重組絲氨酸蛋白酶抑制劑對鏈脲佐菌素誘導的2型糖尿病大鼠的影響

于紀棉　王建峰張玉琳　黃素文倪健波(寧波衛生職業技術學院，浙江　寧波　3500)

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重組絲氨酸蛋白酶抑制劑對鏈脲佐菌素誘導的2型糖尿病大鼠的影響

于紀棉王建峰1張玉琳黃素文1倪健波1(寧波衛生職業技術學院，浙江寧波315100)

〔摘要〕目的探討重組絲氨酸蛋白酶抑制劑( Vaspin)對鏈脲佐菌素( STZ)誘導的2型糖尿病大鼠的影響。方法通過體外表達獲得重組Vaspin蛋白。采用高脂飼料加小劑量注射STZ誘導2型糖尿病SD大鼠模型，對照組大鼠給予普通飼料喂養。將造模成功的大鼠隨機分成兩組，實驗組腹腔注射100 μl 0．5 mg/ml重組Vaspin蛋白，模型組以生理鹽水代替，每天給藥1次，連續給藥2 w后，進行口服吐葡萄糖耐量( OGTT)試驗;分離血清，測定總膽固醇( TC)、甘油三酯( TG)、低密度脂蛋白膽固醇( LDL－C)、高密度脂蛋白膽固醇( HDL－C)、空腹血糖( FBG)、空腹胰島素( FINS)以及腫瘤壞死因子( TNF)－α，瘦素( Lep)的水平。結果OGTT結果顯示經過重組Vaspin蛋白腹腔注射治療后的糖尿病大鼠血糖變化曲線接近于正常，且2 h后下降至對照組大鼠水平。經過Vaspin蛋白治療2 w后，實驗組大鼠的TC、TG、LDL和FBG、FINS、胰島素抵抗( IR)均顯著降低，脂肪因子Lep和TNF－α下降至正常水平。結論該研究獲得的重組Vaspin具有活性，可以降低糖尿病大鼠的血糖，改善糖尿病大鼠的糖脂代謝和IR水平。

〔關鍵詞〕重組絲氨酸蛋白酶抑制劑;糖尿病大鼠模型;胰島素抵抗

1寧波出入境檢驗檢疫局技術中心

第一作者:于紀棉( 1983－)，女，講師，博士，主要從事病理和人體形態教學研究。

肥胖是2型糖尿病發病的獨立高危因素，可以引起胰島素抵抗( IR)和胰島素分泌功能障礙，而IR是2型糖尿病發病的一個重要原因〔1〕。最新研究證明，脂肪組織不僅是機體能量的儲存器，而且也是重要的內分泌器官，它可分泌大量的脂肪因子〔2〕，這些脂肪因子可直接或間接影響機體糖脂代謝，與IR、2型糖尿病關系密切。內臟脂肪組織來源的絲氨酸蛋白酶抑制劑( Vaspin)是一種新發現的脂肪因子，有研究表明，Vaspin在肥胖和2型糖尿病中起著重要的作用。本文通過對鏈脲佐菌素( STZ)誘導2型糖尿病大鼠注射重組的Vaspin，觀察治療效果，探討其在改善IR中的作用機制。

1材料與方法

1. 1實驗動物及分組清潔級SD雄性大鼠50只，由浙江省醫學科學院實驗動物中心提供〔實驗動物許可證號: SCXK(浙) 20080033〕，隨機分為正常對照組、糖尿病模型組、實驗組。每組10只。

1. 2試劑和儀器STZ購自美國Sigma公司;胰島素( INS)、總膽固醇( TC)、甘油三酯( TG)、低密度脂蛋白膽固醇( LDL－C)、高密度脂蛋白膽固醇( HDL－C)、腫瘤壞死因子( TNF)－α和瘦素( Lep)酶聯免疫吸附( ELISA)試劑盒(上海源葉生物科技有限公司) ;重組Vaspin蛋白(本實驗室保存) ;活力型血糖儀(美國羅氏公司) ;酶標儀MD SpectraMax M5(美國MD公司)。

1. 3獲得重組Vaspin蛋白以大鼠睪丸脂肪細胞總RNA為模板，RT－PCR擴增脂肪因子Vaspin基因，亞克隆到原核表達載體PET－30a獲得重組質粒pET－30－Vaspin，轉化至E．coli BL21 ( DE3)菌株后進行誘導表達，表達產物用Ni柱進行純化以獲得重組Vaspin蛋白。

1. 4 2型糖尿病大鼠模型制備SD大鼠適應性飼養1 w后，參照參考文獻〔3〕復制糖尿病模型。采血前禁食12 h。測定大鼠空腹血糖( FBG)，以血糖含量大于16．7 mmol/L為大鼠2型糖尿病模型造模成功的判定標準。

1. 5口服葡萄糖耐受量試驗將造模成功的大鼠隨機分為模型組和實驗組，每組10只。模型組和對照組腹腔注射100 μl生理鹽水，實驗組腹腔注射100 μl 0．3 mg/ml重組Vaspin蛋白，每天給藥1次，連續給藥2 w后，進行口服葡萄糖耐受量試驗( OGTT)，試驗前大鼠禁食12 h，用10%葡萄糖溶液( 2 g/kg)灌胃，于灌胃前0 h、灌胃后0．5、1、2 h尾靜脈取血測定血糖。

1. 6血脂、IR和其他脂肪細胞因子的測定SD大鼠連續給藥2 w后，1%戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈采血，靜置1 h后，4℃、3 500 r/min離心10 min，分離血清，置－20℃冰箱冷藏保存，用于空腹胰島素( FINS)、TC、TG、LDL－C、HDL－C以及TNF－α，Lep的測定。IR指數，采用穩態模型評估法( HOMA)中的公式HOMA IR=FINS×FBG/22．5計算〔4〕。

1. 7統計學分析采用SPSS17．0軟件進行單因素方差分析。

2結果

2. 1 Vaspin對2型糖尿病大鼠OGTT的影響模型組大鼠在0、0．5、1、2 h的血糖水平均高于對照組和實驗組( P＜0．01)，實驗組在0、0．5、1、2 h的血糖水平與對照組之間無顯著變化。見表1。

表1重組Vaspin對2型糖尿病大鼠葡萄糖耐受實驗的影響(±s，n=10，mmol/L)

表1重組Vaspin對2型糖尿病大鼠葡萄糖耐受實驗的影響(±s，n=10，mmol/L)

與模型組比較: 1) P＜0．01，2) P＜0．05，下表同

組別　0 h　0．5 h　1 h　2 h對照組　6．01±0．411)　10．71±2．021)17．34±1．291)　7．68±0．871)模型組　17．86±1．03　 29．61±2．63　 34．48±3．21　 25．12±2．01實驗組　8．86±0．571)　13．03±1．971)19．13±2．471)　9．09±0．561)

2. 2 Vaspin對2型糖尿病大鼠血脂的影響模型組大鼠TG、TC、LDL－C明顯高于對照組( P＜0．01，P＜0．05) ;實驗組的TG、TC、LDL－C明顯低于模型組( P＜0．01，P＜0．05)，但與對照組相比無顯著差異。實驗組和模型組HDL－C水平與對照組相比均無顯著變化。見表2。

2. 3 Vaspin對糖尿病大鼠FBG、FINS和IR的影響給藥2 w后，模型組大鼠FBG平均明顯高于對照組( P＜0．01) ;實驗組大鼠FBG水平明顯低于模型組( P＜0．01)，但與對照組相比無顯著差異。模型組和實驗組大鼠血清FINS水平均明顯高于對照組( P＜0．01) ;實驗組血清FINS水平與模型組相比顯著下降( P＜0．05)。模型組大鼠IR顯著高于對照組( P＜0．01) ;與模型組相比，實驗組大鼠IR顯著下降( P＜0．01)，但與對照組相比無顯著差異。見表3。

2. 4 Vaspin對脂肪因子Lep、TNF－α水平的影響與對照組比較，模型組Lep、TNF－α水平明顯高于對照組( P＜0．05) ;實驗組Lep、TNF－α水平明顯低于模型組( P＜0．05)，但與對照組相比無顯著差異。見表4。

表2重組Vaspin對2型糖尿病大鼠空腹血脂的影響( n=10±s，mmol/L)

表2重組Vaspin對2型糖尿病大鼠空腹血脂的影響( n=10±s，mmol/L)

組別　TG　TC　HDL－C　LDL－C對照組　1．48±0．191)　0．66±0．181)　1．06±0．17　 0．91±0．052)模型組　2．37±0．21　 1．65±0．51　 1．26±0．25　 1．25±0．23實驗組　1．81±0．081)　0．67±0．141)　1．17±0．31　 0．92±0．062)

表3重組Vaspin對2型糖尿病大鼠FBG、FINS、IR的影響( n=10±s)

表3重組Vaspin對2型糖尿病大鼠FBG、FINS、IR的影響( n=10±s)

組別　FBG( mmol/L)　 FINS( mU/L)　IR對照組　6．52±0．281)　22．51±3．331)　6．58±0．971)模型組　21．3±1．62　 35．3±8．07　 47．72±6．89實驗組　7．03±0．881)　30．3±3．582)　9．47±1．061)

表4重組Vaspin對2型糖尿病大鼠Lep和TNF-α的影響( n=10±s，ng/L)

表4重組Vaspin對2型糖尿病大鼠Lep和TNF-α的影響( n=10±s，ng/L)

組別　Lep　TNF－α對照組　7．51±0．412)　64．1±7．182)模型組　8．48±0．72　78．3±12．6實驗組　7．87±0．452)　65．4±7．452)

3討論

Vaspin與其他脂肪因子相比，其獨特性在于主要在哺乳動物的內臟脂肪組織中表達，并且與肥胖關系密切，正常糖調節人群中隨著BMI升高，表達Vaspin的個體比例也隨之增高，而非肥胖者脂肪組織中未檢測出Vaspin mRNA表達〔5〕。本實驗重組Vaspin蛋白具有明顯降血糖作用，并提示重組的Vaspin能改善由高脂高糖誘導的2型糖尿病大鼠的胰島素敏感性，這與國外相關研究結果較為一致〔6〕。

本實驗結果說明Vaspin對改善糖尿病大鼠糖代謝、脂代謝起積極的作用。國內外的其他研究也證實Vaspin與血糖和血脂指標的關系密切，并可能參與了糖、脂代謝紊亂的發生發展〔7，8〕。朱慧靜等〔9〕對臨床上60多列單純性肥胖進行調查研究發現Vaspin與INS及TG呈顯著正相關。

Lep也是由脂肪組織合成與分泌的一種細胞因子，具有加快能量消耗，抑制脂肪合成，調節糖代謝相關酶的作用，是能量和代謝的主要調節因子。本研究中糖尿病大鼠經過重組Vaspin治療后，可以明顯降低糖尿病大鼠體內Lep水平，推測Vaspin可能通過與Lep相互作用來調節能量代謝。相關研究也證實血清Lep水平在2型糖尿病患者中明顯高于正常者，Lep與糖尿病、IR緊密關聯〔10〕。前炎性反應狀態是引起IR和胰島β細胞功能失調的重要標志〔6〕。本研究中糖尿病大鼠經過重組Vaspin治療后大鼠體內TNF－α水平顯著降低，推測Vaspin可能通過抑制由脂肪因子或血管細胞來源的細胞因子所誘導的炎性反應，從而改善IR。

夏常杰等〔11〕研究表明利拉魯肽治療2型糖尿病患者后，糖脂代謝及胰島β細胞功能改善，胰島素敏感性增加，同時患者血漿Vaspin水平升高;孫莉等〔12〕利用羅格列酮，體外作用于分化成熟的3T3－L1脂肪細胞，可以檢測到Vaspin mRNA表達上調;由此推測某些治療2型糖尿病的藥物通過誘導Vaspin的表達水平來降低血糖，改善IR。而本實驗通過腹腔注射Vaspin后使糖尿病大鼠空腹血糖和IR的水平降低，由此推測Vaspin可能成為有效的治療糖尿病途徑之一。

綜上所述，由高脂高糖和小劑量STZ誘導的2型糖尿病大鼠，經重組Vaspin治療后可降低糖尿病大鼠的血糖，改善糖尿病大鼠的血脂和IR，進一步提示Vaspin與和2型糖尿病有密切關系，為2型糖尿病治療提供思路，但其降血糖的作用機制以及對IR的信號通路的影響尚需進一步研究。

4參考文獻

1李光偉，寧光，周智廣．2型糖尿病早期胰島素強化治療改善胰島β細胞功能——是現實還是夢想〔J〕．中華內分泌代謝雜志，2006; 22 ( 4) : 392．

2 Miner JL．The adipocyte as endocrine cell〔J〕．J Anim Sci，2004; 82: 935．

3于紀棉，張岳燦，張玉琳，等．SD大鼠2型糖尿病模型的建立〔J〕．浙江醫學，2012; 34( 24) : 1958－9．

4李光偉，潘孝仁，Lillioja S，等．檢測人群胰島素敏感性的一項新指數〔J〕．中華內科雜志，1993; 32( 10) : 656．

5 Ye Y，Hou XH，Pan XP，et al．Serum vaspin level in relation to postprandial plasma glucoseconcentration in subjects with diabetes〔J〕．Chin Med J( Engl)，2009; 122( 21) : 2530－3．

6 Hida K，Wada J，Eguchi J，et al．Visceral adipose tissue derived serine protease inhibitor: a unique insulin sensitizing adipocytokine in obesity 〔J〕．Proc Natl Acad Sci USA，2005; 102( 30) : 10610－5．

7 Bluher M．Vaspin in obesity and diabetes: pathophysiological and clinical significance〔J〕．Endocrine，2012; 41( 2) : 176－82．

8陳燕，李伶，楊剛毅，等．糖代謝改善對2型糖尿病患者血漿vaspin水平的影響〔J〕．中國糖尿病雜志，2012; 20( 9) : 650－2．

9朱慧靜，成興波，魯燕．單純性肥胖者血清Vaspin水平與胰島素抵抗的相關性〔J〕．江蘇醫藥，2010; 36( 8) : 892－4．

10張靜．Vaspin、脂聯素、瘦素與糖尿病周圍神經病變相關性的研究〔D〕．濟南:山東大學，2011．

11夏常杰，李伶，楊剛毅，等．利拉魯肽對2型糖尿病患者血漿絲氨酸蛋白酶抑制劑水平的影響〔J〕．中國老年學雜志，2011; 31( 2) : 181－3．

12孫莉，王長江，代芳，等．白細胞介素－6和羅格列酮對3T3－L1脂肪細胞Vaspin mRNA表達的影響〔J〕．安徽醫科大學學報，2009; 44( 1) : 26－31．

〔2014－09－17修回〕

(編輯曹夢園)

通訊作者:王建峰( 1981－)，男，獸醫師，碩士，主要從事動物模型、分子生物學的研究。

基金項目:浙江省教育廳科研項目( Y201432068) ;浙江省自然科學基金( Y12H070001) ;寧波市自然科學基金( 2011A610030)

〔中圖分類號〕R587. 1

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202( 2016) 02-0268-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2016. 02. 005