慢性心衰大鼠心肌間質與交感神經重塑機理及中藥聯合運動干預影響的實驗研究*

馬 金，張 艷，趙守彰

(1.遼寧醫藥職業學院，沈陽 110101;2.遼寧中醫藥大學，沈陽 110032)

慢性心衰大鼠心肌間質與交感神經重塑機理及中藥聯合運動干預影響的實驗研究*

馬 金1，張 艷2，趙守彰1

(1.遼寧醫藥職業學院，沈陽 110101;2.遼寧中醫藥大學，沈陽 110032)

目的:通過建立慢性心衰大鼠模型，利用益氣活血中藥及運動訓練聯合干預，探討慢性心衰心肌間質與交感神經重塑的機理及防治慢性心衰的新途徑。方法:以冠脈結扎法配合力竭式游泳、減食等方法塑造慢性心衰大鼠模型，隨機將造模成功大鼠分為7組，每組10只，分別給予藥物治療和(或)運動訓練，治療6周后處死取材。觀察各組大鼠心肌細胞的形態學變化、心肌中TH、NET含量、心肌組織中GAP-43基因及GAP-43蛋白表達變化。結果:心衰模型組TH、NET、GAP-43表達均明顯升高，與假手術組比較差異有統計學意義;經藥物和(或)運動訓練干預后，與心衰模型組比較，各治療組均明顯下降，中藥聯合運動組效果最明顯。結論:益氣活血中藥聯合運動訓練能減輕心肌間質及交感神經重塑，效果優于單純的藥物組及運動訓練組。

慢性心力衰竭;酪氨酸羥化酶;去甲腎上腺素轉運蛋白;生長相關蛋白-43

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是由多種原因引起的心肌結構和功能的變化，導致心室充盈和射血障礙而引起的一組臨床綜合征［1］。其發病機制較為復雜，而大多數學者普遍認為在HF發生發展過程中，心臟交感神經功能(cardiac sympathetic nerve function，CSNF)包括交感神經活性(sympathetic nerve activity，SNA)和/或再攝取功能(reuptake)變化與心肌間質重塑關系密切，但尚不能完全闡述兩者之間的確切機制［2］。但可以肯定的是，進行性心室擴張、舒縮功能降低、心肌纖維化這一心肌間質重塑過程將最終導致CHF。因此，本課題小組通過建立CHF大鼠模型，選用益氣活血復中藥聯合運動訓練作為治療手段，從CHF模型大鼠心肌 組 織 中 檢 測 酪 氨 酸 羥 化 酶 (Tyrosine Hydroxylase，TH)、去甲腎上腺素轉運蛋白(norepinephrine transporter，NET)及生長相關蛋白(growth associated protein 43，GAP-43)指標變化情況，探討心臟交感神經再攝取功能蛋白膜表達與心肌間質重塑的關系及益氣活血復方聯合運動訓練治療CHF的作用機制，為CHF的治療及康復提供科學依據和診療方案。

1 材料與方法

1.1 材料

益氣活血復方由黃芪、人參、紅花、丹參、益母草、三七粉、葶藶子等組成，按照相對密度為1.05～1.08進行煎煮、濃縮成湯液。賴諾普利片由上海信誼萬象藥業股份提供，每片 10 mg(國藥準字H10960265)。以上所有藥物均購自于遼寧中醫藥大學附屬醫院藥劑科。

1.2 方法

1.2.1 慢性心衰大鼠模型塑造 3個月齡健康雄性SD大鼠(普通級)70只，體質量200～230 g，購于遼寧中醫藥大學動物實驗中心，適應性喂養1周。采用冠脈結扎、配合力竭式游泳、減食等方法塑造CHF大鼠模型。4周后多普勒超聲心動圖檢測，以左室射血分數小于60%作為心衰模型成功的標志，同時大鼠出現體質量減輕、精神萎靡、毛色無光澤列入觀察對象。本次實驗70只大鼠造模全部成功，將上述模型隨機分成為假手術組、模型組、中藥組、運動組、中藥+運動組、西藥組、西藥+運動組7組各10只。除心衰模型組、假手術組給予常規等容積生理鹽水灌胃外，其余各組于造模成功后給予藥物治療，各給藥組大鼠運動訓練與造模成功后1周進行，每次50 min，6周超聲心動圖檢測后麻醉處死，摘取心臟組織－80℃保存待測。

1.2.2 病理學檢測各組大鼠左室心肌細胞形態 將制備好的標本在10%福爾馬林中固定，梯度酒精脫水，中性樹膠封固，加蓋玻片封固后，在顯微鏡下觀察各組模型大鼠左室心肌細胞形態學改變情況。

1.2.3 免疫組織化學檢測各組大鼠心肌組織中TH、NET含量 將制備好的標本常規固定、脫水、石蠟包埋，處理后放于60℃烤箱中烘烤30 min后，經梯度酒精脫水并蒸餾水洗，然后放入95℃微波爐加熱10 min進行微波抗原熱修復，冷卻至室溫加入1∶100稀釋的一抗，4℃過夜，加入二抗，DAB顯色。采用IPP6.0全自動圖像分析系統處理結果，測量并計算染色圖片免疫陽性點的累積光密度(IOD)和區域面積，隨機選取10個視野計算出平均光密度值。

1.2.4 實時定量PCR各組大鼠心肌組織中GAP-43 mRNA表達 參照Trizol說明書采取一步法提取總RNA，紫外光分光光度計測定并計算總RNA濃度和純度，RNA變性電泳并檢驗其變形程度，逆轉錄合成 cDNA，QPCR使用 Stratagene Mx3000p熒光定量PCR儀(Agilent Technologies提供)進行檢測。使用 BrilliantⅢ Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix試劑盒，先以5倍梯度稀釋的正常組cDNA為模板，分別以各引物完成定量PCR反應，測得各引物的擴增效率。再以各組樣品cDNA為模板進行定量PCR檢測，反應結束后由溶解曲線判斷PCR反應的特異性。所得各樣品Ct值結果利用公式得出各樣品mRNA的相對表達量。

1.2.5 Western-blot法檢測各組大鼠心肌組織中GAP-43蛋白表達 蛋白裂解液提取大鼠心肌組織中GAP-43的總蛋白，96孔酶標板法對蛋白定量，繪制標準曲線，并計算待測樣品濃度及上樣量。根據分離蛋白質的分子量室溫下配制凝膠，待聚合后，電壓150 V下行10%SDS-PAGE凝膠電泳分離;采用半干式轉膜法進行蛋白轉移;1∶1000稀釋一抗，1∶2000稀釋二抗;ECL法在暗室中進行X光膠片曝光，凝膠成像分析、記錄蛋白電泳帶灰度值并進行定量分析。

1.2.6 統計學方法 采用SPSS 12.0軟件進行統計分析，數據以均數±標準差(±s)表示，各組間比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義，P＞0.05為差異無統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠左室心肌細胞的形態學改變

圖1顯示，經HE染色后在40倍光鏡下觀察各組大鼠心肌細胞的形態學變化，結果發現假手術組大鼠心肌細胞排列規整，橫紋清晰，大小、形態正常，肌纖維未見空白、斷裂及缺損區;心衰模型組則見心肌細胞相互交織、核固縮，出現部分空白區，異染色質呈現團塊狀，相鄰細胞閏盤間隙明顯增寬，粒粒連接及緊密連接消失，肌原纖維排列紊亂、斷裂及缺失;經中藥、運動及西藥干預各組大鼠心肌組織結構均呈心肌細胞排列比較有序，形態結構基本一致，肌纖維排列較規整，有部分斷裂及缺損，偶有空白區等情況，中藥聯合運動組大鼠心肌細胞組織形態基本正常。

圖1 HE染色各組慢性心衰大鼠心肌組織形態特征

2.2 各組大鼠心肌組織中TH、NET、GAP-43 mRNA、GAP-43蛋白表達

圖2、3顯示，染色均以心肌組織中點狀、線狀棕色染色為免疫陽性。與假手術組比較，模型組TH、NET、GAP-43 mRNA、GAP-43蛋白表達量增加，TH、NET平均光密度值均明顯上調，差異有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01)。表1圖4顯示，經藥物和(或)運動訓練干預后，各治療組TH、NET、GAP-43 mRNA、GAP-43蛋白明顯下降，與心衰模型組比較差異有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01)，但中藥聯合運動組效果最明顯，西藥聯合運動組次之，運動組則最差，中藥組與西藥組效果基本相同。

表1 各組大鼠心肌組織中TH、NET、GAP-43 mRNA、GAP-43蛋白表達水平(±s)

表1 各組大鼠心肌組織中TH、NET、GAP-43 mRNA、GAP-43蛋白表達水平(±s)

注:與假手術組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型組比較:#P＜0.05，##P＜0.01;與運動組比較:●P＜0.05，●●P＜0.01;與中藥組比較:▲P＜0.05

組別 例數 TH(平均光密度) NET(平均光密度) GAP-43(ΔΔCT值) GAP-43(GAP-43/GAPDH)假 手 術 組 5 0.154±0.033# 0.289±0.011# 1.02±0.06## 0.313±0.052##模 型 組 5 0.331±0.019* 0.414±0.025* 2.31±0.27* 0.714±0.069中 藥 組 5 0.247±0.011*# 0.209±0.019*#● 1.78±0.17＊＊## 0.544±0.054*##●西 藥 組 5 0.226±0.012*#● 0.219±0.010*#● 1.65±0.29＊＊## 0.544±0.066*##●運 動 組 5 0.254±0.015*# 0.248±0.018*# 1.90±0.27*# 0.638±0.063*#中藥 +運動組 5 0.200±0.015*#●●▲ 0.179±0.010*#●●▲ 1.40±0.21＊＊##●●▲ 0.466±0.043*##●●▲西藥 +運動組 5 0.224±0.014*#● 0.250±0.010*#▲ 1.46±0.34＊＊##●●▲ 0.449±0.049*##●●▲

圖2 各組模型大鼠心肌組織TH免疫組化檢測結果

圖3 各組模型大鼠心肌組織NET免疫組化檢測結果

3 討論

圖4 各組大鼠心肌組織中GAP-43蛋白表達

慢性心衰(CHF)因其治療棘手、致殘及死亡率高，一直是困擾臨床醫生的重大問題。作為臨床多種心血管疾病的終末期表現，對于CHF病理機制的研究及有效治療方法，一直是國內外醫學界長期探討的熱點問題之一［3］。研究發現，心衰發生時引起機體內源性神經內分泌系統激活，直接作用于心肌細胞，導致血流動力學異常改變。而作為交感神經“司令部”的心臟，亦通過去甲腎上腺素的釋放及再攝取，發揮正性變傳導、變力、變時作用［4］。壓力荷狀態下機體NET異常變化，一方面通過減少NE存儲量，誘發心臟交感神經活性失調，心臟代償反應功能降低;另一方面通過增加TH表達，引發I、III型膠原釋放增高，心肌纖維化排列紊亂。而最終出現心臟反應鈍化現象的原因，正是由于NET異常變化導致的NE水平持續增高，心肌收縮力不斷增加，NET密度、功能或受體敏感等方面的異常，都將出現心肌增厚、細胞壞死或凋亡等形態學改變，激發HF進展、心功能持續惡化，并在一定程度上影響預后［5-6］。

心臟交感神經信號傳遞系統中重要的突觸前調控環節的NET，在臨床治療CHF提供了一種新的診療模式——“阻滯神經體液因子和細胞因子激活”模式。與此同時，動物試驗表明減少NET表達可改善HF動物模型的心功能［7］，亦佐證了交感神經再攝取功能對慢性心力衰竭的影響。本次研究結果表明，心衰狀態下心臟交感神經重攝取功能下降，這將為心衰證的臨床治療提供又一重要證據。

而胞膜磷酸蛋白質-43(GAP-43)既調控生長錐的形成、附著、延伸和抵抗回縮，又決定神經發育、軸突再生、突觸重建等生物活動的發生，因此將其作為研究神經生長發育和損傷修復等神經可塑性的首選分子探針［8］。研究表明，在缺氧缺血狀態下，心肌內GAP-43異常表達對于增加心肌交感神經的分布、心肌細胞及組織的重塑具有決定性作用［9］。本次實驗結果也表明，心衰狀態下大鼠心肌組織中新生神經標志蛋白-GAP43無論是mRNA還是蛋白表達均同時增加，伴隨檢測的TH水平增高，驗證了心臟交感神經密度增加的猜想。

CHF過程復雜，涉及面廣，患者不僅存在心功能和形態的明顯改變，活動能力和社會參與能力均顯著下降，極大地影響了患者的生存質量。目前研究表明，運動訓練已成為提高慢性心衰患者生存率及生存質量的重要形式［10］，以藥物配合適當的有氧運動已成為CHF防治領域的趨勢，即CHF的康復治療。中藥化學成分的多樣性和生物活性的廣泛性，為多環節、多靶點防治CHF提供了理論上的可行性，具有穩定性好、不良反應輕等特點。動物實驗也發現，運動訓練可以部分逆轉神經激素系統的激活，運動訓練后血清中 AngII水平下降，降低CHF狀態下交感神經活動能力［11］。本課題組前期實驗證明，益氣活血中藥聯合運動訓練能通過抑制MMP-1的表達，調節心肌組織中III型膠原蛋白的含量，增強心肌組織彈性，減輕心肌重構［12］。為進一步探討慢性心衰心肌間質與交感神經重塑的機理，為中藥聯合運動訓練防治心衰提供科學的依據。我們開展的本次實驗研究證明，中藥聯合運動訓練可能通過減少NET的表達，從而“阻滯神經體液因子和細胞因子激活”，抑制心臟交感神經的活性，降低心臟交感神經的密度，從而減輕心肌間質重構。

大量的實驗表明，運動訓練可以增加心輸出量和局部血流［13］，運動訓練可以增加患者骨骼肌血流［14-18］，而中醫認為“氣旺則血行”，“血行瘀消水散”。本實驗正是采用“溫陽益氣、活血利水”之法，人參、黃芪益氣溫陽為君藥，丹參、三七活血通脈為臣藥，君臣合用共奏益氣活血、氣旺則血行之效;紅花與益母草活血散瘀為佐藥，葶藶子有瀉肺逐水、強心之功，與黃芪配伍增強利水之功，全方益氣以助氣行、氣行則血行各盡其責。由此是否可推測中藥配合運動訓練標本兼治、氣旺則血行效果顯著，其機理有待進一步的研究。

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Mechanism and Experimental Study of Chinese Joint Exercise Intervention Affected Myocardium of Rats with Chronic Heart Failure Quality and Sympathetic Remodeling

MA Jin1，ZHANG Yan2，ZHAO Shou-zhang1

(1.Liaoning Vocational College of Medicine，Shenyang 110101，China; 2.Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032，China)

Objectives:Through the establishment of rat model of chronic heart failure，the use of yiqi Huoxue traditional Chinese medicine and sports training joint intervention to explore the mechanism of chronic heart failure，myocardial interstitial between sympathetic remodeling and new ways of prevention and treatment of chronic heart failure.Methods:In coronary artery ligation with formula swimming exhaustive，less food and other methods to shape the rat model of chronic heart failure，the successful model rats were randomly divided into seven groups of 10.After drug treatment were given and(or)exercise training for 6 weeks were sacrificed.observing the morphological changes in rat cardiomyocytes，myocardial TH，NET content of myocardial tissue GAP-43 GAP-43 gene and protein expression.Results A model group has TH，NET，GAP-43 expression was significantly increased compared with the sham group was statistically significant;after drugs and(or)exercise training intervention，heart failure model group than each treatment group were significantly decreased，TCM joint campaign group has the most obvious effect.Conclusion:Yiqihuoxue medicine combined with joint exercise training can reduce myocardial interstitial remodeling and sympathetic.The results are better than the drug group and exercise training group.

Chronic heart failure;Tyrosine hydroxylase;Norepinephrine transporter protein;Growth associated protein-43

R285.5

B

1006-3250(2016)11-1472-04

2016-05-21

遼寧省教育廳科學研究(L2012498)-慢性心衰大鼠心臟自主神經重構及益氣活血復方聯合運動訓練的保護作用研究

馬 金(1976-)，女，遼寧沈陽人，副教授，醫學博士，從事康復醫學的臨床與研究。