六味地黃丸抗焦慮作用的實驗研究*

陳 嶸，李 菊，譚麗萍，殷 華，朱曉松，汝 晶，楊杏芝，朱夢茹，季 恩

(1.云南中醫學院基礎醫學院，昆明 650500;2.云南中醫學院基礎醫學院實驗中心，昆明 650500)

六味地黃丸抗焦慮作用的實驗研究*

陳 嶸1，李 菊2，譚麗萍2，殷 華2，朱曉松1，汝 晶1，楊杏芝2，朱夢茹2，季 恩1

(1.云南中醫學院基礎醫學院，昆明 650500;2.云南中醫學院基礎醫學院實驗中心，昆明 650500)

目的:觀察六味地黃丸的抗焦慮作用。方法:采用改良天敵應激復制小鼠焦慮模型，與地西泮陽性對照組比較，觀察高、中、低3個濃度的六味地黃丸對焦慮小鼠體質量、體溫、飲水量、行為、血清γ-氨基丁酸(γ-amino-butylic，acid，GABA)水平的影響。結果:與空白組比較，模型組體質量減輕、體溫升高，平均飲水量大，OE%、OT%、血清GABA濃度低;與模型組比較，其余各組體質量增加，陽性對照組體溫降低，六味地黃丸高、中劑量組平均飲水量小且與陽性對照組的OE%、OT%、血清GABA濃度均較高;與六味低劑量組比較，高劑量組體溫降低，平均飲水量小，OE%、OT%、血清GABA濃度高。結論:六味地黃丸滋腎陰而抗焦慮，具有量效依賴性，提高GABA水平是可能機制之一。

六味地黃丸;焦慮;γ-氨基丁酸;小鼠;實驗

焦慮癥(anxiety disorders)又稱為焦慮性神經癥，是以廣泛和持續性焦慮或反復發作的驚恐不安為主要特征，常伴有自主神經紊亂及運動性不安的一種神經癥，包括廣泛型焦慮(GAD)和驚恐障礙(PD)［1］。其發病率逐年增高，目前全球范圍達16.6%［2］，且45%的患者在發病2年甚至更長的時間內未得到及時有效的治療［3］。臨床應用六味地黃丸可緩解焦慮情緒［4-5］，故探討其對焦慮小鼠的影響及其作用機制，可為臨床辨證用藥提供依據。

1 材料

1.1 動物

78只SPF級雄性昆明種小鼠由成都達碩生物科技有限公司提供(許可證號SCXK(川)2013-24)，體質量(30.20±1.38)g。

1.2 藥物

六味地黃丸由云南中醫學院第一附屬醫院中藥房提供。藥物組成:熟地黃24 g，山萸肉12 g，干山藥12 g，澤瀉9 g，牡丹皮9 g，茯苓9 g。中藥浸泡30 min后常規水煎3次后過濾，經冷凝回流濃縮成稠浸膏，置4℃冰箱保存，臨用前用蒸餾水配制成相應濃度。地西泮片2.5 mg/片，購自昆明醫科大學第一附屬醫院精神科(上海信宜藥廠有限公司，批號14141001B)。

1.3 主要儀器及試劑

TL-18M高速冷凍離心機(上海耐圣卡蘭實業有限公司)、infiniteM200PRO酶標儀(Tecan公司)、BL-2200H電子天平(日本島津公司)等。按文獻［6］自制高架十字迷宮(the elevated plus-maze，EPM):兩個相對的開放臂(open arm，內徑:長×寬×高): 30 cm×5 cm×15 cm;兩個相對的封閉臂(enclosed arm，內徑:長×寬×高):30 cm×5 cm×0.5 cm;連接4只臂的中央平臺(centre platform，內徑，長 ×寬):5 cm×5 cm。其中2個相對閉臂上部是敞開的，4個臂及中央平臺均為黑色，整體同定于鐵質支架上，使迷宮底板到距實驗室地面50 cm處。試劑盒:小鼠γ-氨基丁酸(γ-amino-butylic，acid，GABA) ELISA試劑盒(批號1052382，上海勁馬實驗設備有限公司)。

2 方法

2.1 動物分組

78只小鼠常規飼養6 d適應環境后，隨機分為空白組、模型組、陽性對照組和六味地黃丸高、中、低劑量組。各組體質量、肛溫實驗前比較差異無統計學意義(P＞0.05)，具有可比性。

2.2 模型復制與給藥

依據中醫學“恐傷腎”理論，參照文獻復制天敵應激焦慮小鼠模型［7］:每天9∶00～11∶00AM，將除空白對照組外的各組小鼠單只放入13 cm×25 cm×25 cm鐵絲籠，再置于50 cm×25 cm×30 cm貓籠內，將貓引入籠內自由活動60 min，但小鼠籠的鐵絲網可阻止貓的攻擊，小鼠可通過視覺、嗅覺及聽覺體驗到貓的存在，每天僅在應激實驗結束后，貓進食1次，以保證第2天實驗中的貓處于饑餓狀態，維持其對小鼠固有的攻擊性;45 min/次/d，持續7 d并錄制貓的叫聲和排泄物。從第7天開始改為貓叫聲聽覺刺激并排泄物嗅覺刺激，45 min/次/d，再持續7 d。

造模的同時，空白組、模型組給予蒸餾水20 ml· kg－1·d－1灌胃，六味地黃丸按高(1.35 g·kg－1· d－1)、中(0.45 g·kg－1·d－1)、低(0.15 g·kg－1·d－1)劑量，陽性對照組給予地西泮0.0003 g·kg－1·d－1配制成同等體積溶液灌胃，每日1次，于每天刺激結束后進行，持續14 d。

2.3 行為學測試與一般情況評定

高架十字迷宮正上方用支架固定數碼攝像機，保證能夠錄制小鼠活動全視野。末次給藥后次日(第15天)8∶00～11∶00AM安靜環境中進行，每只小鼠先開場適應5 min;每次小鼠放入中央格前75%乙醇擦拭，消除前1只的氣味和排泄物;放入時頭朝封閉臂，觀察者距離迷宮中央1 m以外，保持測試客觀性。每只錄制5 min，待全部結束后由2名實驗人員觀察錄像，共同評定進入開放臂次數(open arm entry，OE)、進入開放臂時間(open arm time，OT)、進入封閉臂次數(close armentry，CE)、進入封閉臂時間(close arm time，CT)。計算入開臂次數百分比(OE%)=OE/(OE+CE)，入開臂停時間百分比(OT%)=OT/(OT+CT)，比值大則較少出現焦慮行為。體質量變化=實驗后－實驗前;飲水量以造模期平均量計算;體溫(肛溫)=實驗后 －實驗前。

2.4 標本采集與處理

EPM行為測試后各組小鼠摘眼球取血，于室溫凝固2 h，1200rcf冷凍離心后迅速分離血清，按GABA試劑盒說明操作，上酶標儀450 nm波長測定OD值，繪制標準品線性回歸曲線，根據其直線回歸方程Y=0.1312X+0.2916(R2=0.9909)計算濃度。

2.5 統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

表1顯示，與空白組比較，模型組體質量減輕，體溫升高，平均飲水量大，OE%、OT%、血清GABA濃度低;與模型組比較，其余各組體質量增加，陽性對照組體溫降低，六味地黃丸高、中劑量組平均飲水量小且與陽性對照組OE%、OT%、血清GABA濃度均較高;與六味地黃丸低劑量組比較，高劑量組體溫降低，平均飲水量小，OE%、OT%、血清GABA濃度高，差異有統計學意義(P＜0.05)。

表1 各組小鼠一般情況、焦慮行為與血清GABA濃度的比較(±s)

表1 各組小鼠一般情況、焦慮行為與血清GABA濃度的比較(±s)

注:與空白組比較:*P＜0.05;與模型組比較:#P＜0.05;與六味地黃丸低劑量組比較:ΔP＜0.05

組別濃度例數 體質量變化(g) 體溫變化(℃) 飲水量(ml) OE% OT%一般情況 焦慮行為 GABA例數空 白 組 11 3.86±1.17 0.13±0.22 5.52±0.26 40.99± 3.8214.98±5.50 10 42.66±1.91模 型 組 10 －2.23±1.13* 0.48±0.15* 7.03±0.37*Δ 20.39± 4.83* 7.09±2.15* 9 29.89±2.07*陽性對照組 10 －1.10±1.65* －0.12±0.19# 5.53±0.26# 40.89± 5.39# 11.22±2.33Δ 9 40.03±2.74*#Δ六味高劑量組 10 0.84±1.29* 0.16±0.23# 5.66±0.32#Δ 41.92± 4.24#Δ 12.53±3.17#Δ 10 39.69±3.94#Δ六味中劑量組 11 0.37±1.69* 0.19±0.26# 5.80±0.31#Δ 36.14±11.13# 12.10±2.22# 9 36.89±1.81*#Δ六味低劑量組 10 1.32±1.73* 0.33±0.29 6.00±0.33Δ 21.33± 7.34# 7.66±2.37# 9 31.16±3.18*

4 討論

研究結果顯示，模型組小鼠體質量減輕，體溫升高，平均飲水量明顯增多，進入開放臂次數明顯減少，說明天敵應激成功復制小鼠焦慮模型。焦慮癥與心理應激導致神經-內分泌-免疫網絡紊亂密切相關［8］，而抑制性神經遞質GABA含量降低是其關鍵的病理機制。

心理應激致焦慮屬于中醫情志致病范疇，基本病機體現于腎-肝-心軸［9－10］。但既往研究多集中于心、肝，對腎的重視不足。《素問·陰陽應象大論》提出，腎在志為恐，恐則傷腎，且腎陰腎陽為全身陰陽之根。《類經圖翼·大寶論》言:“五臟之陽非腎陽不能生，五臟之陰非腎陰不能滋”;《素問·生氣通天論》更提出，陰者，藏精而起亟也;陰不勝其陽，則脈流薄疾，并乃狂。故天敵應激傷腎陰是情志導致焦慮的主要病機之一。

作為滋腎陰的經典名方，六味地黃丸中的熟地黃、山萸肉、山藥三陰并補而制陽，阻抑肝陽上亢，故高、中劑量組延長焦慮小鼠進入高架十字迷宮開臂的時間，增加進入次數，利于緊張不安、恐懼、急躁易怒難于自制等精神癥狀的緩解;澤瀉、牡丹皮、茯苓三瀉，瀉濕濁而降相火，防止津液損耗，故高、中劑量組飲水量減少;同時因補瀉兼施而陰平陽秘，調節脾胃功能，使小鼠體質量增加，符合臨床觀察的結論［4、11］。目前認為，六味地黃丸調節神經-內分泌-免疫網絡發揮抗衰老、改善學習、記憶功能的作用［12］，與降低血漿糖皮質激素(GC)水平、誘導海馬神經突觸的可塑性密切相關。據此推測，可能同時具有抗焦慮功能，因焦慮癥下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸功能亢進，血漿糖皮質激素(GC)含量增加［8］。但目前尚未見其抗焦慮的實驗報道，率先基于小鼠血清GABA含量探討其抗焦慮效果，結果表明高劑量組與低劑量組比較差異顯著，存在量效依賴性，初步揭示六味地黃丸不僅抗焦慮，且作用機制可能與提高GABA含量有關。但與HPA軸的關系、中樞作用機制、受體調控途徑等尚不清楚，需進一步研究、闡明。

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Experimental Research on Anti-anxiety Effect of Liuwei Dihuang Pills

CHEN Rong1，LI Ju2，TAN Li-ping2，YIN Hua2，ZHU Xiao-song1，RU Jing1，YANG Xing-zhi2，ZHU Mei-ru2，JI En1

(Yun nan college of Traditional Chinese Medicine，Kunming 650500，China)

Objective:To observe the anti-anxiety effect of Liuwei Dihuang pills.Methods:The anxiety mice model of predator stress was treated with high，medium，and low concentrations of Liuwei Dihuang pills，compared with diazepam positive control group.And to detect the drug effect，the changes of experimental mice in body weight，temperature，amount of drinking water，behaviors，and the serum γ-GABA level were recorded.Results:The model group was compared with the control group，body weight decreased，body temperature increased，mean amount of drinking water increcsed，serum γ-GABA level，level of OE%and OT%was smaller;Compared with model group，the other groups were with rise of the body weight，body temperature reduced in positive control group，mean amount of drinking water was significantly less in high and medium dose group.For serum γ-GABA level，level of OE%and OT%，we found that control group，high or medium dose group was significantly higher than model group;Compared with low dose group，the body temperature reduced，mean amount of drinking water reduled，the serum γ-GABA level was higher，level of OE%and OT%was higher in high dose group.Conclusion:Nourishing yin recipe Liuwei Dihuang pills had anti-anxiety effect in a concentration effectdependent manner，and one probable mechanism was to up-regulate GABA expression level.

Liuwei Dihuang pills;Anxiety;γ-GABA;Mouse;Experiment

R749.7+2

B

1006-3250(2016)11-1476-03

2016-03-17禮·天官·疾醫》中的“癢庎”用法同，不可訓釋為瘙癢，乃指癰瘡、瘡疥。

云南省教育廳科研基金項目(2014Y243)-滋腎陰方對焦慮小鼠血清GABA及HPA軸GR表達調控作用的研究

陳 嶸(1975-)，男，云南昆明人，副教授，醫學學士，從事情志疾病的防治規律研究與臨床心理治療。

4.2 馬王堆醫籍“癢”字例

“癢”字于馬王堆漢墓出土醫籍一見。即《雜療方》中:“□癢:羊頭□□□□□□□□□暴(曝)干，令凝，以以(蜜)和之，大如□□□□□指端。”

學者多將此處“癢”字理解為瘙癢，“疑為女子陰癢之病”［19］，或云此方為“促進癢感方”［20］。馬王堆漢墓出土醫籍中“癢”字皆寫作“養”或“ ”，“癢”字僅此處一見，不應是瘙癢之義，而是指瘡瘍。此方乃一種治療瘡瘍的涂抹外用方。