高鹽飲食對更年期焦慮小鼠海馬鉀離子－氯離子共轉運體2、鈉－鉀－氯離子失轉運體1表達的影響

秦莉花　李　晟葉麗芝黃　寬陳曉陽，2，3(湖南中醫藥大學護理學院，湖南　長沙　40208)

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高鹽飲食對更年期焦慮小鼠海馬鉀離子－氯離子共轉運體2、鈉－鉀－氯離子失轉運體1表達的影響

秦莉花李晟1葉麗芝1黃寬1陳曉陽1，2，3(湖南中醫藥大學護理學院，湖南長沙410208)

〔摘要〕目的研究高鹽飲食對更年期焦慮癥小鼠鉀離子－氯離子共轉運體2( KCC2)、鈉－鉀－氯離子共轉運體1( NKCC1)表達的影響。方法

將大鼠隨機分為空白組、模型組、4%高鹽飲食組、8%高鹽飲食組。其中4%高鹽飲食組、8%高鹽飲食組經高鹽飲食干預1個月后，HE染色觀察腦部結構，免疫組織化學觀察KCC2、NKCC1表達情況。結果高鹽飲食使更年期焦慮小鼠海馬區錐體細胞排列紊亂，神經元數目明顯減少，細胞輪廓模糊，出現大量的空泡現象，細胞形態不規則，細胞間隙明顯增大;模型組KCC2表達的陽性細胞明顯減少，高鹽飲食組陽性細胞極少;模型組NKCC1表達陽性細胞明顯增多，高鹽飲食組陽性細胞增多更明顯。結論高鹽飲食加重更年期焦慮癥的發生可能與KCC2及NKCC1之間的動態平衡被打破有關。

〔關鍵詞〕高鹽飲食;更年期焦慮癥;鉀離子－氯離子共轉運體2;鈉－鉀－氯離子共轉運體1

1湖南中醫藥大學藥學院2中藥現代化教育廳重點實驗室3國家中藥管理局藥性與藥效研究三級實驗室

第一作者:秦莉花( 1980－)，女，副教授，博士，主要從事更年期相關疾病研究。

更年期焦慮癥不僅影響患者的健康、社會關系、家庭生活等方面，還可引起其他精神障礙疾病，甚至產生自殺行為，且直接關系到老年期疾病的發生。因此其防治研究是臨床醫護人員乃至整個社會所面臨的重要任務。隨著年齡增長，人們味覺功能下降，在日常生活中表現為食物咸味重，研究表明我國人均吃鹽及人均每天食鹽攝入量均超標〔1〕。本研究探討高鹽飲食對更年期焦慮小鼠鉀離子－氯離子共轉運體2( KCC2)、鈉－鉀－氯離子共轉運體1( NKCC1)的影響。

1材料與方法

1. 1實驗動物選用11月齡的昆明雌性小鼠，清潔級，體重35～45 g，由長沙市開福區東創實驗動物科技服務部代購，動物合格證號: scxk(湘) 2009－0012。飼料均來自于由長沙市開福區東創實驗動物科技服務部。

1. 2試劑與儀器羊抗鼠KCC2、NKCC1多克隆抗體購自美國Sigma公司。低溫大容量高速離心機(型號: KDC－2046低溫大容量離心機，中國科學技術大學科技實業有限公司) ;電子天平(型號: ES－C－600電子天平，湘儀天平儀器有限公司)。

1. 3分組連續5 d進行小鼠陰道涂片檢查，呈現不規則動情周期的小鼠為自然更年期小鼠。將40只更年期小鼠隨機分為空白組、模型組、4%高鹽飲食組、8%高鹽飲食組。分組后空白組和模型組小鼠繼續給予普通飼料，4%高鹽飲食組小鼠予含4%的NaCl高鹽顆粒飼料，8%高鹽飲食組小鼠予含8%的NaCl高鹽顆粒飼料喂養，自由攝食，自由飲用自來水，連續1個月。

1. 4模型制備①高架十字迷宮模型:參照文獻〔2〕自制高架十字迷宮，測試方法參照〔2，3〕。②明暗箱:參照文獻〔2，4〕自制，測試測試方法參照〔2，3〕。③曠場實驗:參照文獻〔5〕自制，測試測試方法參照〔3，4〕。

1. 5 HE染色實驗第31天取材，麻醉灌注取腦，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，常規HE染色，脫水透明封固，制成切片，光學顯微鏡觀察。

1. 6免疫組織化學實驗第31天取材，麻醉灌注取腦，4%多聚甲醛固定，經脫水、透明、包埋，選擇海馬部位冠狀位連續冷凍切片。以SABC法進行免疫組織化學:加入0．3% H2O210 min，3%正常山羊血清封閉10 min;滴加一抗( 1∶100)，過夜(陰性對照組以正常羊血清替代一抗)，加入羊抗兔IgG、SABC，室溫放置2 h，PBS沖洗鋪片，DAB顯色劑顯色，脫水，封片。每只大鼠取3張切片，每張切片選取3個無重疊在顯微鏡(× 400)下觀察海馬區NKCC1、KCC2的表達情況。

1. 7統計學方法組間比較行t檢驗。

2結果

2. 1高鹽飲食對更年期焦慮癥小鼠腦部結構的影響空白組海馬區細胞排列整齊，細胞核圓而大，核仁清晰可見，錐體細胞排列整齊，層次緊密;模型組海馬區錐體細胞排列較紊亂，神經元數目減少，細胞輪廓較清晰，出現空泡現象，細胞形態不規則，細胞間隙相對增大;高鹽飲食組海馬區錐體細胞排列紊亂，神經元數目明顯減少，細胞輪廓模糊，出現大量的空泡現象，細胞形態不規則，細胞間隙明顯增大，8%高鹽飲食組表現比4%高鹽飲食組更明顯，見圖1。

2. 2高鹽飲食對更年期焦慮癥小鼠腦海馬KCC2表達的影響在高倍光學顯微鏡下，觀察細胞陽性著色情況，與空白組比較，模型組KCC2表達陽性細胞明顯減少，高鹽飲食組陽性細胞極少，且4%和8%高鹽組之間沒有明顯的差異。見圖2。

2. 3高鹽飲食對更年期焦慮癥小鼠腦海馬NKCC1表達的影響在高倍光學顯微鏡下，觀察視野范圍內細胞陽性著色情況，與空白組比較，模型組NKCC1表達陽性細胞明顯增多，高鹽飲食組陽性細胞增多更明顯，但4%和8%高鹽組之間沒有明顯的差異。見圖3。

圖1高鹽飲食對更年期焦慮癥小鼠腦部結構的影響( HE，×400)

圖2高鹽飲食對更年期焦慮癥小鼠腦海馬KCC2的影響( DAB，×400)

圖3高鹽飲食對更年期焦慮癥小鼠腦海馬NKCC1的影響( DAB，×400)

3討論

合理的飲食結構是現代中醫護理中飲食護理的中心內容之一。目前提倡合理的飲食結構，雖根據每個人的機體狀況而有所不同，但總體而言首先應避免偏嗜。早古代醫家就已強調飲食不宜過咸，應少吃鹽。現代文獻也報道食物與人的情緒有關，如多食咸味、甘味，使鹽、糖攝入過多，情緒容易激動。澳大利亞學者曾歷時10年的跟蹤調查結果顯示，飲食結構與抑郁、焦慮等精神紊亂之間存在密切的關系〔5〕。

KCC2分布于神經元細胞膜上的轉運蛋白，是神經元細胞內氯離子外排的主要因素，使Cl－由細胞內移向細胞外，降低胞內的Cl－濃度; NKCC1分布于上皮細胞和非上皮細胞膜上，則順著內向Na梯度促使Cl－由細胞外移向細胞內，促進細胞內Cl－堆積，故Cl－排出系統( KCC2)及Cl－聚集系統( NKCC1)之間的動態平衡決定中樞神經系統中〔Cl－〕i。γ－氨基丁酸( GABA)產生興奮性和抑制性作用之間的進行轉化的關鍵因素在神經元細胞內Cl－濃度差〔6〕，而功能相反的氯離子共轉運體KCC2/ NKCC1是中樞神經系統內調節Cl－濃度差、調控GABA效應轉化的關鍵因素〔7，8〕。研究表明，KCC2基因敲除的大鼠，其腦內GABA的抑制作用下降〔9〕。NKCC1 mRNA表達增高及KCC2mRNA表達降低的變化可能引起神經元細胞內Cl－濃度增高，Cl－梯度的崩潰，Cl－內流減少，細胞膜超級化減弱，從而導致GABA能抑制作用的減弱，神經元高興奮性，使癲癇易感性增加〔10〕。課題研究前期采用EPM、高架十字迷宮成功制備焦慮癥模型，且高鹽飲食可加重動物焦慮程度，減少其活動次數〔3〕，本研究結果顯示高鹽飲食加重更年期焦慮癥的發生可能與高鹽飲食使細胞內外的Na+、Cl－水平發生改變，KCC2及NKCC1之間的動態平衡被打破，但具體機制有待進一步研究。

4參考文獻

1崔同樣，黃靜，郭海寧．我國居民食用食鹽的研究分析〔J〕．內江師范學院學報，2011; 26( B07) : 189－91．

2 HG沃格爾，WH沃格爾．藥理學實驗指南新藥發現和藥理學評價〔M〕．北京:科學出版社，2001: 280．

3黃寬，葉麗芝，李晟，等．高鹽飲食對更年期焦慮癥小鼠的行為學的影響〔J〕．湖南中醫雜志，2013; 29( 12) : 130－2．

4張均田．現代藥理實驗方法(上冊)〔M〕．北京:北京醫科大學、中國協和醫科大學聯合出版社，1998: 1047．

5徐志偉，王文竹，蘇俊芳，等．逍遙散和丹梔逍遙散抗焦慮作用的實驗研究〔J〕．廣州中醫藥大學學報，2006; 23( 4) : 330－1．

6孫兵．改變飲食結構可緩解抑郁焦慮情緒〔J〕．老年健康，2011; 6 ( 1) : 4．

7王曉民．神經科學進展(四)〔M〕．北京:高等教育出版社，2006: 139－ 46．

8 Kahle KT，Staley KJ，Nahed BV，et al．Roles of the cation chloride cotransporters in neurological disease〔J〕．Nat Clin Pract Neurol，2008; 4 ( 9) : 490－503．

9 Galanopoulou AS．Developmental patterns in the regulation of chloride homeostasis and GABA( A) receptor signaling by seizures〔J〕．Epilepsia，2007; 48( Suppl) : 514－8．

10王德廣．氯離子轉運體KCC2和腦缺血的研究〔D〕．安徽:中國科學技術大學，2005．

〔2014－09－09修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

通訊作者:陳曉陽( 1953－)，女，教授，主任醫師，碩士，碩士生導師，主要從事中藥藥性理論基礎與應用、藥理研究。

基金項目:湖南省教育廳科研項目( No．12C0253)

〔中圖分類號〕R271. 19

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202( 2016) 02-0270-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2016. 02. 006