胞質Rap1與胞核NF－κBp65在胃癌組織中的表達及相關性

趙　丹　王　進　寧寒冰　楊麗敏　(鄭州大學第一附屬醫院消化內科，河南　鄭州　450052)

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胞質Rap1與胞核NF－κBp65在胃癌組織中的表達及相關性

趙丹王進寧寒冰楊麗敏(鄭州大學第一附屬醫院消化內科，河南鄭州450052)

〔摘要〕目的探討胞漿Rap1和胞核NF－κB p65在胃癌組織中的表達及其與臨床病理特征的關系。方法采用免疫組織化學的方法檢測92例胃癌及癌旁正常組織Rap1和NF－κB p65的表達。結果胃癌組織胞質Rap1平均染色評分為6．53±0．38，明顯高于癌旁正常組織( 1．70±0．10，P＜0．001)。Rap1胞質表達水平與胃癌的分化程度、TNM分期及淋巴結轉移相關( P＜0．05)，與年齡、性別無關;胃癌組織胞核NF－κB p65表達明顯高于癌旁正常組織( 7．12±0．42 vs 1．74±0．05，P＜0．001)。胞質Rap1和胞核NF－κB p65在胃癌組織中的表達呈顯著正相關( Kendall'stau－b= 0．447，P＜0．001)。結論胃癌組織Rap1胞質表達可能與NF－κB介導的信號轉導通路相關，共同參與胃癌的發生發展。

〔關鍵詞〕Rap1; NF－κB p65;胃癌

端粒是位于染色體末端的DNA－蛋白結構，由TTAGGG重復序列和大量的端粒結合蛋白組成。六個端粒結合蛋白TRF1、TRF2、Rap1、POT1、TIN2和TPP1組成Shelterin復合體〔1，2〕。大量的研究證明端粒結合蛋白在腫瘤的發生發展中起重要作用。Rap1是TRF2相互作用因子，在端粒與TRF2組成Shelterin復合體的亞單位，人類細胞胞質中存在一定數量的Rap1蛋白，這部分Rap1不與TRF2結合且不受TRF2表達水平的影響。Rap1主要在端粒發揮作用，Rap1蛋白也具有端粒外功能〔3～5〕，近期研究表明胞質Rap1蛋白與IκB激酶( IKKs)相互作用，磷酸化核轉錄因子( NF)－κB的p65亞基，激活NF－κB。在乳腺癌組織中胞質Rap1表達增加〔6〕，但Rap1在胃癌發生發展中的作用仍不清楚。本研究通過檢測Rap1、NF－κB p65在胃癌組織中的表達及相關性，探討其在胃癌發生發展中的可能作用及臨床意義。

1材料和方法

1. 1材料收集鄭州大學第一附屬醫院2013年4月至2015 年7月92例胃癌及癌旁正常組織石蠟標本。所取標本均通過了鄭州大學第一附屬醫院倫理委員會的批準，全部患者均知情同意，且術前均未接受化、放療及免疫治療。男56例，女36 例;年齡40～83歲，≤60歲41例，＞60歲51例，中位年齡50．3歲。病理分型均為腺癌:高分化30例，中分化34例，低分化28 例; TNM分期:Ⅰ～Ⅱ期39例，Ⅲ～Ⅳ期53例;不伴淋巴結轉移49例，伴淋巴結轉移43例。鼠抗人Rap－1單克隆抗體和鼠抗人NF－κB p65單克隆抗體均購自美國Santa Cruz Biotechnology公司; SP試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1. 2方法所有標本均經40 g/L甲醛固定，常規石蠟包埋后切成厚約4 μm切片，脫蠟水化，高溫高壓修復，應用SP免疫組織化學染色法，具體步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。以已知的陽性胃癌切片作為陽性對照，以磷酸鹽緩沖液( PBS)代替一抗作為陰性對照。

1. 3結果判定陽性細胞染色呈棕黃色或棕褐色。Rap1為胞質與胞核著色，以胞質著色判斷為陽性。NF－κB p65為胞質與胞核著色，以胞核著色判斷為陽性。每張切片隨機選擇5個高倍鏡視野，每個視野計數200個細胞，按陽性細胞占視野細胞總數的百分比評分( R) : 0分，＜1%; 1分，2%～25%; 2分，26%～50%; 3分，51%～75%; 4分，＞75%;按照染色強度評分( I) :不著色，0分;淡棕色，1分;棕色，2分;深棕色，3分;總分為R×I:陰性，0～1分;弱陽性，2～4分;中度陽性，5～8分;強陽性，9～12分。每張切片由兩位高年資病理科醫師雙盲隨機觀察。

1. 4統計學方法應用SPSS21．0軟件行t檢驗、Mann－Whitney U檢驗和Kendall tau rank correlation co－efficient相關性分析。

2結果

2. 1 Rap1在胃癌和癌旁正常組織中的表達Rap1在癌旁正常組織主要為胞核染色，胞質染色較弱(圖1A)，胞質平均染色評分為1．70±0．10;胃癌組織胞質Rap1表達增加(圖1B～圖1D)，平均染色評分為6．53±0．38，明顯高于癌旁正常組織( P＜0．001)。Rap1胞質表達水平與胃癌的分化程度、TNM分期及淋巴結轉移明顯相關( P＜0．05)，與年齡、性別不相關。見表1。

2. 2 NF－κB p65在胃癌和癌旁正常組織中的表達胃癌組織胞核NF－κB p65平均染色評分為7．12±0．42，明顯高于癌旁正常組織( 1．74±0．05，P＜0．001)。

2. 3胞質Rap1表達和胞核NF－κB p65表達的相關性胞質Rap1和胞核NF－κB p65在胃癌組織中的表達呈顯著正相關( Kendall'stau－b=0．447，P＜0．001)。

A: Rap1在癌旁正常組織中的表達; B: Rap1在高分化胃癌組織中的表達; C: Rap1在中分化胃癌組織中的表達; D: Rap1在低分化胃癌組織中的表達; E: NF－κB p65在胃癌中的表達圖1 Rap1在胃癌及癌旁正常組織及NF-κB p65在胃癌組織中的表達( SP×200，嵌入小圖×400)

表1胃癌組織中胞質Rap1表達與臨床病理參數的關系( n)

3討論

胃癌早期多無明顯癥狀或癥狀不典型，絕大多數患者在確診時已處于中晚期，生存率低，預后差〔7〕。因此，對于胃癌的相關基礎及臨床研究，顯得愈發重要。

Rap1作為端粒Shelterin復合體的核心蛋白之一，最初是在釀酒酵母菌中被發現的〔5〕。目前研究表明哺乳動物Rap1至少具有2種端粒外功能:轉錄調控，在胞質激活NF－κB信號通路〔3～5〕。最新研究提示Rap1可能通過端粒外功能參與腫瘤的發生發展: Rap1在乳腺癌細胞質表達增加，通過激活NF－κB信號系統促進轉移性和侵襲性，增加對凋亡誘導劑的耐受性〔6〕; Rap1通過調節DNA損傷反應與TRF2共同參與胃癌多藥耐藥的發生〔8〕。本研究結果提示胞質Rap1表達與胃癌的發生發展相關。

Teo等〔6〕研究發現，胞質Rap1與IKKs形成復合體，通過IKKs介導NF－κB p65亞單位的磷酸化，而非通過磷酸化抑制蛋白IκBs，從而激活NF－κB信號系統。NF－κB信號通路已被證實在多種惡性腫瘤的發生發展中起重要促進作用〔9〕。本研究結果顯示，Rap1胞質表達可能與NF－κB介導的信號轉導通路相關，共同參與胃癌的發生發展。

綜上所述，胃癌組織Rap1胞質表達可能與NF－κB介導的信號轉導通路相關，共同參與胃癌的發生發展，深入研究Rap1的非端粒功能將為胃癌的診斷和治療提供新的思路。

4參考文獻

1 de Lange T．Shelterin: the protein complex that shapes and safe guards human telomeres〔J〕．Genes Dev，2005; 19( 18) : 2100－10．

2 Xin H，Liu D，Songyang Z．The telosome/shelterin complex and its functions〔J〕．Genome Biol，2008; 9( 9) : 232．

3 Martinez P，Thanasoula M，Carlos AR，et al．Mammalian Rap1 controls telomere function and gene expression through binding to telomeric and extratelomeric sites〔J〕．Nat Cell Biol，2010; 12( 8) : 768－80．

4 Sfeir A，Kabir S，van Overbeek M，et al．Loss of Rap1 induces telomere recombination in the absence of NHEJ or a DNA damage signal〔J〕．Science，2010; 327( 5973) : 1657－61．

5 Kabir S，Sfeir A，de Lange T．Taking apart Rap1: an adaptor protein with telomeric and non－telomeric functions〔J〕．Cell Cycle，2010; 9( 20) : 4061－7．

6 Teo H，Ghosh S，Luesch H，et al．Telomere－independent Rap1 is an IKK adaptor and regulates NF－kappaB－dependent gene expression〔J〕．Nat Cell Biol，2010; 12( 8) : 758－67．

7 Crew KD，Neugut AI．Epidemiology of gastric cancer〔J〕．World J Gastroenterol，2006; 12( 3) : 354－62．

8 Li X，Liu W，Wang H，et al．Rap1 is indispensable for TRF2 function in etoposide－induced DNA damage response in gastric cancer cell line〔J〕．Oncogenesis，2015; 4: e144．

9 Prasad S，Ravindran J，Aggarwal BB．NF－κB and cancer: how intimate is this relationship〔J〕．Mol Cell Biochem，2010; 336( 1－2) : 25－37．

〔2015－02－13修回〕

(編輯袁左鳴)

通訊作者:王進( 1958－)，女，教授，主任醫師，碩士生導師，主要從事消化系腫瘤方面的研究。

基金項目:河南省醫學科技攻關項目( No．201303019)

〔中圖分類號〕R73

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202( 2016) 02-0350-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2016. 02. 044

第一作者:趙丹( 1989－)，女，在讀碩士，主要從事消化系腫瘤方面的研究。