酰氯(RNI)誘導小球藻提高蝦青素含量。當溫度為30 ℃,pH為6.5的條件下,添加1 mmol/L RNS進行異養培養使蝦青素含量從9.9 mg/L增至11.78 mg/L。用0.1 mmol/L亞硝酸鈉和0.5 mmol/L次氯酸鈉反應生成硝酰氯也增加了蝦青素的含量至10.99 mg/L,這說明合適的RNS/RNI比在無光條件下易于誘導蝦青素的形成[24]。陳濤等研究了葡萄糖、蔗糖和果糖對小球藻異養生長及蝦青素含量的影響,結果表明當糖濃度在20～50 g/L范圍內,隨著糖濃度的升高,細胞內蝦青素含量也升高。在糖濃度為20 g/L時,細胞生長較快但干重較小,蝦青素含量較低,在糖濃度為50 g/L時,細胞生長較慢,但干重較大,蝦青素含量較高。三種碳源中蔗糖和葡萄糖效果較好,在蔗糖濃度為50 g/L時,蝦青素含量和產量分別達到0.94 mg/g和9.61 mg/L,由此說明不同碳源對細胞生長和合成蝦青素有顯著影響[3]。Ni Sun等研究通過用葡萄糖、甘露糖、果糖、蔗糖、半乳糖和乳糖研究在異養小球藻中對蝦青素積累的影響。研究發現葡萄糖和甘露糖作為異養小球藻的最佳碳源能獲得較高的生長速率(0.03 h-1)和細胞干密度(10 g/L),進而積累較高的蝦青素濃度為1 mg/g[25]。

通過研究發現在培養基中添加有機碳源、氮源可增加微藻的生物量,但是過高的起始濃度會抑制微藻的生長,進而減少蝦青素的合成。因此利用Chlorellazofingiensis生產蝦青素的關鍵在于:既能提高藻的生物量,又能促進蝦青素的快速合成。首先利用Chlorellazofingiensis最優生長條件促使藻細胞生物量增加,通常利用有機碳(如葡萄糖和醋酸鹽等)進行異養培養來提高藻細胞生物量。然后誘導蝦青素的快速合成,蝦青素積累的誘導條件包括高溫、營養鹽(氮、磷)饑餓、鹽脅迫、細胞分裂抑制劑、氧化壓力(活性氧、自由基和溶解氧等)以及兩種或兩種以上誘導條件的聯合作用,如高溫和鹽脅迫、高光照和氮饑餓等。通常,氮源限制和高光照是生產蝦青素的有效方法[26]。

4　展望

微藻作為類胡蘿卜素來源具有廣闊的應用前景。自養培養微藻具有易于培養、光合利用效率高、生物周期短等優點。目前主要是利用光生物反應器自養培養微藻,其存在一些限制因素,如占地面積大;細胞密度較高時,由于藻細胞之間互相遮蔽,使內部的細胞難以得到充分的光照,嚴重影響生物量;溫度和光照控制比較困難;運行成本太高等[17]。與自養培養方式相比,采用微藻異養培養方式進行蝦青素方面的研究,具有很多優勢,例如無需光照、生長周期短、生長速率高、生物質濃度高等優點。異養培養可以利用傳統發酵設備生產高價值產品,因而具有更強的市場競爭力[27]。微藻異養培養使整個操作流程具有較高的可控性,不依賴于外界環境。但是,并不是所有的微藻都能進行異養生長且異養培養微藻是必須嚴格控制在無菌條件下,微藻培養的無菌化是進行異養培養的前提和關鍵。因為在異養培養基中生長迅速的細菌會很快污染整個培養基,并大大限制微藻的生長。混養培養是自養和異養培養方式的結合,這種培養方式可以較好地發揮自養和異養兩種培養方式的長處,但此種方式目前尚難以用于規模化生產,一個重要原因是在細胞密度較高時難以提供有效的光照[28]。

本文主要對影響微藻自養、異養及混養的影響因素進行了歸納總結,這為下一步微藻精確培養提供了參考依據。通過自養、混養及異養培養方式對微藻中蝦青素積累情況比較發現,在自養條件下,光照強度是最主要的影響因素之一。適當的光照強度會增加藻體的生長速率,有利于大量積累微藻生物量,但是過高的藻體密度會導致部分微藻未受到光照不利于蝦青素等高附加值產物的合成。同樣條件下采用異養培養方式培養微藻可避免由于光照帶來的影響,但是并不是所有的微藻都可以進行異養生長,因此對于可進行異養生長的藻種的篩選是至關重要的。

目前,微藻主要應用于餌料及飼料方面。微藻特有的色素如蝦青素等對水產養殖的蝦和魚具有很好的著色作用。微藻作為海洋藥物的重要來源,所含有的生物活性物質如抗生素、色素、多糖、DHA和EPA等具有抗腫瘤、抗病毒、抗真菌、防治心血管疾病、防治老年人癡呆癥等多種功能。其次微藻可用作生物柴油,具有環保、安全、燃燒充分、可再生性等特性,大力發展生物柴油對經濟社會可持續發展,能源循環利用,節能減排等具有重要意義[18]。

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Research advances on astaxanthin produced under different microalgae cultured methods and their influential factors

GUO Xiao-xi,REN Dan-dan*,ZHANG Ji-hong,REN Xian-jian,WANG Qiu-kuan

(College of Food Science and Engineering,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China)

Nowadays much attention has been paid to bioactivities of astaxanthin,especially those from natural resources of microalgae. The research advances on production of astaxanthin by microalgae under different conditions including autotrophic,heterotrophic and mixotrophic method were reviewed in this paper. Advantages and disadvantages of each cultured method and their influential factors were also compared. It provided the basis for the efficient production of astaxanthin.

microalgae;autotrophic;heterotrophic;mixotrophic;astaxanthin;influential factors

2016-02-26

郭曉茜(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：食品營養與安全，E-mail：Gracy0909@163.com。

任丹丹(1980-)，女，博士，副教授，研究方向：海洋生物資源利用， E-mail：rdd80@163.com。

國家自然科學基金(31301449)；遼寧省高校優秀人才項目(LJQ2014077)； 遼寧省農業領域青年科技創新人才項目(2015005)。

TS254.2

A

1002-0306(2016)17-0381-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.17.067