順鉑通過抑制RIP活性增強rhTRAIL殺傷肺癌A549細胞

許淑芬　王英凱　劉　磊　孫牧男　譚　巖　方艷秋(吉林省人民醫院醫學診治實驗中心，吉林　長春　130021)

?

順鉑通過抑制RIP活性增強rhTRAIL殺傷肺癌A549細胞

許淑芬王英凱劉磊孫牧男譚巖方艷秋
(吉林省人民醫院醫學診治實驗中心，吉林長春130021)

〔摘要〕目的探討順鉑( DDP)通過抑制受體相互作用蛋白( RIP)增強肺癌細胞A549對腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體( TRAIL)敏感性的分子機制。方法Western印跡檢測順鉑、Nec－1作用A549細胞后RIP的蛋白表達。MTT法檢測聯合應用DDP+ rhTRAIL和Nec－1 +rhTRAIL作用后A549細胞的生長抑制率。Western印跡檢測DDP+ rhTRAIL和Nec－1+rhTRAIL對A549凋亡相關蛋白caspase－8的活化情況。流式細胞儀檢測DDP+ rhTRAIL和Nec－1 +rhTRAIL作用后對A549細胞凋亡的影響。結果DDP和Nec－1能顯著降低A549細胞中RIP的蛋白水平，DDP、Nec－1聯合rhTRAIL可以實現caspase－8的活化，促進rhTRAIL對A549細胞的殺傷作用，凋亡率從( 5．9±4．93) %提高到( 60．5±4．93) %和( 64．1±5．17) %( P＜0．01)。抑制率分別提高到( 65．5±4．93) %和( 76．3±9．52) %( P＜0．01)。結論抑制RIP蛋白活性能增加A549細胞對rhTRAIL誘導細胞凋亡的敏感性，有利于促進rhTRAIL蛋白在治療NSCLC方面的應用。

〔關鍵詞〕重組TRAIL蛋白;受體相互作用蛋白;順鉑;非小細胞肺癌

腫瘤壞死因子( TNF)相關的凋亡誘導配體( TRAIL)是一種殺傷腫瘤的細胞因子，是TNF家族成員之一，能夠誘導腫瘤細胞凋亡，對正常細胞無殺傷作用〔1〕。研究發現TRAIL蛋白可以誘導非小細胞肺癌( NSCLC)發生凋亡，但部分NSCLC對 TRAIL顯示耐藥，限制了TRAIL廣泛應用〔2〕。受體相互作用蛋白( RIP)在細胞的凋亡過程中發揮了重要作用〔3〕，在促細胞凋亡的信號轉導中，RIP的C末端死亡結構域能與TRAIL受體蛋白相互作用，形成復合物，導致細胞凋亡〔4〕。Nec－1是RIP的高度特異性抑制劑，通過變構抑制RIP1的活性〔5〕。本研究分別應用順鉑( DDP)和Nec－1抑制RIP表達，探討抑制RIP表達能否增強rhTRAIL蛋白誘導的NSCLC細胞凋亡。

1材料與方法

1. 1主要材料細胞株A549由本室保存;重組rhTRAIL由本室制備純化〔2〕; IMDM培養基、胰蛋白酶( Gibco公司) ;小牛血清(杭州四季青生物材料公司) ; Nec－1( Calbiochem公司) ;鼠抗人抗caspase－8、鼠抗人抗RIP( BD Pharmingen公司) ;兔抗人βactin單克隆抗體( Santa Cruz公司) ;四甲基偶氮唑藍( MTT) ( Sigma公司) ;生物素標記的馬抗小鼠IgG及辣根過氧化物酶標記的親和素(北京晶美公司)。

1. 2 DDP、Nec－1對RIP的抑制復蘇NSCLC A549細胞株，采用IMDM培養液(含10%滅活胎牛血清)在37℃、飽和濕度、5% CO2培養箱中培養。常規傳代，生長至對數生長期。5× 105個/ml接種于6孔板中，實驗分為加入5 μg/ml DDP、10 μg/ml Nec－1、對照A549細胞、培養液四組，作用24 h后，免疫印亦觀察A549細胞的RIP蛋白水平。

1. 3 Western印跡檢測RIP蛋白表達加入DDP、Nec－1后24 h收集各組A549細胞，用裂解液制備總蛋白，測定蛋白含量并調整濃度為10 μg/μl。10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜、脫脂奶粉封閉。加入稀釋的小鼠抗RIP工作液，4℃振搖孵育過夜，加入二抗室溫下孵育。TBST液洗膜，加入顯色劑DAB，室溫下顯色。以β－actin作為內參照，檢測各組細胞RIP蛋白表達情況。

1. 4 MTT法檢測A549細胞抑制率將5×105/ml NSCLC A549株細胞分別接種于96孔板，每孔100 μl。分別加入DDP+ rhTRAIL( 100 ng/ml)、25 μg/ml Nec－1+ rhTRAIL( 100 ng/ml)、rhTRAIL及空白對照組，每組設3平行孔，培養24 h后，加入新配制的5 mg/ml MTT 20 μl，37℃繼續孵育4 h，棄上清加入150 μl DMSO溶解，混勻后在490 nm處測定吸光度。

1. 5 caspase－8活化的檢測Western印跡測定DDP+ rhTRAIL ( 100 ng/ml)、25 μg/ml Nec－1+ rhTRAIL( 100 ng/ml)、rhTRAIL及空白對照組作用A549細胞株后caspase－8活化表達(方法同1. 3)。

1. 6 A549細胞凋亡率的檢測取生長狀態良好的A549細胞接種于6孔板中，分別加入DDP + rhTRAIL ( 100 ng/ml)、25 μg/ml Nec－1+ rhTRAIL( 100 ng/ml)、rhTRAIL作用，培養24 h后收集A549細胞，AnnexinV－FITC/PI染色，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1. 7統計學分析采用SPSS11．5軟件行t檢驗。

2結果

2. 1 DDP、Nec－1對A549細胞中RIP表達的抑制蛋白印跡結果顯示，DDP、Nec－1作用于A549細胞24 h后，RIP蛋白表達量顯著降低(圖1)。

1．空白對照; 2．rhTRAIL; 3．DDP+rhTRAIL; 4．Nec－1+ rhTRAIL;圖3同圖1 DDP、Nec-1對A549細胞中RIP蛋自表達的影響

2. 2 MTT法檢測A549細胞增殖抑制率單獨應用rhTRAIL作用A549細胞24 h后，細胞生長抑制率僅為( 7．62±0．62) %; Nec－1+rhTRAIL作用24 h后，A549細胞的生長抑制率增加到( 76．3±9．52) %; DDP+ rhTRAIL作用24 h后，A549細胞的生長抑制率為( 65．47±4．93) %。Nec－1+rhTRAIL、DDP+ rhTRAIL均能顯著增強rhTRAIL對A549細胞的殺傷活性( P＜0．01)，Nec－1+rhTRAIL與DDP+rhTRAIL組比較，A549細胞的生長抑制率差異不顯著( P＞0．05)，見圖2。

2. 3 caspase－8活化的檢測DDP、Nec－1均有助于55 kD的caspase－8蛋白活化成為具有催化活性的43 kD caspase－8，促進rhTRAIL蛋白誘導的腫瘤細胞凋亡級聯反應，見圖3。

圖2 DDP聯合rhTRAIL對A549細胞增殖的抑制作用

圖3蛋自印跡分析A549細胞內caspase-8的表達

2. 4 A549細胞凋亡率的檢測DDP + rhTRAIL和Nec－1+ rhTRAIL組的平均凋亡率分別為( 60．52±4．93) %和( 64．12± 5．17) %，顯著高于rhTRAIL組的( 5．9±4．93) %，提示抑制RIP表達能促進A549細胞凋亡。

3討論

TRAIL凋亡療法被認為是一種極具潛力的抗腫瘤治療策略。TRAIL蛋白可以有效殺傷NSCLC細胞，但一些TRAIL耐藥株的出現制約了其應用〔6〕。TRAIL對腫瘤細胞的殺傷作用主要是通過與細胞表面的受體結合，誘導細胞內凋亡信號通路的活化完成〔7〕。研究證實，在多種耐藥細胞株中，某些凋亡抑制基因的過表達是導致凋亡信號終止的重要因素〔8〕。RIP的高表達能夠激活I－κB激酶( IKK)復合物，磷酸化I－κB，使其被泛素－蛋白酶體途徑降解，并從NF－κB/I－κB異二聚體中脫離。此時，NF－kB活化并可轉移到核內，調節其下游的靶基因IL－6、A20等的表達，這些蛋白可以減少細胞凋亡的發生〔9，10〕。

本研究證實，rhTRAIL蛋白作用A549細胞后，caspase－8未能被活化，其誘導A549細胞的凋亡率很低，A549細胞表現出對rhTRAIL蛋白耐藥;聯合應用DDP及RIP抑制劑Nec－1均可有效下調RIP的表達，同時，caspase－8裂解帶出現，說明DDP聯合TRAIL作用A549細胞是通過下調RIP蛋白并活化caspase－8蛋白、激活了細胞內的凋亡信號通路來實現的。綜上所述，RIP參與了DDP聯合rhTRAIL誘導NSCLC細胞的凋亡，使caspase－8蛋白表達活化，凋亡信號通路開放，促進了rhTRAIL蛋白對A549細胞的生長抑制作用，為更好地開展TRAIL治療NSCLC提供了實驗依據和理論基礎。

4參考文獻

1 Parkin DM，Brav F，Ferlay J，et al．Global cancer statistics，2002〔J〕．CA Cancer J Clin，2005; 55( 2) : 74－108．

2劉磊，方艷秋，譚巖，等．重組可溶性TRAIL表達及誘導A549 和H460wt細胞凋亡〔J〕．吉林大學學報(醫學版)，2008; 34( 2) : 270－3．

3 Declercq W，Vanden Berghe T，Vandenabeele P，et al．RIP kinases at the crossroads of cell death and survival〔J〕．Cell，2009; 138( 2) : 229－32．

4 Festjens N，Vanden Berghe T，Cornelis S，et al．RIP1，a kinase on the crossroads of a cell's decision to live or die〔J〕．Cell Death Differ，2007; 14( 3) : 400－10．

5 Degterev A，Hitomi J，Germscheid M，et al．Identification of RIP1 kinase as a specific cellular target of necrostatins〔J〕．Nat Chem Biol，2008; 4 ( 5) : 313－21．

6 Sun SY，Yue P，Zhou JY，et al．Overexpression of BCL2 blocks TNF－related－apoptosis－inducing ligand ( TRAIL)－induced apoptosis in human lung cancer cells〔J〕．Biochem Biophys Res Commun，2001; 280( 3) : 788－98．

7 Ashkenazi A，Pai RC，Fong S，et al．Safety and antitumor activity of recombinant soluble Apo2 ligand〔J〕．J Clin Invest，1999; 104( 2) : 155－62．

8 Kim YS，Jin，HO，Seo SK，et al．Sorafenib induces apoptotic cell death in human non－small cell lung cancer cells by down－regulating mammalian target of rapamycin mTOR－dependent survivin expression〔J〕．Biochem Pharmacol，2011; 82( 3) : 216－26．

9 Tomasella A，Blangy A，Brancolini C．A receptor interacting protein 1 ( RIP1)－independent necrotic death under the control of protein phosphatase PP2A that involves the reorganization of actin cytoskeleton and the action of cofilin－1〔J〕．J Biol Chem，2014; 289: 25699－710．

10 Zhang YF，He W，Zhang C，et al．Role of receptor interacting protein ( RIP) 1 on apoptosis－inducing factor－mediated necroptosis during acetaminophen－evoked acute liver failure in mice〔J〕．Toxicol Lett，2014; 225: 445－53．

〔2015－11－12修回〕

(編輯郭菁)

通訊作者:譚巖( 1956－)，男，博士，博士生導師，主要從事腫瘤生物治療的臨床及基礎研究。

基金項目:吉林省衛生廳資助項目( 20082036)

〔中圖分類號〕R734. 2

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202( 2016) 02-0276-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2016. 02. 009

第一作者:許淑芬( 1962－)，女，主任技師，主要從事免疫與分子生物學技術研究。