外源菌劑對豬糞堆肥質量及四環素類抗生素降解的影響

肖　禮，黃懿梅，趙俊峰，周莉娜

（西北農林科技大學資源環境學院，農業部西北植物營養與農業環境重點實驗室，陜西楊凌712100）

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外源菌劑對豬糞堆肥質量及四環素類抗生素降解的影響

肖禮，黃懿梅*，趙俊峰，周莉娜

（西北農林科技大學資源環境學院，農業部西北植物營養與農業環境重點實驗室，陜西楊凌712100）

摘要：為了探討不同外源菌劑組合對豬糞秸稈堆肥質量及豬糞中四環素類抗生素的降解影響，以豬糞為原料，秸稈為調理劑，分別設置了不加菌劑處理（CK）、添加白腐真菌處理（F）以及同時添加白腐真菌、氨化和硝化菌劑（FAN）三個處理，在自制的長方體翻轉式好氧堆肥反應器中進行了豬糞秸稈的堆肥化模擬試驗。通過定期?樣，分析了堆肥的基本物理性質、氮素形態和其中有機碳（OC）、全磷（TP）、全鉀（TK）和四環素（TC）與土霉素（OTC）含量的變化。結果顯示：菌劑添加處理（F和FAN）對堆肥腐熟（種子發芽率）影響不大，但促進了堆肥中有機碳降解及全磷和全鉀的增加，單一白腐真菌處理下的銨態氮的損失最小（0.24 g.kg-1）；四環素和土霉素的濃度隨堆肥時間顯著下降，?過42 d兩種抗生素降解率達90％以上（OTC、TC濃度<5 mg.kg-1）；白腐真菌起到加速堆肥中四環素降解的作用。

關鍵詞：外源菌劑；土霉素；四環素；堆肥

肖禮，黃懿梅，趙俊峰，等.外源菌劑對豬糞堆肥質量及四環素類抗生素降解的影響[J].農業環境科學學報，2016，35（1）：172-178.

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微生物是堆肥化過程中降解有機質的主體，氮素生理群參與堆肥中的主要氮素循環過程，包括氨化作用、硝化作用、反硝化作用、無機氮固定作用等，使堆肥原料中銨態氮（NH+4-N）、亞硝態氮（NO-2-N）、硝態氮（NO-3-N）和有機氮（Org-N）等發生變化，從而影響到堆肥過程中的氮素損失與堆肥質量[1]。微生物菌劑在堆肥中的使用能夠起到保氮促腐的作用。氨化細菌能夠加速堆肥腐熟，但同時會加大氮素通過氨氣揮發的形式損失[2]；白腐真菌能降解各種結構相異的化學物質，包括在環境中持久且難以處理的污染物，且于固、液環境下均能生長，有著其他微生物所不具備的優點，因而在環境保護與環境治理方面顯示出較大的應用潛力[3]。但是，目前將白腐真菌與氮素生理群一起應用于堆肥過程中，探討堆肥中物質轉化特征和堆肥質量的研究報道較少。另外，由于獸用抗生素的消耗量在我國較大[4]，其潛在生態健康風險不容忽視。盡管研究表明[5]，堆肥能有效去除畜禽糞便中的四環素類抗生素殘留，但關于外源微生物菌劑對畜禽糞便中四環素類抗生素殘留在堆肥過程中變化的影響還不?楚。本文擬在長方體翻轉式好氧堆肥反應器中，研究添加不同外源菌劑后豬糞和麥稈堆肥過程中堆肥質量和四環素含量的動態變化特征，為利用堆肥技術消除四環素類抗生素的殘留，提高堆肥質量提供理論依據。

1　材料與方法

1.1堆制材料與裝置

新鮮豬糞?自于西北農林科技大學生態養殖場，小麥秸稈剪碎成段（3～5 cm），各原料的基本性狀見表1。氨化細菌和亞硝化細菌菌種由豬糞堆肥分離培養而得[6]，白腐真菌是從菌種庫購買的黃孢原毛平革菌。使用前?將菌種在28℃件下活化24 h，加入滅菌水制備成菌懸液。菌懸液接種于固體培養基上，涂布均勻并于28℃擴增48 h。選生長良好且無雜菌的培養基刮下菌體制備菌懸液，每7皿100 mL。

表1　堆肥原料基本性狀Tab1e 1 Basjc propertjes of compostjng materja1s

堆肥試驗裝置為自行設計的長方體翻轉式好氧堆肥反應器，如圖1所示。外形尺寸為0.40 m×0.40 m× 0.70 m，用厚度為1.0 cm的PVC板焊接，有效容積為0.10 m3，并包裹4.0 cm厚泡沫塑料板作為保溫層。

圖1　堆肥反應器示意圖Fjgure 1 Schematjc djagram of compostjng reactor

1.2試驗設計與樣品采集

試驗設置三個處理。對照（CK）：豬糞與秸稈按10∶1比例混合，總重控制在22 kg，裝滿但不壓實，水分控制在65％左右進行堆制，在高溫期后（第22 d）加100 mL蒸餾水。加白腐真菌處理（F）：物料配比和水分控制同CK，在堆肥高溫期后投加白腐真菌菌劑100 mL。加混合菌劑處理（FAN）：物料配比和水分控制CK，在高溫期后添加白腐真菌、氨化細菌和硝化細菌混合菌劑共100 mL。

各處理從2013年4月15日到5月27日共堆制42 d。堆制期間每天上、下午用XMT616智能溫度測定儀分別于堆體上部、中部、下部測定溫度，取平均值作為當天的堆溫，并以約60 L.mjn-1的流量從底部篩板向堆體均勻充氣，通風時間根據堆溫調節，一般情況下每天上、下午各通風30 mjn，當堆溫超過65℃時，加大通風量。

根據溫度變化分別于第0、7、15、22、30、42 d取樣。?將堆體充分搖勻，然后多點取樣，混合成三份平行樣，每份樣品總量控制在500g左右，其中200g保存于-20℃冰箱，用于液體浸提液提取測定pH、電導率、種子發芽率，其余風干粉碎后過1mm篩存儲備用。

1.3測定項目及方法

pH值和電導率分別用配有Inte1Ljca1 pH電極和電導率電極的HQ測定儀測定；種子發芽指數（GI）利用浸提液在28℃培養小白菜種子（四季小白菜）的方法進行測定[7]。

進行堆肥銨態氮與硝態氮測定時，?用1.0 mo1. L-1NaC1溶液浸提，由適量浸提液在定氮儀上直接蒸餾定氮測定銨態氮，然后向適量浸提液中加入1 gZn-FeSO4混合加速劑并在定氮儀上測出速效氮，再減去銨態氮即得到硝態氮的含量。全氮用硫酸-H2O2消煮，定氮儀測定；有機碳用重鉻酸鉀外加熱法測定；總磷用硫酸-H2O2消煮，釩鉬黃分光光度法[8]測定；四環素類抗生素?用SPE-HPLC法測定[9]。

1.4數據?理

?用SPSS 18.0統計分析軟件對數據進行單因素方差分析（One-way ANOVA）以及多重比較，運用Exce1 2013處理數據和Orjgjn 9.0作圖。

2　結果與分析

2.1堆肥溫度、pH值、電導率和發芽指數的變化

對于堆肥系統而言，溫度是堆料中微生物生命活動的重要標志，堆肥的目的是為了使堆體溫度快速上升，并在適宜的溫度維持一段時間，從而使有機物降解并殺死其中的病原體。由圖2可以看出，CK、F以及FAN處理的溫度變化有所不同：前兩種處理在第2 d、FAN處理在第4 d達到了50℃以上，而后隨著環境溫度的變化有所下降，在第11 d后再次達到了50℃以上（50～55℃），且分別持續了7、9、8 d。三種處理的高溫期主要出現在第0～5 d和第11～19 d。添加菌劑后，在堆肥的第34 d，F處理溫度又上升到45℃并持續了3 d。根據國標《糞便無害化衛生標準》（GB 7959—2012），各處理在堆肥結束時均達到了無害化的基本要求。

圖2　堆肥溫度的變化Fjgure 2 Changes of temperature durjng compostjng

由圖3可知，堆肥前20 d三個處理pH值均隨著溫度的升高迅速上升，由初始的7.0～7.31增加到8.69～8.74，增加了1.4～1.6個單位。此后隨著時間延續各處理pH均略有下降，至堆肥結束CK、F、FAN三個處理的pH分別為8.69、8.73、8.74，添加菌劑對pH沒有明顯影響。

圖3　堆肥pH的變化Fjgure 3 Changes of pH durjng compostjng

圖4顯示各處理電導率隨著堆肥進行呈現出波動變化。在第30 d，F和FAN處理的電導率低于CK，以后各處理電導率均下降，至堆肥結束CK、F、FAN三個處理電導率分別為2.45、2.92、2.63 mS.cm-1，均小于《糞便無害化衛生標準》（GB 7959—2012）給出的腐熟堆肥的電導率值（>4 mS.cm-1），可以安全施用。

圖4　堆肥電導率的變化Fjgure 4 Changes of e1ectrjca1 conductjvjty durjng compostjng

圖5是三個處理種子發芽率的變化，總體上呈現升高的趨勢，至第15 d，三個處理（CK、F、FAN）的發芽率分別為80.6％、72.6％、75.3％；而在第22 d各處理的GI大幅下降，可能與堆肥中產生有機酸等對植物種子有毒害的物質有關；此后隨著堆肥的繼續進行有毒物質消失，GI又開始增加，至堆肥結束各處理（CK、F、FAN）GI分別為83％、85％、82％。

2.2不同菌劑?理堆肥中養分含量的動態變化

各處理銨態氮含量變化如圖6所示，整體上呈現?升高后降低的趨勢。在堆肥第15 d達到最高值，三個處理（CK、F、FAN）銨態氮最大值分別為1.83、1.41、1.52 g.kg-1。至堆肥結束各處理銨態氮含量分別為0.36、0.57、0.42 g.kg-1，與初期相比分別降低了0.37、0.24、0.54 g.kg-1，降幅分別為50.7％、29.2％、56.3％，添加白腐真菌菌劑銨態氮降低幅度小于其他兩個處理。

圖5　種子發芽率的變化Fjgure 5 Changes of seed germjnatjon rate durjng compostjng

圖6　銨態氮的變化Fjgure 6 Changes of ammonjum njtrogen content durjng compostjng

三個處理（CK、F、FAN）全氮含量（圖7）均呈下降趨勢，至堆肥結束分別為12.89、18.82、14.02 g.kg-1，與初始相比分別降低了10.50、8.03、10.95 g.kg-1，降幅分別為44.9％、29.9％、43.8％。添加白腐真菌菌劑全氮降低幅度小于其他兩個處理。

圖7　全氮的變化Fjgure 7 Changes of tota1 njtrogen content durjng compostjng

三個處理（CK、F、FAN）全鉀含量（圖8）一直呈上升趨勢，堆肥結束分別為126.30、124.07、130.32 g. kg-1，分別比初始增加了99.74％、128.4％、93.03％。這也在一定程度上說明，高溫后期添加混合菌劑對全鉀影響不大，與空白處理基本一致。

圖8　全鉀的變化Fjgure 8 Changes of tota1 potassjum durjng compostjng

如圖9所示，全磷（TP）含量均呈上升趨勢。有機物質在高溫期降解速率最大，干物質減少較快，因此TP含量增加。在高溫后期添加菌劑后，F處理在第30 d有一個峰值，TP含量達到了9.85 g.kg-1。在第22～42 d，三個處理（CK、F、FAN）的全磷增加率分別為13％、31％、18％。至堆肥結束時，三個處理的TP含量依次為7.89、9.21、8.91 g.kg-1，分別比堆肥開始時增加了47.48％、56.37％、47.76％。

圖9　全磷的變化Fjgure 9 Changes of tota1 phosphorus durjng compostjng

2.3不同菌劑?理堆肥中四環素類抗生素?及有機碳的動態變化

抗生素在堆肥過程中的變化趨勢如圖10、圖11所示。堆肥試驗開始時，豬糞堆肥中OTC的初始濃度約為33 mg.kg-1，TC的初始濃度約為60 mg.kg-1，堆肥開始后，OTC、TC濃度均迅速降低，且濃度變化趨勢相似。前7 d，土霉素和四環素的降解速度最快，三個處理（CK、F、FAN）的土霉素降解率分別為32.8％、42.5％、48.9％，四環素的降解率分別為42.1％、47.9％、44.8％。高溫后期添加菌劑后，第22～30 d，F、FAN及CK四環素的降解率分別為42.3％、42.7％、33.6％。到堆肥后期，土霉素和四環素的含量趨于穩定，其值均小于5 mg.kg-1。三個處理（CK、F、FAN）土霉素和四環素的去除率分別為86.5％、92.4％、91.3％和92.5％、95.0％、94.8％。

三個處理（CK、F、FAN）有機碳的變化（圖12）一直呈下降趨勢，堆肥結束時分別為309.60、325.48、307.10 g.kg-1，與初始值比分別降低22.7％、26.9％、27.2％。與對照相比，混合菌劑處理的有機碳降解量更多。

圖10　土霉素含量變化Fjgure 10 Changes of oxytetracyc1jne durjng compostjng

圖11　四環素含量變化Fjgure 11 Changes of tetracyc1jne durjng compostjng

圖12　有機碳的變化Fjgure 12 Changes of organjc carbon durjng compostjng

3　討論

3.1外源菌劑對堆肥養分含量的影響

堆肥過程中，有機氮化物分解產生氨氣，氨氣溶于堆體物料形成銨態氮主要是通過微生物的氨化作用[10]。堆體的pH值、通氣件、溫度以及氨化、硝化和反硝化微生物活性等影響著銨態氮含量。在堆肥過程中，銨態氮不僅作為細胞生長的氮源供微生物同化，同時能被硝化微生物轉變成硝態氮[11]，并且發生反硝化從而脫氮損失[12]，另外還可以通過氨氣揮發的途徑損失[13]。有研究發現，在堆肥中添加微生物菌劑能夠減少氮素損失、提高堆肥肥效，還可以加快發酵進程以及有機物質分解轉化、提高堆體溫度，從而達到無害化處理要求[14]。銨態氮會隨著有機質的礦化而增加，峰值出現在高溫階段，隨后迅速下降。從本實驗結果可以看出，銨態氮呈?上升后下降的趨勢，在高溫后期添加菌劑后，單添加白腐真菌處理（F）的氨氮有一個上升的小峰值。這有可能是白腐真菌加速了木質素、纖維素分解，提高堆肥氮素含量，并且促進了堆肥過程中磷的可溶性[15]。另外，接種白腐菌能夠促進氮源轉化為硝態氮，降低氮源向銨態氮的轉化，減少氮的揮發，從而降低氮素的損失，提高堆肥質量[16]。隨著時間延長，堆肥的全氮含量總體呈現下降趨勢，研究表明在有機廢物堆肥過程中的氮損失達16％～76％，其中絕大部分是由氨揮發所致[17]。本試驗過程中，堆體無滲瀝液產生，所以氣態形式逸出的氮應是堆肥全部的氮損失，三個處理（CK、F、FAN）的全氮損失率分別為44.8％、29.9％、43.8％，可以看出添加白腐真菌有利于保存氮素。同時，單獨添加白腐真菌處理在后期有增氮趨勢，再次證明白腐真菌能夠提高堆肥氮素含量[18]。全磷和全鉀含量在堆肥過程中的變化趨勢相同，均隨著有機質的降解呈逐步增加的趨勢[16]，三種處理之間全鉀的變化沒有差異，而在高溫后期添加菌劑，處理F的全磷含量第30 d有一個峰值，達到了9.85 g.kg-1，在第22～42 d，三種處理的全磷增加率分別為13％、31％、18％，可見添加白腐真菌后堆肥中磷的含量增加更多。

3.2外源菌劑對堆肥無害化和穩定性的影響

相關研究表明，接種外源微生物菌劑的處理堆肥升溫速度較CK快，且接種外源微生物菌劑能夠提高堆肥高溫期的溫度[19]。從本實驗可以看出，CK、F以及FAN處理所產生的溫度變化有所不同，添加菌劑后，在堆肥第34 d，F處理溫度再次上升，達到45℃并持續了3 d。一般認為，種子發芽指數（GI）是評價堆肥是否達到無害化和穩定性的生物學指標[20]，本試驗堆肥結束時，CK、F、FAN的GI值分別為83％、85％、82％，EC值分別為2.45、2.92、2.63 mS.cm-1，達到了農用標準[21]。在堆肥過程中，碳源是微生物利用的能源，碳的變化是堆肥化過程的基本特性之一[22]，在CK、F、FAN處理中，有機碳分別降低了22.7％、26.9％、27.2％，F、FAN處理的有機碳降解率大于CK處理。這是由于堆料中接種白腐菌菌劑，可分解堆體中難降解的有機物木質素，促進纖維素的降解，從而加速堆肥進程，使堆肥原料中有機物降解得更為徹底[23]。

有相關研究表明[24]，殘留的四環素類抗生素在堆肥過程中均能被迅速降解。在本研究中，抗生素在堆肥前期降解速度較快，前15 d土霉素和四環素的降解率都達到了50％以上。這與孫剛等[18]的研究相似，也進一步說明了堆肥有利于抗生素的降解。不添加四環素類抗生素、添加四環素類抗生素及增加BM菌劑的3個不同堆肥處理對四環素類抗生素的降解效果不同，但總體去除殘留的趨勢一致[5]。本實驗中，三種處理之間對四環素和土霉素的最終降解影響不明顯，但是在添加菌劑后，F和FAN處理能加速四環素的降解，第22～30 d，F、FAN及CK四環素的降解率分別為42.3％、42.7％、33.6％。這可能是由于白腐菌產生的天然木質素過氧化物酶和錳過氧化物酶在體外對四環素有很強的降解能力[25]。

4　結論

添加白腐真菌、硝化細菌、氨化細菌能夠提高氮素的含量，后期添加白腐真菌使堆肥在溫度的穩定期上升到45℃，并且持續3 d。兩種添加菌劑的處理對堆溫、電導率均產生一定的影響。單獨添加白腐真菌菌劑處理其氮損失量最小，有利于氮素保存。白腐真菌在一定程度上能夠加速抗生素的降解，進一步研究白腐真菌在堆肥中的作用是大有前景的。

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Effects of exogenous microbial agents on pig manure compost quality and tetracycline antibiotic degradation

XIAO Lj，HUANG Yj-mej*，ZHAO Jun-feng，ZHOU Lj-na
（Key Laboratory of P1ant Nutrjtjon and The Agrj-envjronment jn Northwest Chjna，Mjnjstry of Agrjcu1ture，Co11ege of Natura1 Resource and Envjronment，Northwest A&F Unjversjty，Yang1jng 712100，Chjna）

Abstract：Mjcrobes have jmportant jmpacts on compostjng of anjma1 waste，thus jnf1uencjng compost qua1jty. An experjment was conducted to jnvestjgate the effects of djfferent exogenous mjcrobja1 agent combjnatjons on pjg manure-straw compostjng and tetracyc1jne antjbjotjc degradatjon. A forced ventj1atjon pjg manure-straw compostjng box was emp1oyed. Three mjcrobja1 treatments jnc1uded：no exogenous mjcrobja1 agent（CK），whjte rot fungj（F），and combjned whjte rot fungj，ammonjfjcatjon and njtrjfjcatjon bacterja（FAN）. Samp1es were co1-1ected from each treatment at djfferent compostjng tjme. Basjc physjca1 propertjes，njtrogen，carbon，tota1 phosphorus，tota1 potassjum and tetracyc1jne and oxytetracyc1jne content were determjned. Resu1ts showed that the addjtjon of forejgn mjcrobja1 agents（F and FAN）had 1jtt1e effect on the maturjty of the pjg manure-straw compost jndjcated by seed germjnatjon rate，but jncreased degradatjon of organjc carbon jn the compost as we11 as tota1 phosphorus and potassjum content. Of three treatments，the 1oss of ammonjum njtrogen was the 1owest（0.24 g. kg-1）jn the F treatment. The concentratjons of tetracyc1jne（TC）and oxytetracyc1jne（OTC）decreased sjgnjfjcant1y（P<0.05）over the tjme. On the 42nd day of compostjng，the content of both OTC and TC was 1ower than 5 mg.kg-1and thejr degradatjon rates were greater than 90％. The addjtjon of whjte rot fungus acce1erated the degradatjon of tetracyc1jne to some extent.

Keywords：exogenous agents；oxytetracyc1jne；tetracyc1jne；compostjng

*通信作者：黃懿梅E-maj1：ymhuang1971@nwsuaf.edu.cn

作者簡介：肖禮（1990—），男，重慶人，碩士研究生，主要研究方向為生態環境工程。E-maj1：xjao1j047@nwsuaf.edu.cn

基金項目：國家“十二五”科技支撐計劃項目（2012BAD15BO4-4-3）；中央高校基本科研業?費專項資金項目（QN2013072）

收稿日期：2015-06-11

中圖分類號：X705

文獻標志碼：A

文章編號：1672-2043（2016）01-0172-07doj：10.11654/jaes.2016.01.023