姜黃素對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠MMP－2活性和血腦屏障通透性的影響

王一凡　楊霄鵬　曾志磊　白宏英　婁季宇　(鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南　鄭州　450014)

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姜黃素對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠MMP－2活性和血腦屏障通透性的影響

王一凡楊霄鵬曾志磊白宏英婁季宇(鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南鄭州450014)

〔摘要〕目的探討姜黃素降低腦缺血再灌注損傷大鼠血腦屏障通透性及減輕腦水腫的作用及機(jī)制。方法將90只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組( n=30)、缺血再灌注組( n=30)、姜黃素治療組( n=30)。以線栓法制備局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠模型，腹腔注射姜黃素，各組于腦缺血再灌注后24 h、48 h、96 h用免疫組織化學(xué)方法觀察損傷側(cè)腦組織基質(zhì)金屬蛋白酶( MMP)－2活性及層黏連蛋白表達(dá)的變化。比色法測(cè)定損傷側(cè)腦組織含有伊文思藍(lán)( EB)的量，動(dòng)態(tài)觀察該側(cè)血腦屏障通透性變化。結(jié)果隨著缺血再灌注時(shí)間逐漸延長(zhǎng)，MMP－2表達(dá)能力、EB含量均逐漸增加，48 h達(dá)峰，層黏連蛋白的表達(dá)逐漸下降，各組之間表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異( P＜0．05) ;姜黃素治療組MMP－2表達(dá)、EB含量在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)明顯低于缺血再灌注組，同時(shí)層黏連蛋白的表達(dá)增加( P＜0．05)。結(jié)論姜黃素可抑制腦缺血再灌注損傷大鼠MMP－2的表達(dá)，增加層黏連蛋白的表達(dá)，降低血腦屏障通透性，從而減輕腦水腫。

〔關(guān)鍵詞〕姜黃素;基質(zhì)金屬蛋白酶－2;層黏連蛋白

缺血性腦血管病發(fā)生后，急性期動(dòng)脈溶栓治療后易出現(xiàn)腦水腫，進(jìn)而對(duì)腦組織造成的損害加重，就是腦缺血再灌注損傷〔1〕。研究表明血腦屏障( BBB)的通透性與基質(zhì)金屬蛋白酶( MMP)－2之間存在較為密切的關(guān)聯(lián)〔2〕，血管基底膜的層黏連蛋白能被其降解而引發(fā)腦水腫。姜黃素為天南星科植物的根蓋中提取的一種二酮多酸類化合物，對(duì)缺血、缺氧后的神經(jīng)組織損害具有保護(hù)作用〔3〕，其機(jī)制是否為通過(guò)抑制MMP－2和層黏連蛋白的表達(dá)來(lái)影響B(tài)BB通透性而發(fā)揮作用目前尚不能明確。此次研究擬了解姜黃素在治療腦缺血再灌注損傷過(guò)程中的作用機(jī)制，也為其臨床應(yīng)用提供更多理論支持。

1材料與方法

1. 1實(shí)驗(yàn)對(duì)象及分組由鄭州大學(xué)動(dòng)物中心提供的雄性SD成年大鼠90只，體重250～300 g。隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血再灌注組、姜黃素治療組，每組30只。各組每次取5只大鼠分別于處理后24 h、48 h、96 h測(cè)定其MMP－2、層黏連蛋白免疫組化結(jié)果;分別于上述不同時(shí)間點(diǎn)各組再各取5只，進(jìn)行BBB通透性的研究。

1. 2藥物及試劑姜黃素購(gòu)自美國(guó)Cayman Chemical公司，MMP－2兔多克隆抗體、層黏連蛋白兔多克隆抗體購(gòu)自武漢博士德公司，二氨基聯(lián)苯胺( DAB)試劑盒、SP9000試劑盒、伊文思藍(lán)( EB)、甲酰胺溶液等購(gòu)自北京中杉生物工程公司。

1. 3給藥方法假手術(shù)組不予給藥，姜黃素治療組于缺血前1 h給予腹腔注射姜黃素50 mg/kg，缺血再灌注組則于同時(shí)給予等劑量溶媒腹腔注射。

1. 4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立擬參照Z(yǔ)ea longa線栓法〔4〕加以改良建立大鼠缺血再灌注模型。首先稱重并麻醉大鼠，頸部正中切口，分離出大鼠左側(cè)頸總動(dòng)脈( CCA)、左側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈( ICA)和頸外動(dòng)脈( ECA)。結(jié)扎CCA、ECA根部，于CCA分叉處剪一小口插入一根尼龍漁線(漁線頭段燒成球狀)，遇阻力后停止，扎緊并固定栓線，縫合皮膚。缺血2 h后，將栓線抽出約10 mm使CCA內(nèi)實(shí)現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組麻醉和手術(shù)過(guò)程同上，但分離血管后不插入尼龍漁線。

1. 5免疫組織化學(xué)方法測(cè)定層黏連蛋白及MMP－2蛋白按再灌注時(shí)間點(diǎn)麻醉大鼠，開胸暴露心臟，先以生理鹽水灌注，繼之用4%多聚甲醛溶液進(jìn)行內(nèi)固定，完整取大鼠腦組織外固定，72 h后進(jìn)行脫水、石蠟包埋，最后制備冠狀切片。鏈霉菌抗生物素蛋白－過(guò)氧化物酶( SP)法免疫組化觀察MMP－2和層黏連蛋白表達(dá)，胞質(zhì)被染成棕黃色的為MMP－2陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞，層黏連蛋白表達(dá)于細(xì)胞間質(zhì)，呈條索狀棕褐色，觀察缺血側(cè)的組織切片上5個(gè)不同視野，400倍鏡下計(jì)數(shù)，奧林巴斯相機(jī)拍照。

1. 6 EB標(biāo)本采集與測(cè)定各灌注時(shí)間點(diǎn)前30 min由舌靜脈推注EB溶液( 2 ml/kg)，灌注時(shí)間點(diǎn)斷頭取腦棉紙吸干腦表面水分，電子天平稱濕重，每100 mg腦組織加入1 ml二甲基酰胺中，于45℃恒溫水浴24 h，離心機(jī)1 000 r/min離心10 min，分離出上清液，置于可見光分光光度計(jì)(λ= 632)中，測(cè)定上清液光密度OD值，二甲基酰胺做空白比色。腦組織EB含量為觀察指標(biāo):腦組織EB含量(μg/g) =待測(cè)樣品EB含量(μg/ml)×甲酞胺容量( ml)÷腦濕重( g)，待測(cè)樣品EB含量根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程求得。

2結(jié)果

2. 1姜黃素對(duì)MMP－2活性的影響假手術(shù)組MMP－2在各時(shí)間點(diǎn)均低表達(dá)，缺血再灌注組MMP－2的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)約于24 h開始升高，48 h最明顯，姜黃素組發(fā)現(xiàn)其可以降低缺血再灌注大鼠腦組織中MMP－2的表達(dá)( P＜0．05)，見表1。

表1姜黃素對(duì)大鼠MMP-2表達(dá)的影響( n=5±s)

表1姜黃素對(duì)大鼠MMP-2表達(dá)的影響( n=5±s)

與假手術(shù)比較: 1) P＜0．05;與缺血再灌注組比較: 2) P＜0．05;下表同

組別　24 h　48 h　96 h假手術(shù)組　10．44±0．47　 10．51±0．52　 10．39±0．81缺血再灌注組　24．81±1．221)　35．12±3．011)　30．23±2．921)姜黃素治療組　19．22±1．852)　30．64±2．862)　25．46±1．992)

表2姜黃素對(duì)大鼠層粘連蛋白陽(yáng)性血管計(jì)數(shù)的影響( n=5±s)

表2姜黃素對(duì)大鼠層粘連蛋白陽(yáng)性血管計(jì)數(shù)的影響( n=5±s)

組別　24 h　48 h　96 h假手術(shù)組　22．80±1．21　 22．15±0．97　 22．66±1．11缺血再灌注組　16．56±0．921)　12．92±1．131)　14．55±0．971)姜黃素治療組　19．45±1．062)　16．03±1．962)　18．52±1．822)

2. 2姜黃素對(duì)層黏連蛋白表達(dá)的影響見表2。與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組層黏連蛋白血管計(jì)數(shù)各時(shí)間點(diǎn)均減低，48 h相對(duì)明顯;姜黃素治療組各時(shí)間點(diǎn)層黏連蛋白陽(yáng)性、微血管計(jì)數(shù)較缺血再灌注組均有升高( P＜0．05)。

2. 3姜黃素對(duì)BBB通透性的影響缺血再灌注組缺血側(cè)腦組織EB含量在24 h開始升高，48 h達(dá)到高峰，姜黃素治療組與缺血再灌注組比較，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)EB含量均明顯降低，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＜0．05)，見表3。

表3姜黃素對(duì)大鼠EB含量的影響( n= 5±s，mg/g濕重)

表3姜黃素對(duì)大鼠EB含量的影響( n= 5±s，mg/g濕重)

組別　24 h　48 h　96 h假手術(shù)組　3．06±0．51　 2．98±0．48　 3．11±0．69缺血再灌注組　5．10±0．531)　7．32±0．491)　6．04±0．331)姜黃素治療組　4．09±0．442)　5．67±0．512)　4．98±0．472)

3討論

腦缺血再灌注損傷后腦組織水腫的兩大病理機(jī)制是細(xì)胞源性水腫與血管源性水腫，后者主要通過(guò)對(duì)BBB的完整性的破壞，使血管通透性提高即大分子量的血漿蛋白及水分外滲。多項(xiàng)研究顯示:腦缺血再灌注后MMPs的表達(dá)增加，其中以MMP－2與再灌注損傷的關(guān)系更為密切〔5〕。MMPs是一組鋅依賴蛋白酶，MMP－2是MMPs家族中26個(gè)成員之一，是一種分子量為92 kD的非糖化膠原酶。神經(jīng)組織中的MMP－2以無(wú)活性前體由血管內(nèi)皮細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞等分泌〔6〕，被蛋白酶切割后激活，其作用為降解腦微血管細(xì)胞外基質(zhì)( ECM)，包括血管基底膜的膠原、層黏連蛋白和纖維連接蛋白等，引起B(yǎng)BB開放，使BBB正常結(jié)構(gòu)破壞、通透性增加，導(dǎo)致血管源性腦水腫的出現(xiàn)。EB溶液進(jìn)入血液后即與血漿蛋白結(jié)合，血漿蛋白不能通過(guò)結(jié)構(gòu)完整的BBB，只有在BBB被破壞時(shí)結(jié)合在蛋白上的EB才能進(jìn)入腦組織，因此作為指示劑的EB可看做評(píng)估BBB損傷程度的定性指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示:缺血再灌注時(shí)間越延長(zhǎng)，EB含量與MMP－2活性、層黏連蛋白的表達(dá)關(guān)系越密切。MMP－2缺血再灌注24 h表達(dá)增高，48 h達(dá)高峰，96 h表達(dá)開始下降;各時(shí)間點(diǎn)層黏連蛋白表達(dá)與MMP－2呈負(fù)相關(guān);而EB含量在24 h升高，48 h最高，96 h開始下降與層黏連蛋白呈負(fù)相關(guān)。與假手術(shù)組相比，缺血再灌注組不同時(shí)間點(diǎn)EB含量均明顯增高。由此可以推斷，MMP－2的活性及BBB基底膜層黏連蛋白表達(dá)減少與BBB通透性增加具有相關(guān)性。

姜黃素提取自姜黃屬藥用植物的一類黃色多酚物質(zhì)。研究證明，其具有抗腫瘤、抗免疫、抗氧化、抗纖維化和抗炎癥〔7〕等多重生物學(xué)作用。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)姜黃素對(duì)腦缺血后的神經(jīng)損傷具有保護(hù)作用。Liu等〔3〕發(fā)現(xiàn)姜黃素可以通過(guò)抑制含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶的表達(dá)而起到抗凋亡作用。姜黃素可以降低原代培養(yǎng)神經(jīng)元缺氧缺糖損傷導(dǎo)致的還原型輔酶Ⅱ高表達(dá)，同時(shí)啟動(dòng)磷脂酰肌醇3激酶/絲氨酸蘇氨酸激酶( PI3K/AKt)信號(hào)通路，從而降低神經(jīng)細(xì)胞的損傷〔8〕。本研究結(jié)果表明，姜黃素治療后，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)損傷側(cè)大鼠腦組織MMP－2表達(dá)均降低，層黏連蛋白陽(yáng)性血管數(shù)量增加顯著，腦組織EB含量下降明顯即BBB通透性降低。

綜上所述，姜黃素通過(guò)對(duì)MMP－2活性的抑制作用，減少層黏連蛋白降解破壞、降低BBB通透性、減輕血管源性腦水腫可能是其對(duì)抗腦缺血再灌注損傷的機(jī)制之一。但姜黃素對(duì)腦缺血再灌注損傷的確切保護(hù)途徑尚需更加深入的研究闡明。

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〔2015－12－09修回〕

(編輯袁左鳴)

通訊作者:婁季宇( 1952－)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事腦血管疾病的研究。

基金項(xiàng)目:河南省科技廳科技攻關(guān)項(xiàng)目資助( 201303087)

〔中圖分類號(hào)〕R743. 3

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202( 2016) 02-0280-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2016. 02. 011

第一作者:王一凡( 1988－)，女，在讀碩士，主要從事腦血管疾病的研究。