人胎盤組織液對自然衰老大鼠海馬區(qū)細胞凋亡和氧化應(yīng)激的影響

劉師兵　徐　冶　于　洋　李松巖　張國昊陳　彤高　磊(吉林醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)科研實驗室，吉林　吉林　3203)

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人胎盤組織液對自然衰老大鼠海馬區(qū)細胞凋亡和氧化應(yīng)激的影響

劉師兵徐冶于洋李松巖張國昊1陳彤1高磊1
(吉林醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)科研實驗室，吉林吉林132013)

〔摘要〕目的探討人胎盤組織液對自然衰老大鼠大腦海馬區(qū)凋亡相關(guān)蛋白及氧化應(yīng)激水平的影響及人胎盤組織液的抗衰老作用。方法將雄性SD大鼠平均分為四組，每日分別腹腔注射生理鹽水和低、中、高劑量的人胎盤組織液，連續(xù)注射24 w。應(yīng)用HE染色、脂褐素染色、免疫組化技術(shù)檢測腦組織超氧化物歧化酶( SOD)活性和丙二醛( MDA)含量，觀察人胎盤組織液對Bcl－2、Bax蛋白表達量以及Bcl－2/Bax比例的變化，以及對衰老大鼠大腦細胞氧化自由基損傷的影響。結(jié)果模型組大鼠大腦海馬區(qū)Bax蛋白及脂褐素表達量明顯高于用藥組，Bcl－2蛋白表達量明顯降低;模型組SOD值低于用藥組，MDA值高于用藥組。結(jié)論人胎盤組織液能通過提高組織抗氧化能力和減少細胞凋亡從而延緩衰老。

〔關(guān)鍵詞〕人胎盤提取液;海馬神經(jīng)元; Bcl－2; Bax

1吉林醫(yī)藥學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院

第一作者:劉師兵( 1982－)，女，助理實驗師，主要從事形態(tài)學(xué)和病理學(xué)研究。

人胎盤，又名紫河車。在我國中醫(yī)史上，早就有關(guān)于其入藥、保健方面的記載。《本草拾遺》中記載:“主氣血羸瘦，婦人勞損，面黷皮黑，腹內(nèi)諸病漸瘦悴者。”認為其具有補腎益精，益氣養(yǎng)血之功。現(xiàn)在醫(yī)學(xué)研究表明，人胎盤具有抗疲勞、耐缺氧、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等方面的作用〔1〕。本實驗擬研究人胎盤組織液的抗衰老和抗氧化作用。

1材料與方法

1. 1藥品和試劑人胎盤組織液:購自康業(yè)制藥有限公司，國藥準字S13020002;兔抗Bcl－2多克隆IgG抗體、兔抗Bax多克隆IgG抗體:購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;兔免疫組化試劑盒:購自福建邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司;脂褐素染色液:購自北京雷根生物技術(shù)有限公司;超氧化物歧化酶( SOD)檢測試劑盒、丙二醛( MDA)測定試劑盒:購自南京建成生物工程研究所。

1. 2動物清潔級健康雄性SD大鼠60只，體重( 220±10) g，購自吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動物室。

1. 3儀器日本奧林巴斯FV1000型激光掃描共聚焦顯微鏡;德國Leica RM2245型石蠟切片機;德國Leica DM1000型顯微鏡;超聲波粉碎機:寧波新芝生物技術(shù)股份有限公司。

1. 4實驗方法

1. 4. 1實驗動物模型將60只雄性SD大鼠隨機平均分為模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量組。常規(guī)飼養(yǎng)48 w后，模型組大鼠1次/d腹腔注射0．4 ml生理鹽水，低、中、高劑量組分別給予1次/d腹腔注射0．1 ml、0．2 ml和0．4 ml的人胎盤組織液。造模時間為24 w。

1. 4. 2組織取材三組大鼠行3%二氟二氯乙基甲醚吸入麻醉后，斷頭取大腦，大腦左半球做組織勻漿，右半球浸入4%多聚甲醛溶液中固定48 h以上。

1. 4. 3蘇木素－伊紅( HE)染色取大鼠大腦右半球組織脫水、透明、石蠟包埋，連續(xù)4 μm石蠟切片，烤片、脫蠟后行HE染色，鏡下觀察并掃描圖像。使用光學(xué)顯微鏡觀察海馬CA1、CA2、CA3及齒狀回的細胞形態(tài)排列和數(shù)量變化，掃描圖像后各組間進行比較。

1. 4. 4脂褐素染色石蠟切片脫蠟至水，清洗后滴加復(fù)紅染色液室溫過夜，清洗后分化、復(fù)染細胞核，常規(guī)脫水、透明、封片。

1. 4. 5免疫組化取各組石蠟切片各2張，脫蠟、復(fù)水，滴加3%H2O2滅活組織中內(nèi)源性過氧化物酶的活性;檸檬酸熱修復(fù);按試劑盒說明書進行沖洗、血清封閉、各組分別滴加Bcl－2 和Bax，抗體的稀釋濃度均為1∶100。二氨基聯(lián)苯胺( DAB)顯色后，蘇木素復(fù)染細胞核，常規(guī)脫水、透明、封片。使用光學(xué)顯微鏡觀察海馬區(qū)Bcl－2和Bax蛋白表達和脂褐素染色情況，每只大鼠取1張切片掃描圖像，分別做積分光密度分析。

1. 4. 6大鼠大腦組織SOD活性、MDA含量檢測處死大鼠后迅速剝離腦組織，取大腦左半球準確稱重，按重量體積比1∶9加4℃生理鹽水制成組織勻漿液，進行蛋白標定后，嚴格按照南京建成生物工程研究所試劑盒操作步驟測定SOD活性和MDA含量。

1. 5統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS19．0軟件行方差分析。

2結(jié)果

2. 1 HE染色結(jié)果光鏡下觀察，模型組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞形態(tài)和排列改變極為明顯，排列疏松紊亂，細胞脫失明顯，胞體變形，細胞核固縮。與模型組相比，低、中、高劑量組相應(yīng)區(qū)域錐體細胞脫失現(xiàn)象均有所改善。高劑量組大鼠相應(yīng)區(qū)域的細胞形態(tài)和排列改善最為明顯，錐體細胞排列整齊，形態(tài)較完整。見圖1。

2. 2脂褐素染色結(jié)果各組大鼠海馬區(qū)及大腦皮層均有大小不等、數(shù)量不一的脂褐素表達區(qū)域，尤其在大腦皮層區(qū)的表達更最明顯，表現(xiàn)為中空形或顆粒形的大小不一的褐色色素沉著。鏡下觀察，模型組大腦皮層脂褐素分布密集且顏色更深;低、中、高劑量組大腦皮層脂褐素分布比模型組明顯減少，高劑量組脂褐素分布最為松散，且數(shù)量最少，染色較淺。統(tǒng)計學(xué)顯示，模型組脂褐素表達的積分光密度數(shù)值明顯高于低、中、高劑量組。見圖2，表1。

圖1各組自然衰老大鼠CA1區(qū)HE染色結(jié)果(×200)

圖2各組自然衰老大鼠大腦皮層脂褐素表達結(jié)果( DAB，×200)

2. 3 Bcl－2蛋白表達結(jié)果Bcl－2蛋白表達在細胞膜內(nèi)和胞質(zhì)中，DAB顯色后呈褐色。各組大鼠海馬CA1、CA2、CA3及齒狀回均有陽性表達。模型組的Bcl－2蛋白陽性表達減少，低、中、高劑量組Bcl－2蛋白的陽性表達明顯增強;高劑量組陽性表達的細胞數(shù)量更多、著色更重，并且分布密集。見圖3，表1。

2. 4 Bax蛋白表達結(jié)果Bax蛋白在各組大鼠海馬CA1、CA2、CA3及齒狀回細胞的細胞膜內(nèi)和胞質(zhì)中均有陽性表達。高劑量組有散在陽性表達，但表達強度和數(shù)量明顯少于模型組;低劑量組和中劑量組陽性表達均有增多;模型組Bax蛋白陽性分布密集，數(shù)量明顯增加，且著色更深。見圖3，表1。

2. 5各組大鼠大腦組織SOD活性、MDA含量檢測結(jié)果見表2。模型組SOD值低于用藥組，MOA值高于用藥組( P＜0．05)。

表1各組海馬CA1區(qū)脂褐素、Bcl-2和Bax蛋白陽性表達積分光密度值(±s，n=15)

表1各組海馬CA1區(qū)脂褐素、Bcl-2和Bax蛋白陽性表達積分光密度值(±s，n=15)

與模型組比較: 1) P＜0．05;與低劑量組比較: 2) P＜0．01;與中劑量組比較: 3) P＜0．01;下表同

組別　　脂褐素　Bcl－2蛋白　Bax蛋白　Bcl－2/Bax模型組　88．51±4．03　 39．12±3．61　 108．43±3．22　 0．36低劑量組　63．21±3．21　 53．51±4．07　 89．76±4．07　 0．59中劑量組42．39±3．031) 2)65．30±3．541) 2)67．45±3．351) 2)　0．96高劑量組33．47±2．252) 3)70．30±3．502) 3)54．22±4．282) 3)　1．29

圖3各組自然衰老大鼠CA1區(qū)Bcl-2、Bax蛋白表達結(jié)果( DAB，×200)

表2各組大鼠大腦組織SOD活性、MDA含量(±s，n=15)

表2各組大鼠大腦組織SOD活性、MDA含量(±s，n=15)

組別　SOD活性( U/mg)　 MDA含量( nmol/mg)模型組　27．6±3．2　4．24±0．32低劑量組　31．4±3．6　3．58±0．54中劑量組　39．5±3．51) 2)　3．12±0．241) 2)高劑量組　48．9±2．32) 3)　2．33±0．402) 3)

3討論

衰老是生物體在生命后期階段出現(xiàn)的全身性、進行性、多因素共同作用的循序漸進的退化過程〔2〕。研究表明，細胞凋亡和氧化自由基的大量生成與哺乳動物衰老有著密切的關(guān)系〔3〕。腦組織是體內(nèi)氧負荷最大的器官之一，與衰老的相關(guān)性很高。傳統(tǒng)中醫(yī)藥發(fā)現(xiàn)哺乳動物胎盤提取物質(zhì)具有“延年益壽”的抗衰老功效，同時認為其具有清除氧化自由基的作用〔4〕。但對人胎盤提取物的報道并不多見。

Bcl－2和Bax是同家族蛋白，功能卻相反。Bcl－2蛋白屬于抗凋亡蛋白，通過其編碼蛋白發(fā)揮調(diào)控作用。有研究表明，當(dāng)Bcl－2蛋白大量表達時，可具有抗氧化或抑制氧自由基產(chǎn)生的作用，從而抑制細胞凋亡〔5〕。Bax蛋白屬于促凋亡蛋白，當(dāng)其過量表達時，可自身結(jié)合成同源二聚體促進凋亡的發(fā)生。細胞Bcl－2/Bax比值是判定細胞凋亡促進或抑制狀態(tài)的重要指標〔6〕。本實驗結(jié)果顯示，人胎盤組織液能夠使Bcl－2蛋白增多，抑制Bax蛋白對細胞凋亡的促進作用。

自由基可以直接或間接地發(fā)揮強氧化作用，極易侵害細胞膜中的不飽和脂肪酸，引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，形成氧化脂質(zhì)。脂質(zhì)過氧化物的降解產(chǎn)物MDA可與游離氨基反應(yīng)形成脂褐素，積蓄在細胞質(zhì)中，引起機體衰老〔7〕。光學(xué)顯微鏡下觀察，脂褐素為1～3 μm的棕色顆粒，有的可呈現(xiàn)多葉性大顆粒，有的具有中空結(jié)構(gòu)〔8〕。根據(jù)本實驗結(jié)果推測人胎盤組織液能夠干預(yù)自由基的氧化反應(yīng)，且具有效量關(guān)系。

SOD是機體內(nèi)重要的抗氧化酶，是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)，對機體氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)平衡起著重要的作用，SOD在生物體內(nèi)的水平高低直接反映機體的抗氧化能力〔9〕。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，可反映腦組織過氧化反應(yīng)的情況，間接反映出不同組別大腦細胞衰老損傷的程度〔10〕。本實驗結(jié)果表明，人胎盤組織液具有清除體內(nèi)氧化自由基、抑制氧化損傷的抗氧化作用。

綜上所述，通過使用人胎盤組織液，能夠使大鼠大腦中抗凋亡細胞蛋白增多、促凋亡細胞蛋白減少，能夠減輕機體內(nèi)氧化自由基反應(yīng)從而達到延緩衰老的目的。

4參考文獻

1楊桂芹，鄒興淮．胎盤及其提取物的化學(xué)成分、藥理作用及臨床應(yīng)用研究進展〔J〕．沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2003; 34( 2) : 150－4．

2 Wheeler HE，Kim SK．Genetices and genomics of human ageing〔J〕．Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci，2011; 366( 1561) : 43－50．

3 Limoli CL，Kaplan MI，Giedzinski E，et al．Attenuation of radiation－induced genomic instability by free radical scavengers and cellular proliferation〔J〕．Free Radic Boil Med，2001; 31( 1) : 10．

4劉芝蘭．自由基與衰老及延緩衰老藥物干預(yù)〔J〕．臨床心身疾病雜志，2005; 11( 2) : 192－3．

5 Voehringer DW，Meyn RE．Redox aspects of Bcl－2 function〔J〕．Antioxid Redox Signal，2000; 2( 3) : 537－50．

6 Huang X，Choi JK，Park SR，et al．GM－CSF inhibits apoptosis of neural cell via regulating the expression of apoptosis－related proteins〔J〕．Neurosci Res，2007; 58( 1) : 50－7．

7李素云，王立芹，鄭稼琳，等．自由基與衰老的研究進展〔J〕．中國老年學(xué)雜志，2007; 27( 10) : 2046－8．

8趙增翰．脂褐素的研究及其進展〔J〕．國外醫(yī)學(xué):老年醫(yī)學(xué)分冊，1981; 4: 145－9．

9 Li XM，Ma YL，Liu XJ．Effect of the lycium barbarum polysaccharides on age－related oxidative stress in aged mice〔J〕．J Ethnopharmacol，2007; 111 ( 3) : 504－11．

10 Pal R，Vaiphei K，Sikander A，et al．Effect of garlic on isoniazid and rifampicin－induced hepatic injury in rats〔J〕．World J Gastroenterol，2006; 12( 4) : 636－9．

〔2015－05－11修回〕

(編輯袁左鳴)

通訊作者:徐冶( 1972－)，男，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事老年醫(yī)學(xué)和腫瘤學(xué)研究。

基金項目:吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)項目(吉教科合字〔2014〕第552號)

〔中圖分類號〕R339. 3

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202( 2016) 02-0282-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2016. 02. 012