低溫脅迫對兩種樟樹抗寒性生理的影響

王　寧，袁美麗，丁　博.河南科技大學林學院，河南洛陽47000.洛陽市隋唐城遺址植物園，河南洛陽4700

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低溫脅迫對兩種樟樹抗寒性生理的影響

王寧1，袁美麗2，丁博2
1.河南科技大學林學院，河南洛陽471000
2.洛陽市隋唐城遺址植物園，河南洛陽471002

摘要：以猴樟和芳樟葉片為試材，通過低溫處理研究了兩種樹木葉片MDA、脯氨酸、可溶性蛋白質及SOD活性和電導率的變化。結果表明：隨著處理溫度的降低，兩種樟樹的電解質外滲率呈“S”型上升；兩種樟樹的SOD活性及脯氨酸含量呈現先升后降的變化；可溶性糖、可溶性蛋白質及MDA含量則均呈現先降后升再降的變化；采用Fuzzy數學隸屬函數綜合評判法對猴樟和芳樟的抗寒性進行綜合評判猴樟的抗寒性大于芳樟，這與利用電解質外滲率結合Logistic方程得出猴樟和芳樟的半致死溫度（LT50）分別為-12.43、-10.71℃結果相一致；以猴樟為例，對低溫脅迫過程中各抗寒指標隸屬函數值進行的綜合評判結果顯示其抗寒性分抗寒性減弱期、增強期及減弱期。

關鍵詞：樟樹；抗寒性；SOD活性；綜合評價

低溫是限制植物北引的主要環境脅迫因子[1]。隨著全球氣候的逐漸變暖，南方樹種有望逐漸向北方地區引種。我國常綠闊葉樹種資源較為豐富，但主要分布于亞熱帶溫暖濕潤地區。目前，常綠闊葉樹種以其四季常青、革質光亮及花色果色豐富等特點，已被廣泛應用于我國南方城市綠化。對于常綠闊葉樹種相對匱乏的北方城市而言，樟樹作為優良的園林綠化樹種越來越受到北方城市綠化部門的重視。關于樟樹的抗寒性研究相對較少，薛建輝等[2]結合自然降溫過程中葉片相對電導率和低溫半致死溫度（LT50）測定，對南京地區引種的浙江樟等5種常綠闊葉樹種進行了抗寒性研究，將5種樹種的抗寒適應性分為抗寒性較弱期、抗寒性增強期、抗寒性最強期和抗寒性減弱期4個階段，并得出浙江樟抗寒能力較強，且能在南京地區廣泛栽植的結論。謝曉金等[3]借助電導法，對南京地區露地引種的包括香樟、浙江樟等12種常綠闊葉樹種進行了抗寒性研究，研究結果表明1月中旬抗寒能力達到最強，而通常10月份或3月份期間抗寒能力最弱。而對冬季低溫條件相應的快慢程度的研究表明，香樟、浙江樟屬于低溫快速響應型。尤揚等[4]研究認為，當溫度低于-10℃時香樟容易發生凍害。毛春英[5，6]在山東泰安對香樟幼苗及種子分別進行了引種研究，結果表明引種種子進行播種繁殖更易成功，并能獲得抗寒性強的苗木。本研究以實生繁殖的猴樟（Cinnamonum bodinieri Levl）及芳樟（C. camphora L.（linalool-type））為試材，通過對不同低溫處理中其葉片膜透性、保護酶活性及滲透調節物含量動態變化的研究，以期更加全面科學的鑒定兩種樟樹的抗寒性，揭示植物在不同低溫脅迫的適應機制。

1　材料與方法

1.1實驗材料

本試驗采用的材料為實生繁殖的1 a生猴樟及芳樟幼苗，種子均來源于湖南省長沙縣跳馬鎮（東經113°12′～113°13′，北緯28°22′～28°23′）。試驗地位于河南省鄭州市河南農業大學第三生活區內。鄭州市位于東經112°42′～114°14′，北緯34°16′～34°58′，屬北溫帶季風型大陸性氣候，年均氣溫為14.2℃，一月份均溫0.2°C，極端低溫-19.7℃。全年平均無霜期為227 d，初霜期在每年11月。

1.2實驗設計

2011年12月，選取兩種樟樹的1 a健壯苗木各10株，并在東南方向生長健康的枝條，取枝條上倒2和倒3葉片，先用自來水沖洗干凈，再用去離子水漂洗3次，在濾紙上吸干。剪碎后分成7份，每份約3 g左右，用自封袋包裝置于低溫冰箱中。實驗設置6個低溫梯度，分別為0、-5、-10、-15、-20、-25℃，處理均為24 h，取樣進行各項生理指標的測定，以采樣當天（2011年12月5日，0/4℃）的葉片為對照（CK）。每個處理葉片3份，3次重復。

1.3測定項目及方法

參考李合生[7]方法，蒽酮比色法測定葉片內可溶性糖，考馬斯亮藍法測定可溶性蛋白質含量，酸性茚三酮測定脯氨酸含量，丙二醛（MDA）含量測定采用硫代巴比妥酸（TBA）法，超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定采用NBT光照化學還原法，參照鄒琦[8]電導法進行電解質滲透率的測定。

1.4數據處理

應用Fuzzy數學中隸屬函數法進行綜合評判[9，10]，其計算公式如下：（1）對與抗寒性正相關的可溶性糖、可溶性蛋白質和脯氨酸，采用公式：f（xij）＝（Xij-Xj min）/（Xj max-Xj min）；（2）對與抗寒性呈負相關的電導率及MDA含量，采用下列公式：f（xij）＝1-（Xij-Xj min）/（Xj max-Xj min）。式中，f（xij）為i樹種的j項指標隸屬函數值；Xij為其測定值；Xj max和Xj min分別為j指標最大測定值和最小測定值。

試驗數據用Excel及SPSS統計軟件進行相關分析和方差分析。

2　結果分析

2.1電導率的變化

低溫脅迫下，兩種樟樹葉片的電導率均隨脅迫溫度的降低而增大（圖1）。其中，以芳樟的上升幅度較大。一般認為，相對電導率達到50%時的溫度可作為植物的LT50。由圖中可以看出，猴樟及芳樟在-10℃時的電導率分別為48.69%、52.99%，均較接近50%。由此表明，兩種樟樹的半致死溫度均在-10℃左右。

圖1　低溫處理后兩種樟樹的電導率變化Fig.1　The changes of electrical conductivity in leaves of two camphor species under low temperature

為進一步準確判斷兩種樹木的半致死溫度，將各處理溫度下兩種樟樹葉片的電導率用Logistic方程y＝K/（1＋αe-bx）進行擬合，求出猴樟和芳樟的LT50分別為-12.43、-10.71℃（表1）。從表中可以看出，猴樟及芳樟的擬合度（R2）均達到0.99以上。綜上所述，兩種樟樹細胞膜低溫穩定性以猴樟相對較強。

表1　兩種樟樹電導率的Logistic方程參數及LT50Table 1 The parameters of Logistic equation and LT50of two camphor species

2.2MDA含量

圖2　低溫處理后兩種樟樹的MDA含量的變化Fig.2　The changes of MDAcontent in leaves of two camphor species under low temperature

由圖2中可以看出，隨著溫度的降低，兩種樟樹葉片MDA含量呈先降后升又降的變化。MDA含量前期的增加可能與樟樹前期保護酶活性及滲透調節物質的增加相關，而隨后的上升是低溫脅迫的進一步增大的結果，最后的下降可能與低溫超過其承受范圍，造成植物組織逐漸死亡相關。圖中顯示，芳樟的MDA含量在各低溫下均高于猴樟，說明芳樟的膜脂過氧化程度均高于猴樟。兩種樟樹MDA含量均在0℃時最低，與最低值相比，猴樟和芳樟在-15℃時MDA含量分別為16.20、19.11 μmol·g-1，分別增加了64.47、84.46%。

2.3脯氨酸含量的變化

游離脯氨酸作為重要的滲透調節物質，低溫脅迫下其含量的增加，有利于穩定蛋白質結構和保護細胞內大生物分子的作用。從圖3中可以看出，低溫脅迫初期兩種樟樹的脯氨酸含量均出現不斷的增加，且以猴樟增加較為明顯，至-15℃時脯氨酸含量達到最大，分別為0.3089、0.2548 mg·g-1，分別比對照增加了24.14%和10.49%。當低溫超過-15℃時，脯氨酸含量有所下降，這可能與樟樹在重度脅迫下的耐受性有限相關。

圖3　低溫處理后兩種樟樹的脯氨酸含量的變化Fig.3　The changes of proline content in leaves of two camphor species under low temperature

2.4可溶性糖、可溶性蛋白含量的變化

從圖中4可以看出，芳樟和猴樟葉片內可溶性糖和可溶性蛋白含量均呈先降后升再降的變化，前期的下降可能是兩種樟樹對低溫的應激反應，隨后可溶性糖和可溶性蛋白含量的增加，至-15℃時出現峰值，且均以猴樟的含量相對較高，分別比芳樟高16.42%及17.74%，表明兩種樟樹在適度的低溫脅迫中，通過可溶性糖和可溶性蛋白的含量提高來增強其抗凍能力；然而，隨著溫度的進一步降低，兩種滲透物質的含量均出現明顯的下降，表明其調節能力的下降，這可能是低溫脅迫超過了兩種樟樹的承受范圍。

圖4　低溫處理后兩種樟樹的可溶性糖、可溶性蛋白含量的變化Fig.4　The changes of soluble sugar and protein content in leaves of two camphor species under low temperature

2.5SOD活性的變化

SOD作為植物體內清除O2-重要保護酶類之一，其活性的大小反映了植物對逆境脅迫的適應能力。低溫脅迫對兩種樟樹SOD活性的影響見圖5。從圖中可以看出，兩種樟樹的SOD活性均呈現先升后降的變化，且峰值均出現-5℃，與對照相比，分別增加了61.86、85.65%，而猴樟的峰值則比芳樟高出了13.27%。隨著脅迫溫度的持續降低，SOD活性出現大幅下降，這可能與脅迫低溫超過了其承受的范圍，而導致保護酶活性失活相關。

圖5　低溫處理后兩種樟樹的SOD活性的變化Fig.5　The changes of SOD activity in leaves of two camphor species under low temperature

2.6隸屬函數法綜合分析抗寒性

2.6.1低溫脅迫過程中各抗寒指標隸屬值以猴樟為例，低溫脅迫過程中各抗寒指標隸屬函數值見表2。綜合評價值呈現出“降-升-降”的變化趨勢，表明低溫脅迫過程中，猴樟的抗寒性呈減弱、增強及減弱的變化。由此可將低溫脅迫過程中猴樟的抗寒性分為2個時期，分別為：（1）抗寒性減弱期。此期包括兩個階段，從CK到0℃，猴樟抗寒性的減弱，可能與其應激反應有關；至-15℃后，其抗寒性的大幅下降，可能與脅迫低溫超過了其承受范圍，導致了植物細胞的不可逆性傷害，從而造成其抗寒性的減弱；（2）抗寒性增強期（0℃至-10℃）。猴樟抗寒性呈逐漸增強的變化，表明在對低溫短暫的適應后，其通過滲透調節物質含量的積累及保護酶活性的增加，從而增強對低溫的適應能力。

表2　猴樟低溫脅迫過程中各抗寒指標隸屬值Table 2 The membership values of cold resistance indicators under cold stress

2.6.2抗寒性綜合評價植物抗寒性時多指標綜合作用的結果，運用上述公式（1）、（2）求出猴樟及芳樟各指標參數的隸屬函數值，再乘以各指標權重后求其平均值得其綜合評價值，該值越大，則抗寒性即越強。2種樟樹6項抗寒指標參數的綜合評價結果如表3所示，得出抗寒性強弱順序為：猴樟＞芳樟。

表3　兩種樟樹抗寒性綜合評判Table3 Synthetic evaluation of cold resistance of two camphor trees

3　結論與討論

3.1不同低溫對兩種樟樹的抗寒性影響

3.1.1低溫對細胞膜透性的影響細胞膜是植物細胞與環境發生物質交換、信息傳遞以及能量交換的重要場所和媒介，也是細胞感受外界環境脅迫最為敏感的部位[11]，是低溫傷害的原初部位[12，13]。許多研究已經證明，不同梯度低溫脅迫中，隨著低溫的下降，植物電導率持續的上升[14-16]。本試驗結果表明，隨著處理溫度的下降，兩種樟樹的電導率呈“S”型曲線上升，這與前人研究結果一致。自Rajashekar C等[17]利用Logistic曲線描述低溫對植物細胞膜的傷害過程，提出以曲線拐點為半致死溫度（LT50）的觀點，此法已廣泛的應用于不同植物的抗寒性研究[18-20]。本研究中，兩種樟樹的回歸方程相關系數R2分別為0.9922、0.9910，效果較好。研究認為，拐點溫度上表現出的差異可以衡量其忍受低溫的能力，拐點溫度越低，表明其半致死溫度越低，則該樹種的抗寒性就越強[21]。本研究中，猴樟的半致死溫度為-12.43℃，而芳樟的為-10.71℃，由此判斷猴樟的抗寒性強于芳樟。

3.1.2低溫對滲透調解物質的影響研究表明，脯氨酸、可溶性糖及蛋白參與調控抗寒能力的形成[22-24]，可溶性糖可以提高細胞的滲透濃度，降低水勢，增加保水能力，從而使冰點下降，提高植物的抗寒性，而脯氨酸作為細胞質的滲透調節物質，在植物對抗低溫脅迫時起到平衡細胞代謝的作用，以保持細胞內環境的相對穩定，其含量的增加有利于植物抗寒性的提高[25]。

本研究表明，不同低溫脅迫中，兩種樟樹的可溶性糖、可溶性蛋白及脯氨酸含量均呈先降后升又降的變化，前期的下降可能是對低溫應激反應的結果，這與張紀林等[26]對枸骨等冬青植物的研究結果相一致，隨后的上升，表明兩種通過滲透調節物質含量的增加來提高其抗凍能力，隨著脅迫溫度的進一步降低，滲透調節物質含量出現下降趨勢，這可能與低溫超過了兩種樟樹的承受范圍，其調節能力降低相關，這與馮獻賓等[16]對黃連木和黃山欒樹的研究結果一致。

3.1.3低溫對膜脂過氧化的影響MDA作為膜脂過氧化的主要產物質之一，其含量的高低可以反映植物遭受逆境傷害的程度[27]。本研究中，不同低溫脅迫中兩種樟樹的MDA含量前期先降后升的變化與周建等對廣玉蘭[28]、鄭國華等對枇杷[29]的研究結果一致，而最后的下降，表明脅迫低溫超過了兩種樟樹的承受范圍，造成組織逐漸死亡，導致細胞膜脂過氧化程度的降低，這與高京草等對棗樹[30]、胡春霞等對南國梨[31]、鄭元等對幾種仁用杏[32]的抗寒性研究結果一致。

3.1.3低溫對保護酶活性的影響SOD是植物細胞內最重要的清除活性氧的酶之一，對膜系統的穩定性有著重要的作用，其活性的高低直接反映了活性氧的清除能力大小，與植物的抗逆性關系密切[33，34]。在強度的逆境脅迫中，酶活性一般隨脅迫的增加而增加，或者呈先增加后降低的變化[35]。本研究表明，不同低溫的脅迫中，SOD活性同樣呈先升后降的變化，后期的下降則可能是脅迫低溫達到臨界溫度，導致SOD活性出現鈍化的結果，造成其活性的下降，這與石雪輝等對柑桔[36]、詹福建等對馬占相思樹[37]、段肖翠等對阿月渾子[38]的研究結果一致。

3.1.4抗寒性綜合評價植物的抗寒性是受其生理生化特征綜合作用的遺傳表現，因此，單一抗寒指標難以判斷植物對低溫的綜合適應能力[9]。韓宏偉等[39]、柳新紅等[40]運用Fuzzy數學隸屬函數綜合評判法對中國刺槐種源間和翅莢木種源的抗寒性進行了綜合評判，并得出了滿意的結果。本研究運用同樣的方法，對不同低溫脅迫中MDA、SOD、可溶性糖、可溶性蛋白及脯氨酸5個生理生化參數進行了綜合分析，得出猴樟抗寒性大于芳樟的結果。

以猴樟為例，對不同低溫脅迫過程中各抗寒指標隸屬函數值進行的綜合評判結果顯示，低溫脅迫過程中，其抗寒性又分抗寒性減弱期、增強期及減弱期，前期抗寒性的減弱可能是對低溫脅迫的應激反應結果，隨著溫度的持續降低，通過滲透調節物質含量及保護酶活性的增加提高其對低溫的適應能力，抗寒性也逐漸增強，隨后抗寒性的降低可是脅迫低溫超過了其承受的范圍，造成植物組織不可恢復的損傷所至。

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The Effect of Cold Stress on the Cold Resistance Physiology of Two Camphor Species

WANG Ning1，YUAN Mei-li2，DING Bo2
1. College of Forestry/Henan University of Science and Technology, Luoyang 471000，China
2. The Sui＆Tang Dynasties Relics Botanic Garden of Luoyang, Luoyang 471002，China

Abstract:Taking leaves of Cinnamonum bodinieri Levl and C. camphora L.（linalool-type）treated by cold temperature as test materials，the changes of MDA，Proline，Soluble protein and SOD activity，electrical conductivity in them were studied. The results indicated that for all the materials，with the decrease of temperature，the ion leakage percentage of the two species increased in S-shape，the SOD and POD activities decreased after an initial increase. The content of soluble protein，MDA and soluble sugar began to drop，then to increase and at last to drop again. By using fuzzy mathematics method，the cold resistance of two camphor tree species was evaluated as Cinnamonum bodinieri Levl＞C. camphora L.（linalool-type），the semi-lethal temperature（LT50）of two camphor tree species calculated by the Logistic equation of ion leakage percentage was -12.43，-10.71℃，respectively. At last，by using a fuzzy mathematics method，the cold resistance of C. bodinieri Levl was divided into three periods，namely，the reducing stage，the enhancement setting stage，and the reducing stage.

Keywords:Camphor tree；cold resistance；SOD activity；comprehensive evaluation

作者簡介：王寧（1979-），男，河南鄢陵人，講師，博士，主要從事園林植物抗逆性相關研究. E-mail:hnkjdxwangning2013@163.com

基金項目：河南省教育廳高等學校重點科研項目（16A220001）；河南科技大學青年科學基金項目（2013QN018）

收稿日期：2013-10-12修回日期：2013-12-18

中圖法分類號：S722.7

文獻標識碼：A

文章編號：1000-2324（2016）01-0037-06