大蒜素促進人子宮內膜癌細胞株( RL－952)細胞凋亡的機制

張　彬　陳麗紅　陳秀慧　林　瑤　(福建醫科大學附屬第一醫院婦產科，福建　福州　350005)

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大蒜素促進人子宮內膜癌細胞株( RL－952)細胞凋亡的機制

張彬陳麗紅陳秀慧林瑤(福建醫科大學附屬第一醫院婦產科，福建福州350005)

〔摘要〕目的探討大蒜素誘導人子宮內膜癌細胞株( RL－952)細胞凋亡的相關機制。方法人子宮內膜癌細胞株RL－952經大蒜素或Janus激酶/信號傳導及轉錄液活因子( JAK/STAT3)通路抑制劑AG490共培養后，MTT比色法檢測藥物對TL－952腫瘤細胞的抑制率;采用Real－time PCR和酶聯免疫吸附( ELISA)法檢測各組細胞中JAK/STAT3信號轉導通路相關蛋白或mRNA及細胞凋亡蛋白的表達情況。結果大蒜素能夠劑量和時間依從性地抑制人子宮內膜癌細胞株RL－952的增殖;且大蒜素和AG490孵育人子宮內膜癌RL－952細胞株后細胞內JAK/STAT3轉導通路相關蛋白JAK和STAT3的表達明顯減弱，同時促細胞凋亡蛋白Bax、P53的表達明顯增高、抑制凋亡蛋白Bcl2表達明顯降低，且與對照組細胞差異顯著( P＜0．01)。結論大蒜素能夠有效抑制腫瘤細胞增殖的作用，且其可能的機制是通過抑制JAK/STAT3信號轉導通路實現。

〔關鍵詞〕大蒜素;子宮內膜癌;抑制率; JAK/STAT3信號轉導通路;劑量依從性

子宮內膜癌是臨床上最常見的婦科惡性腫瘤之一，且患者具有較差的預后〔1〕。近年來，子宮內膜癌的多發病率和死亡率有逐年升高的趨勢，且常見于圍絕經期和絕經后的女性〔2〕。子宮內膜癌的發病機制尚不明確，可能與激素的使用、糖尿病、肥胖等因素有關。子宮內膜癌在臨床的極早期無明顯的癥狀，之后可能會出現不規則的陰道出血、陰道分泌物增加、不明原因的陣發性下腹痛以及腹部包塊等。Janus激酶/信號傳導及轉錄激活因子( JAK/STAT3)信號轉導通路是細胞內的一條多細胞因子共同參與的途徑，其與MAPK信號轉導通路共同介導了細胞外刺激引起的多種腫瘤細胞的增殖、分化、轉移及凋亡的病理學過程。JAK/STAT3信號通路與多種惡性腫瘤的發生有密切相關性〔3〕。大蒜素主要存在于大蒜的鱗莖中，為三硫代烯醚類化合物，對多種致病菌均有抑制作用。同時，以往的研究也表明大蒜素具有防止肝纖維化、降低膽固醇和抗腫瘤的作用〔4〕。本研究主要對大蒜素誘導人子宮內膜癌細胞株( RL－952)細胞凋亡過程的相關信號轉導通路進行研究，為臨床上相關治療提供參考。

1材料與方法

1. 1材料與試劑人子宮內膜癌RL－952購自美國典型物種保藏中心;細胞培養板為美國Costar產品;胎牛血清購自杭州四季青公司;青霉素和鏈霉素購自Sigma Aldrich公司; DMEM培養基購自Hyclone公司; mRNA提取及逆轉錄試劑盒購自北京天根生物技術有限公司;總蛋白提取試劑盒購自南京建成生物工程研究所;酶聯免疫吸附( ELISA)檢測相關試劑盒均購自美國OMEGA公司。

1. 2 RL－952細胞培養與研究分組RL－952細胞株在含有10%胎牛血清的DMEM培養基中37℃，5%二氧化碳、飽和濕度培養條件下進行貼壁培養。將生長狀態良好的腫瘤細胞隨機分為對照組、大蒜素低劑量處理組( 12 μg/ml)、大蒜素中劑量處理組( 24 μg/ml)、大蒜素高劑量處理組( 48 μg/ml)和AG490處理組( 10 mmol/L)。

1. 3四甲基偶氮唑鹽( MTT)試驗將RL－952腫瘤細胞接種至96孔細胞培養板中在1. 2的培養條件下進行培養。待細胞生長良好后在各組細胞加入相應藥物(大蒜素或AG490)培養24、48、72 h。然后棄去培養液并加入20 μl MTT溫孵4 h，在每個培養孔中加入二甲基亞砜( DMSO)振蕩溶解，用酶標儀檢測各個細胞培養空的吸光度，并計算細胞增殖的抑制率。抑制率=(對照組吸光度－試驗組吸光度) /對照組吸光度×100%。

1. 4 ELISA法檢測相關蛋白表達各組腫瘤細胞培養后的蛋白提取均嚴格按照說明書進行操作。采用考馬斯亮藍法進行總蛋白的定量。ELISA法檢測相關蛋白的表達均嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1. 5 Real－time PCR檢測相關蛋白mRNA表達mRNA的提取及逆轉錄過程均按照說明書進行操作。熒光定量PCR的擴增體系為: 2×qPCR mix 5 μl，上游和下游引物分別為1 μl，cDNA 2 μl，去離子水1 μl。擴增條件為: 95℃10 s，60℃40 s，共擴增28個循環。采用△Ct計算各組mRNA的表達。

1. 6統計學方法采用SPSS20．0軟件進行方差分析、χ2檢驗。

2結果

表1 MTT法檢測大蒜素和JAK/STAT3抑制劑AG490對人子宮內膜癌細胞株RL-952細胞的抑制作用( %)

2. 1 MTT法檢測大蒜素對人子宮內膜癌細胞株RL－952細胞的抑制作用表1可見，MTT法檢測證實大蒜素和JAK/STAT3通路抑制劑AG490均能夠對人子宮內膜癌細胞株RL－952發揮增殖的抑制作用，且大蒜素具有抑制作用的時間依從性和劑量依從性。

2. 2大蒜素調節腫瘤細胞JAK蛋白和mRNA的表達分析本研究發現大蒜素和AG490能夠有效抑制JAK蛋白和mRNA的表達水平，且與對照組相比差異顯著( P＜0．05，P＜0．01) ;同時，AG490組與低劑量和中劑量大蒜素組之間也具有顯著差異( P＜0．05，P＜0．01)。見表2。

表2 ELISA和Real-time PCR法檢測JAK蛋白和mRNA的表達(±s)

表2 ELISA和Real-time PCR法檢測JAK蛋白和mRNA的表達(±s)

與對照組比較: 1) P＜0．05，2) P＜0．01;與低劑量組比較: 3) P＜0．05，4) P＜0．01;下表同

組別　JAK蛋白/β－actin pJAK蛋白/β－actin JAK mRNA表達(△Ct)對照組　0．76±0．18　 0．53±0．08　 5．30±0．19大蒜素低劑量組　0．75±0．19　 0．55±0．04　 5．22±0．14大蒜素中劑量組　0．55±0．101) 3)　0．43±0．09　 4．54±0．111) 3)大蒜素高劑量組　0．35±0．082) 4)　0．39±0．11　 3．83±0．102) 4)AG490組　0．31±0．072) 4)　0．27±0．09　 3．67±0．082) 4)

2. 3大蒜素調節腫瘤細胞STAT3蛋白和mRNA的表達分析大蒜素能夠有效提高ERK1/2蛋白的表達，且與對照組細胞的表達存在顯著差異( P＜0．05，P＜0．01)。見表3。

2. 4 ELISA法檢測p53、Bax及Bcl2蛋白的表達大蒜素和AG490能夠有效提高上調Bax和p53蛋白水平，抑制Bcl2蛋白表達，且與對照組細胞的表達存在顯著差異( P＜0．05，P＜0．01)。見表4。

表3 ELISA和Real-time PCR法檢測STAT3蛋白和mRNA的表達(±s)

表3 ELISA和Real-time PCR法檢測STAT3蛋白和mRNA的表達(±s)

組別　STAT3蛋白/β－actin pSTAT3蛋白/β－actin STAT3 mRNA表達(△Ct)對照組　0．89±0．15　 0．73±0．11　 7．30±0．21大蒜素低劑量組　0．85±0．19　 0．71±0．09　 7．21±0．15大蒜素中劑量組　0．75±0．131) 3)　0．63±0．10　 6．56±0．141) 3)大蒜素高劑量組　0．63±0．182) 4)　0．59±0．10　 4．83±0．162) 4)AG490組　0．51±0．142) 4)　0．47±0．11　 4．69±0．112) 4)

表4 ELISA法檢測p53、Bax及Bcl2蛋白的表達

2. 5大蒜素及AG490促進細胞凋亡的DAPI染色法分析

DAPI染色后中、高劑量大蒜素組和AG490組腫瘤細胞存在部分皺縮、細胞內可見部分凋亡小體，而小劑量雷帕霉素對細胞的形態基本無明顯影響，見圖1。

圖1大蒜素及AG490促進細胞凋亡的DAPI染色法分析( bar=100 μm)

3討論

大蒜素為黃色或淡黃色油狀液體，具有多種生理學活性。以往的研究表明大蒜素能夠保護大鼠脊髓缺血再灌注損傷〔5〕、減輕甲基芐基亞硝胺誘發的食管癌〔6〕，并能有效調劑大鼠肺組織中水通道蛋白的表達〔7〕。本研究提示大蒜素能夠有效抑制腫瘤細胞增殖的作用，且其可能的機制是通過抑制JAK/STAT3信號轉導通路實現。

JAK/STAT3信號通路是細胞內最主要的信號通路，與多種腫瘤的病理過程密切相關〔8〕。在對JAK/STAT信號通路與肝細胞性肝癌的腫瘤進展和預后的相關性研究中發現JAK/STAT信號通路的過度激活在肝癌的發生和發展過程中發揮著重要的作用，且可以作為肝癌惡性程度及預后的重要參考指標〔9〕。在對肝癌患者血清腫瘤標志物含量檢測及其與腫瘤組織中JAK－STAT通路的關系研究時也發現肝癌患者血清中增殖和黏附分子、去乙酰化酶和甲基轉移酶的水平異常升高，這些分子可以作為肝癌的重要血清標志物，而這些標志物的水平與JAK/ STAT3信號轉導通路的異常激活密切相關〔10〕。本研究表明JAK/STAT信號通路參與了大蒜素誘導的子宮內膜癌細胞凋亡過程。

大蒜素能夠有效促進腫瘤細胞凋亡，且能夠協同抗腫瘤藥物的殺傷腫瘤細胞的作用〔11〕。在分析大蒜素對大鼠自然殺傷( NK)細胞腫瘤殺傷活性的影響研究中發現大蒜素可能通過上調NK細胞分泌干擾素( IFN)－γ的水平，增強其體外腫瘤殺傷能力〔12〕。在大蒜素抑制腫瘤生長機制的實驗研究中也證實大蒜素能夠通過抑制血管內皮細胞生長因子( VEGF)的表達、抑制腫瘤的血管生成來實現腫瘤生長的抑制作用〔13〕。大蒜素聯合順鉑對大鼠膀胱腫瘤生長抑制和誘導凋亡的實驗研究也顯示大蒜素聯合順鉑可共同誘導細胞凋亡發揮協同效應，從而抑制膀胱腫瘤的生長，進而改善大鼠的生存狀態〔14〕。

4參考文獻

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11王廣彬，趙瑞杰，王文魁，等．大蒜素誘導腫瘤細胞凋亡研究進展〔J〕．動物醫學進展，2010; 31( 1) : 73－6．

12徐麗，呂麗虹，俞建東，等．大蒜素對大鼠NK細胞腫瘤殺傷活性的影響〔J〕．中國病理生理雜志，2010; 26( 11) : 2091－6．

13陳逸恒，劉燕，石緯．大蒜素抑制腫瘤生長機制的實驗研究〔J〕．中華腫瘤防治雜志，2010; 17( 15) : 1168－71．

14周生財，唐偉．大蒜素聯合順鉑對大鼠膀胱腫瘤生長抑制和誘導凋亡的實驗研究〔J〕．重慶醫科大學學報，2008; 33( 1) : 45－8．

〔2015－03－27修回〕

(編輯袁左鳴)

基金項目:福建省教育廳科技項目( No．JB08115)

〔中圖分類號〕R737. 33

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202( 2016) 02-0285-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2016. 02. 013

第一作者:張彬( 1973－)，女，碩士，副主任醫師，副教授，主要從事婦科腫瘤、婦科內分泌研究。