miR－503在結直腸癌組織和細胞中的表達及對細胞增殖、凋亡的影響

何學彥　張　超(遵義醫學院第三附屬醫院普外科，貴州　遵義　563002)

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miR－503在結直腸癌組織和細胞中的表達及對細胞增殖、凋亡的影響

何學彥張超1(遵義醫學院第三附屬醫院普外科，貴州遵義563002)

〔摘要〕目的探討microRNA－503( miR－503)在結直腸癌組織和細胞中的表達情況及其對細胞增殖、凋亡和細胞周期的影響。方法采用實時定量PCR( qPCR)檢測54例結直腸癌組織及4種結直腸癌細胞( SW480、Lovo、LS174T和HT－29)中的miR－503水平，分析結直腸癌組織miR－503表達與常見臨床病理參數的關系，采用脂質體轉染miR－503模擬物( mimics)至miR－503水平最低的細胞，采用MTT法、流式細胞儀及Transwell法檢測過表達miR－503對細胞增殖、凋亡、細胞周期和侵襲的影響。結果54例結直腸癌組織的miR－503相對表達量為( 0．257±0．011)，低于癌旁組織( P＜0．05)，且miR－503水平與TNM分期、分化情況、腫瘤大小和術前癌胚抗原均有關( P＜0．05) ;與人正常結腸細胞系CCD－18Co相比，4種不同惡性程度結直腸癌細胞SW480、Lovo、LS174T和HT－29的miR－503相對表達量依次為( 0．342±0．072)、( 0．161±0．054)、( 0．260±0．041)和( 0．415± 0．086)，差異均有統計學意義( P＜0．05) ;與對照組相比，轉染miR－503 mimics后的細胞增殖抑制率和凋亡率均升高，G0/G1期細胞比例升高，S期和G2/M期細胞比例均降低，穿膜細胞數減少( P＜0．05)。結論miR－503在結直腸癌組織和細胞中低表達，且與結直腸癌的臨床病理參數有關，上調miR－503水平可抑制結直腸癌細胞的增殖、侵襲并誘導細胞周期阻滯和凋亡。

〔關鍵詞〕iR－503;結直腸癌;細胞;增殖;凋亡

1第三軍醫大學西南醫院普通外科

第一作者:何學彥( 1966－)，男，副主任醫師，主要從事胃腸疾病研究。

結直腸癌是一種常見的惡性腫瘤，在我國發病率和死亡率均較高，確診患者大多數已為晚期，治療手段局限，預后較差〔1〕。microRNA( miR)是一種保守的內源性非編碼基因，可調節多種生物學過程，目前發現多種miRs在腫瘤組織中異常表達，且與其惡性行為調節有關，探討與惡性腫瘤發生發展有關的miRNA已成為腫瘤防治熱點〔2，3〕。miR－503已證實在非小細胞肺癌中低表達，且與患者預后較差有關〔4〕，同時可抑制前列腺癌細胞的增殖與轉移〔5〕，以上結果提示其可能在惡性腫瘤中發揮著抑癌基因的作用。目前尚無miR－503在結直腸癌中表達的報告，其在結直腸細胞中的功能尚不清楚，故本研究擬首先檢測miR－503在結直腸癌組織及細胞中的表達情況，并通過脂質體轉染法驗證其對細胞增殖、凋亡及侵襲能力的影響。

1材料與方法

1. 1組織樣本收集本院2012年5月至2014年12月的結直腸癌術后標本54例及5 cm處癌旁無瘤黏膜組織，均經病理證實且術前未接受放化療，其中男32例，女22例;年齡32～71歲，中位年齡56．5歲;腫瘤位置:結腸32例，直腸22例; TNM分期:Ⅰ、Ⅱ期31例，Ⅲ、Ⅳ期23例;分化情況:中、低分化27例，高分化27例; 20例有淋巴結轉移。

1. 2試劑及儀器4種不同惡性程度的人結直腸癌細胞株( SW480、Lovo、LS174T和HT－29)及正常結腸細胞系CCD－18Co均購自上海中科院生化細胞所，RNA抽提試劑盒Trizol、脂質體試劑Lipofectamine 2000TM購自美國Invitrogen公司，SYBR Green 2×Mix均購自寶生物(大連)工程有限公司，miR－503模擬物( mimics)由銳博生物(中國)公司設計合成，噻唑藍( MTT)購自美國Amresco公司。流式細胞儀FACS－CALIBUR型為美國BD公司產品，Prism 7000 PCR儀為美國ABI公司產品。

1. 3實時定量PCR( qPCR)采用TRIzol法提取組織和細胞中的總RNA，以符合試驗要求的RNA為模板，利用AMV反轉錄試劑盒進行逆轉錄反應，反應條件為: 1630 min，42℃30 min，85℃5 min;在ABI Prism 7000實時熒光定量PCR儀上進行qPCR擴增，反應條件為: 95℃預變性10 min，( 95℃15 s，60℃1 min)×40個循環。qPCR引物由Premier Primer 5．0 software設計: miR－503上游引物: 5'－CGCGGGATCGGGTCAGA－3'，下游引物: 5'－GGGAACATGTTGATCTCAG－3';內參U6上游引物: 5'－CTCGCTTCGGCAGCACA－3'，下游引物: 5'－AACGCTTCACGAATTTGCGT－3'。2－△△Ct法測定組織和細胞中的miR－503表達情況。每組實驗重復3次。

1. 4細胞轉染待結直腸癌細胞匯合度約70%時，將細胞置于無RNA酶的EP管(含200 μl Opti－MEM培養基)，加入5 μl 50 nmol/L的miR－503 mimics進行細胞轉染，分別于轉染96 h采用qPCR法檢測miR－503水平。

1. 5 MTT法分別于轉染24、48、72、96 h后采用MTT法檢測細胞增殖情況，避光4 h，用加樣槍每孔加入DMSO 200 μl，采用酶標儀檢測490 nm波長下各孔吸光值( A)，其中未轉染的結直腸癌細胞為對照組，采用脂質體法轉染miR－503 mimics的為轉染組，根據公式計算增殖抑制率，增殖抑制率( %) = 1－A轉染組/A對照組×100%。每組實驗重復3次。

1. 6流式細胞儀將細胞轉染48、96 h后按2×105個/ml的密度接種，24 h后收集用冷乙醇固定，加入RNase后按照BD試劑盒說明書步驟完成Annexin V－FITC/PI雙染或PI單染后，15 min后上機測定凋亡率和細胞周期。每組實驗重復3次。

1. 7 Transwell實驗將準備好的12孔板嵌套Transwell小室，選取指數生長期細胞，用DMEM(含1%小牛血清)稀釋制備3．5×104個/ml的細胞懸液;細胞懸液按每孔100 μl加入Transwell小室，每組3孔，Transwell下室加入DMEM( 10%小牛血清) ;36 h后棄去孔內培養液用棉簽拭去上室未穿膜的細胞，結晶紫染色后，上室倒置于顯微鏡下計數穿膜細胞數。每組實驗重復3次。

1. 8統計學分析采用SPSS18．0軟件處理。計量資料以x±s表示，多組比較采用單因素方差分析，兩組比較采用t檢驗。以P＜0．05為差異有統計學意義。

2結果

2. 1 miR－503水平與結直腸癌臨床病理參數的關系結直腸癌組織的miR－503相對表達量為( 0．257±0．011)，低于癌旁組織( P＜0．05)。54例結直腸癌組織中miR－503水平與TNM分期、分化情況、腫瘤大小和術前癌胚抗原( CEA)均有關，其中TNMⅢ、Ⅳ期，中、低分化，腫瘤大小＞5 cm和術前CEA＞5．0 ng/ml者的miR－503水平依次為0．121±0．009、0．112± 0．012、0．149±0．017和0．155±0．023，均低于相應項目( 0．358± 0．032、0．402±0．049、0．392±0．031、0．327±0．030) ( P＜0．05)，miR－503水平與性別(男: 0．249±0．011，女: 0．268±0．014)年齡(≤50歲: 0．261±0．012，＞50歲: 0．253±0．009)、淋巴結轉移(有: 0．251±0．025，無: 0．260±0．016)、腫瘤位置(結腸: 0．262± 0．017、直腸: 0．249±0．026)等其他參數無關( P＞0．05)。

2. 2 miR－503在不同惡性程度結直腸癌細胞中的表達情況

與人正常結腸細胞系CCD－18Co相比，4種不同惡性程度結直腸癌細胞SW480、Lovo、LS174T和HT－29的miR－503相對表達量依次為( 0．342±0．072)、( 0．161±0．054)、( 0．260±0．041)和( 0．415±0．086)，差異均有統計學意義( P＜0．05)，同時后續試驗選擇miR－503表達量最低的Lovo細胞。

2. 3過表達miR－503對Lovo細胞增殖的影響轉染miR－503 mimics 96 h后采用qRT－PCR檢測Lovo細胞中miR－503水平，圖1A顯示較對照組，轉染組的miR－503表達量升高，且升高至對照組的( 6．124±0．024)倍，差異有統計學意義( P＜0．05) ;圖1B顯示轉染組轉染24、48、72和96 h后的增殖能力受抑制，增殖抑制率隨轉染時間延長而升高( P＜0．05)。

2. 4過表達miR－503對Lovo細胞凋亡的影響流式細胞儀檢測結果顯示對照組和轉染組轉染48 h的Lovo細胞總凋亡率分別為( 4．92±0．83) %和( 21．75±2．61) %，而轉染96 h的總凋亡率分別為( 6．24±1．02) %和( 37．02±4．42) %，與對照組相比，轉染組轉染48、96 h的總凋亡率升高，差異有統計學意義( P＜0．05)。

2. 5過表達miR－503對Lovo細胞周期的影響流式細胞儀檢測結果顯示與對照組相比，轉染組轉染96 h后的G0/G1期細胞比例升高，S期和G2/M期細胞比例均降低，差異有統計學意義( P＜0．05)。見表1。

2. 6過表達miR－503對Lovo細胞侵襲的影響Transwell法檢測結果顯示對照組和轉染組轉染24 h的Lovo細胞的穿膜細胞數分別為( 87．1±7．2)和( 55．2±4．8)個，而轉染48 h的穿膜細胞數分別為( 145．7±11．6)和( 87．0±8．4)個，與對照組相比，轉染組轉染24、48 h的穿膜細胞數減少，差異有統計學意義( P＜0．05)。見圖1。

表1過表達miR-503對Lovo細胞周期的影響( %)

圖1過表達miR-503后Lovo細胞的Transwell實驗圖

3討論

轉錄后調控在多種細胞過程發揮重要作用，如發展，神經發生和癌變〔6〕。miRNAs是一種重要轉錄后調節因子，可抑制mRNA轉位并通過與靶基因mRNA 3'－UTR配對來誘導其斷裂〔3，7〕。異常表達的miRNAs及其靶基因調控紊亂是目前惡性腫瘤防治的研究熱點，研究發現miRNAs的異常調控可導致癌癥的發生、進展、轉移及耐藥〔6〕。

miR－503是一個基因內部miRNA，位于Xq26．3，屬于擴展的miR－16家族〔8〕。miRNA芯片分析表明，與相應正常組織相比，miR－503表達水平在不同腫瘤的趨勢存在差異，如在口腔癌，非小細胞肺癌、肝癌和子宮內膜癌中表達降低〔4，8～10〕，而在腎上腺皮質癌，甲狀旁腺癌和視網膜母細胞瘤中表達升高〔11～13〕。生物學功能研究發現miR－503具有腫瘤抑制作用，如可抑制人頭頸部鱗癌細胞增殖及減少肝細胞癌細胞轉移〔8，12〕。本研究發現結直腸癌組織和細胞中的miR－503均為低表達，與在非小細胞肺癌及肝癌等腫瘤中的趨勢一致〔8，11〕，表明miR－503在結直腸癌發生發展中起抑癌基因的作用。進一步分析發現，miR－503表達與TNM分期、分化情況、腫瘤大小和術前CEA均有關，且以上指標惡性程度越高、其miR－503水平越低，同時也提示miR－503水平可能有助于結直腸癌的病情評估。

由于Lovo細胞的miR－503水平最低，故本研究選取了Lovo細胞并通過脂質體轉染miR－503 mimics來上調其水平，以驗證miR－503在結直腸癌中的調控效果。結果表明轉染成功且持續時間長，便于連續觀測細胞學行為變化。本研究結果表明miR－503可抑制結直腸癌細胞的增殖和遷移并誘導凋亡，且隨著轉染時間延長，抑制效應也增強。Guo等〔5〕的研究發現miR－503可抑制前列腺癌細胞的增殖和轉移，Peng等〔6〕發現miR－503對乳腺癌的增殖亦有抑制效果，結合以上研究和本結果得出miR－503對于惡性腫瘤具有較廣的抑制效果，針對miR－503設計的治療策略，不僅會使結直腸癌患者受益，而且對于其他惡性腫瘤的防治也亦有較大價值。本研究發現miR－503可誘導結直腸癌細胞周期阻滯，使絕大多數細胞停留在G0/G1期，這也可能是其抑制細胞增殖和誘導凋亡的一個原因，可能與其靶基因在細胞周期中的調控作用有關。

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〔2015－02－13修回〕

(編輯徐杰)

·呼吸、消化系統疾病·

〔中圖分類號〕R734

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202( 2016) 02-0369-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2016. 02. 053