黃芪多糖介導NRG-1/ErbB信號通路對糖尿病心肌細胞凋亡的作用*

常 曉，李惠林，楚淑芳，劉德亮，董彥敏

(1．廣州中醫藥大學深圳臨床醫學院，深圳 518003;2．深圳市中醫院，深圳 518003)

黃芪多糖介導NRG-1/ErbB信號通路對糖尿病心肌細胞凋亡的作用*

常 曉1，李惠林2△，楚淑芳1，劉德亮2，董彥敏2

(1．廣州中醫藥大學深圳臨床醫學院，深圳 518003;2．深圳市中醫院，深圳 518003)

目的:從NRG-1/ErbB信號通路探討黃芪多糖對糖尿病心肌病大鼠心肌細胞凋亡的影響。方法:雄性SD大鼠給予高糖高脂飲食4周后用負荷小劑量的STZ誘導糖尿病大鼠模型，另設正常組。將造模成功的大鼠按隨機數字表法分為模型組、黃芪低劑量組、黃芪高劑量組和二甲雙胍組。黃芪低劑量組和高劑量組分別給予400 mg·kg－1·d－1、800 mg·kg－1·d－1處理，二甲雙胍組給予160 mg·kg－1·d－1處理，給藥結束后分別測定空腹血糖、胰島素、甘油三酯、總膽固醇含量，并進行超聲心動圖檢測、心肌組織HE染色和TUNEL染色分析及Western blot分析ErbB2、AKT、Bax、Bcl-2表達水平。結果:與對照組比較，模型組空腹血糖、總膽固醇、甘油三酯含量明顯升高，血胰島素水平顯著降低，心肌功能受損，心肌細胞排列紊亂，細胞肥大變形，細胞核深染，間質纖維化明顯，心肌組織凋亡增加。ErbB2、AKT、Bcl-2表達顯著降低，Bax表達顯著增加;與模型組比較，黃芪高劑量組和二甲雙胍組空腹血糖、總膽固醇、甘油三酯含量顯著降低，血胰島素水平顯著升高，心肌功能一定程度上得以恢復，肌細胞肥大變形有所改善，間質纖維化得到明顯改善，心肌組織凋亡也顯著降低。ErbB2、AKT、Bcl-2表達顯著增加，Bax表達顯著降低。結論:高劑量組的黃芪多糖可減輕糖尿病心肌病大鼠的血糖、膽固醇及甘油三酯，減少心肌細胞凋亡，改善心功能，其作用機制可能與NRG-1/ ErbB信號通路有關。

黃芪多糖;糖尿病心肌病;NRG-1/ErbB信號通路;心肌細胞凋亡

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是由糖尿病所引起的一種心血管并發癥，是導致糖尿病患者死亡的主要原因之一［1］。糖尿病心肌病早期癥狀不典型，往往以心衰為首診癥狀，因此早期診斷及治療糖尿病心肌病對預后至關重要。目前西藥尚無明確有效的治療措施，因此尋找中藥治療糖尿病心肌病的治療靶點具有重要的臨床意義。

我們的前期臨床研究表明，含有黃芪的中藥能一定程度上改善對糖尿病心肌病患者的臨床癥狀，改善患者左心室舒張及收縮功能［2］，但其具體的作用機制尚不清楚。因此本研究通過誘導大鼠糖尿病心肌病模型，針對NRG-1/ErbB信號通路，探討黃芪多糖改善糖尿病心肌病心肌凋亡的分子機制，從而為糖尿病心肌病的治療及臨床新藥研究和開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級成年SD雄性大鼠60只，體質量180～220 g，由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供(動物許可證號201505074432)。

1.2 主要試劑與儀器

黃芪多糖(天津賽諾制藥有限公司，國藥準字Z20040086)質量分數為98%;二甲雙胍(中美上海施貴寶制藥有限公司，批號1516578);Leica5001石蠟切片機(德國萊卡);Image-Pro PlusM IS2000圖像分析系統(美國Media Cybernetics公司);G6805-Ⅱ型電針治療儀(上海醫用電子儀器廠);XSP-2C光學顯微鏡(上海光學儀器廠);HC-3018R高速冷凍離心機(安徽科大創新股份有限公司);ABI 9700 PCR儀(美國ABI公司);Thermo Multiskan Mk3酶標儀(美國Thermo公司)。

1.3 分組與干預

取正常SD大鼠60只，按隨機數字表法分為對照組、模型組、黃芪低劑量組、黃芪低劑量組、二甲雙胍組5組各12只。

造模方法:60只SD大鼠除對照組給予普通飼料喂養外，其余組高熱量飼料4周后腹腔注射STZ (30 mg/kg)，STZ溶于pH 4.4、0.1 M枸櫞酸緩沖液中，對照組給予相應體積的枸櫞酸緩沖液。1周后將空腹血糖＜7.8 mmol/L的大鼠標記后，第2次注射STZ(30 mg/kg)，除正常組外繼續高熱量飼料喂養4周，禁食12 h，以空腹血糖≥7.8 mmol/L認為糖尿病模型成功。

將造模成功大鼠按隨機數字表法分為黃芪高劑量組、黃芪低劑量組、二甲雙胍組和模型組。黃芪高劑量組給予800 mg·kg－1·d－1黃芪多糖處理，黃芪低劑量組給予400 mg·kg－1·d－1黃芪多糖處理;二甲雙胍組給予160 mg·kg－1·d－1處理，正常對照組、DC模型組灌胃相同體積0.5%CMC-Na溶液。給藥8周，給藥期間正常對照組喂飼普通飼料，其余各組給予高熱量飼料，自由飲水，直至實驗結束。

將式(4)傅立葉展開,可得一次諧波和二次諧波的系數分別為:If=Ioη;I2f=-kαoCLIo,可見一次諧波中含有光強信息,二次諧波中則含有氣體濃度信息。令二次諧波和一次諧波的比值則m值既包括了氣體濃度信息,同時消除了半導體激光器初始光強的影響[1-3]。因此本文重點為求取光源通過被測氣體后的二次諧波和一次諧波強度的比值,并將此比值與標準儀器測量的氣體濃度進行標教比對,確定甲烷氣體濃度的計算公式。

1.4 空腹血糖、胰島素、總膽固醇及甘油三酯測定

實驗給藥結束后大鼠禁食12～16 h，斷尾取血，3500×g離心取血清，過氧化物酶法測量血清中葡萄糖水平，同時檢測血清中甘油三酯和總膽固醇含量。按照甘油三酯試劑盒說明書方法測定血清中甘油三酯含量，測定波長為520 nm。按照總膽固醇測定試劑盒說明書測定血清中總膽固醇含量，測定波長500 nm。

1.5 超聲心動圖檢測心功能

大鼠用3%戊巴比妥腹腔注射麻醉，麻醉后胸部和四肢剃毛連接Ⅱ導聯心電圖，應用小動物超聲檢測儀進行心臟心率(HR)、收縮期室間隔厚度(IVSs)、射血分數(EF%)、短軸縮短率(FS%)、左心室舒張末期內徑(LVDD)、左心室收縮末期內徑(LVDS)、舒張期左室后壁厚度(LVPWD)檢測。

1.6 HE染色

動物采血處死后迅速將心臟取出，將心肌切成2～3 mm薄片后，取心肌同一部分置入10%甲醛溶液固定，0.01 mol/L PBS浸泡過夜，常規梯度酒精脫水包埋，制成4 mm石蠟切片。經二甲苯脫蠟、梯度乙醇復水后，蘇木素-伊紅(HE)染色，之后再進行梯度乙醇、二甲苯脫水。最后滴加中性樹脂封片，顯微鏡下觀察、拍照。

1.7 心肌凋亡細胞檢測

TUNEL法檢測各處理組心肌細胞凋亡情況:給藥結束后，各組心肌組織石蠟切片，經二甲苯脫蠟，梯度酒精水化;0.5%蛋白酶K 37℃溫箱消化30 min;將末端脫氧核糖核酸轉移酶(TdT)及地高辛標記的脫氧核糖核酸(DIG-dUTP)混合液覆蓋組織，37℃溫箱孵育2 h;抗地高辛抗體，37℃溫箱孵育30 min;DAB顯色，10%甘油封片，倒置顯微鏡下被TUNEL染色標記的陽性細胞核呈棕黃色。半定量分析，每組隨機抽取5張切片，400倍高倍視野下用標準的10×10目鏡方格測視系統計數6個視野TUNEL陽性細胞核數目，并取與各視野細胞總數的比值，然后取其均值。

1.8 Western blot法檢測心肌組織中p-ErbB2、p-AKT、Bax、BCL-2蛋白水平

給藥結束后，利用組織裂解液裂解心肌組織，然后進行組織蛋白定量;取25 μg蛋白加入上樣緩沖液，沸水浴5 min后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉至PVDF膜;電轉結束后，TBS溶液(含5%脫脂奶粉)4℃封閉過夜;封閉結束后，將PVDF膜轉移至含目的抗體的TBS溶液，室溫2 h;1×TBST洗膜5 min×5次，加入二抗溶液，室溫孵育1 h;1×TBST洗膜5 min×5次，ECL試劑盒曝光并顯影。掃描顯影條帶，采用Phoretix 2D軟件進行灰度值分析，以同一樣品的BDNF、Bax和Bcl-2與GAPDH條帶的灰度值比值作為p-ErbB2、p-AKT、Bax和Bcl-2蛋白的相對含量。

1.9 統計學方法

2 結果

2.1 黃芪多糖對DCM大鼠空腹血糖和血胰島素的影響

給藥結束后，對各處理組的大鼠進行了空腹血糖含量測定。表2顯示，模型組中大鼠空腹血糖含量與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.05)，說明造模成功;黃芪高劑量組和二甲雙胍組處理后，使得空腹血糖的含量降低，與模型組比較差異有統計學意義(P＜0.05);但黃芪低劑量處理組降血糖效果并不明顯，與模型組比較差異無統計學意義。

同時，我們也測定了各個分組中大鼠血胰島素的含量變化。表2顯示，模型組中大鼠的血胰島素含量與對照組比較，出現了顯著降低的趨勢(P＜0.05);而黃芪高劑量組和二甲雙胍組中大鼠的血胰島素和模型組比較差異有統計學意義(P＜0.05)，其含量均接近與對照組水平，但黃芪低劑量組效果不顯著，與模型組比較差異無統計學意義。

2.2 黃芪多糖對DCM大鼠總膽固醇和甘油三酯的影響

為探討黃芪多糖對DCM大鼠血脂的影響，在給藥結束后，我們對各處理組的大鼠測定了其總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)含量。圖1顯示，模型組中大鼠總膽固醇和甘油三酯的含量與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.05);黃芪高劑量組和二甲雙胍組處理后，總膽固醇和甘油三酯的含量降低，與模型組比較差異有統計學意義(P＜0.05);黃芪低劑量處理組與模型組比較，總膽固醇和甘油三酯含量雖有降低但差異無統計學意義。

表2 黃芪多糖處理對大鼠空腹血糖和血胰島素含量的影響

2.3 黃芪多糖對DCM大鼠心功能的影響

表3顯示，為證實黃芪多糖對DCM大鼠心功能具有保護作用，在給藥結束后對各處理組大鼠心功能進行了超聲檢測。結果顯示，模型組16周時LVDD、LVDS增大、LVEF下降，與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.05)，進一步提示糖尿病心肌病模型制備成功。黃芪高劑量組和二甲雙胍組LVDD、LVDS、LVEF等與模型組16周比較，收縮末期內徑及舒張末期內徑均減少，射血分數增加，差異有統計學意義(P＜0.05)。

表3 黃芪多糖對DCM 大鼠心功能的影響

圖1 黃芪多糖處理對大鼠總膽固醇和甘油三酯的影響

2.4 黃芪多糖對DCM大鼠心肌組織的影響

為進一步證實黃芪多糖對DCM大鼠心肌組織具有保護作用，在給藥結束后我們首先進行了HE染色分析。圖2顯示，對照組心肌細胞排列緊密且整齊，細胞核經過染色清晰可見;模型組心肌細胞排列紊亂，細胞肥大且變形，細胞核染色較深，間質明顯纖維化，有炎性細胞浸潤;黃芪高劑量組和二甲雙胍組心肌細胞排列稍亂，細胞形態對照組比較大體相同，核染色比較清晰。

圖2 黃芪多糖對DCM大鼠心肌組織HE的影響

圖3 黃芪多糖對DCM大鼠心肌細胞凋亡的影響

其次，我們采用TUNEL法對各組大鼠的心肌細胞進行了染色分析。圖3顯示，模型組中TUNEL染色陽性細胞數目與對照組比較顯著增加(P＜0.05);黃芪低劑量組與模型組比較差異無統計學意義;相反，黃芪高劑量組和二甲雙胍組與模型組比較，陽性染色細胞數目出現了下降趨勢，差異有統計學意義(P＜0.05)。

2.5 黃芪多糖對DCM大鼠心肌組織ErbB2、AKT、Bax、Bcl-2的影響

圖5顯示，Western blot檢測各組p-ErbB2、p-AKT、Bax、Bcl-2蛋白表達水平，模型組中p-ErbB2、p-AKT和Bcl-2蛋白表達水平呈下降趨勢，而Bax蛋白表達呈上升趨勢，與對照組比較差異有統計學意義;黃芪高劑量組和二甲雙胍組處理后，其 p-ErbB2、p-AKT和Bcl-2表達與模型組比較顯著增加，Bax表達顯著降低，差異有統計學意義;但黃芪低劑量處理組效果與模型組比較效果不明顯，差異無統計學意義。

圖4 Western blot檢測p-ErbB2、p-AKT、Bax、Bcl-2蛋白表達水平

3 討論

糖尿病(diabetes mellitus，DM)已成為世界范圍的嚴重危害人們健康的疾病［3］。糖尿病的根本危害在于其各種慢性并發癥(心、腦、腎和血管)，這些并發癥不僅嚴重危害人類的健康和生命，而且以其昂貴的醫藥費用給患者帶來沉重的經濟負擔［4］。糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)發生在糖尿病的基礎上，是由于代謝紊亂及微血管病變引發的心肌廣泛性壞死和心肌纖維化，早期通常表現為心肌順應性降低、舒張功能不全，晚期以收縮功能不全為主，易發生充血性心力衰竭［5］。目前針對糖尿病心肌病尚未有特異性的治療方法，如何減少心肌細胞凋亡、改善心肌纖維化，是現階段預防和治療糖尿病心肌病的主要靶點和手段［6］。

神經調節蛋白-1(NGR1)是一種跨膜蛋白，具有保護性的生長因子，因其首先在神經科學領域發現而命名［7］。NRG1可以調控上皮細胞、神經膠質細胞、神經元及心肌細胞的生長發育。NRG1-ErbB信號系統在維持心功能中發揮著重要作用。在正常心肌中，只有ErB2、ErB4可與NRG-1結合，與心肌細胞膜上的受體復合物結合后，觸發胞內具有轉錄激活功能的蛋白質信號分子活化，活化后的轉錄因子進入細胞核與特定的靶基因結合，誘導晚期基因表達，從而產生各種生理功能［8］。NRG1-ErbB信號通路與心肌梗死、心力衰竭等疾病密切相關［9］。研究發現，神經調節蛋白通過多個下游通路抑制心肌細胞凋亡，促進細胞增殖和血管再生、改善心肌纖維化等作用［10］。PI3K/Akt信號通路是 NRG-1/ ErbB2/ErbB4的重要下游信號通路，在心肌組織中NRG-1通過結合ErbB4受體，再與ErbB2受體形成異源二聚體，使得受體C-末端上特定的酪氨酸殘基被磷酸化，激活PI3K并產生一系列的細胞反應［11］。AKT的活化可以減少線粒體ROS的生成，從而起到抑制由其所激活的線粒體凋亡通路。Xiao等使用重組人神經調節蛋白1注入到大鼠的梗死心肌中，結果發現hNRG-1的高表達可以激活PI3K/AKT通路，增加Akt的磷酸化作用，使缺血心肌的微血管數量增加，減少細胞凋亡［12］。

Bcl-2與Bax是公認的與線粒體凋亡密切相關的調控蛋白，Bcl-2位于線粒體膜，主要功能是促進細胞生存，抑制細胞凋亡［13］;Bax位于胞質中，當高表達時可從胞質轉位至線粒體膜，與Bcl-2結合形成異二聚體使之滅活，從而改變線粒體膜的通透性，引起線粒體損傷，促進細胞凋亡［14］。有研究證實，ErbB2受體抑制或失活導致凋亡基因bax表達的上調和抗凋亡基因bcl-2的表達下調，引起線粒體完整性破壞、功能受損及能量產生障礙，導致心肌細胞的凋亡［15］。

黃芪具有“益氣健脾，生津止渴”的功效，黃芪多糖(astraglaus polysaccharide，APS)是從黃芪中提取出來的主要藥理成分之一，具有抗應激、抗氧化、抗炎等諸多藥理學作用［16］。研究證實，APS具有降低血糖和保護血管內皮細胞、抑制微血管病變的作用［17］，但其作用機制一直不清楚。本研究發現，高劑量的黃芪多糖處理不僅可以改善糖尿病大鼠的血糖、血脂，而且可以明顯改善大鼠心功能，并通過上調DCM大鼠心肌組織ErbB2、AKT、Bcl-2的表達，降低Bax的表達，減少心肌細胞的凋亡。因此本研究初步證實，黃芪多糖可能通過干預 NRG-1/ErbB/ PI3K/Akt信號通路，從而降低糖尿病心肌細胞凋亡，發揮對糖尿病心肌病大鼠的防治作用。

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Astragalus polysaccharide reduces myocardial tissue apoptosis through NRG-1/ErbB signal pathway in rats

CHANG Xiao1，LI Hui-lin2△，CHU Shu-fang1，LIU De-liang2，DONG Yan-min2
(1．Shenzhen Clinical Medical College，Guangzhou University of Chinese Medicine，Shenzhen Guangdong，518033，China; 2．Shenzhen Hospital of Traditional Chinese Medicine，Guangdong，Shenzhen，518033，China)

Objective:To examine the potential effect of Astragalus polysaccharide(APS)on diabetic cardiomyopathy in rats．Method:Male SD rats fed a high-glucose and hyper-lipid diet for 4 weeks．Then diabetes mellitus model was induced by a single injection of STZ．Diabetes SD rats were randomly divided into model group，low-dose APS group，highdose APS group and metformin group．Low-dose APS group，high-dose APS group and metformin group were treated with 400 mg·kg－1·d－1，800 mg·kg－1·d－1of APS，and 160 mg·kg－1·d－1of metformin respectively．Another 12 rats were assigned to the control group and received nothing treatment．After 12 weeks，the levels of fasting glucose，insulin in serum，triglyceride and total cholesterol were measured．Furthermore，the(HE)staining and TUNEL staining of myocardial tissue was conducted．In addition，the expression level of ErbB2，AKT，Bax and Bcl-2 were performed using western blotting methods．Result:Compared to the control group，the levels of fasting glucose，triglyceride and total cholesterol increased significantly，and insulin in serum decreased dramaticly in model group．In contrast，the levels of fasting glucose，triglyceride and total cholesterol decreased，and the level of insulin in serum increased in high-dose APS group and metformin group．Moreover，myocardial tissue apoptosis increased markedly in model group，and decreased significantly in high-dose APS group and metformin group．In addition，the expression level of ErbB2，AKT，Bcl-2 were up-regulated significantly，and Bax expression was down-regulated significantly in model group．However，high dose of APS and metformin could reverse this situation:increased ErbB2，AKT，Bcl-2 expression and decreased Bax expression．Conclusion:High dose of APS had a beneficial effect on heart function by decreasing the level of glucose and lipid and relieving the heart damage in diabetic cardiomyopathy in rat，the mechanism might related to NRG-1/ErbB signal pathway．

Astragalus polysaccharide;diabetic cardiomyopathy;NRG-1/ErbB signal pathway;Myocardial tissue apoptosis

R285．5

B

1006-3250(2016)09-1192-04

2016-02-12

廣東省中醫藥局資助項目(20152053)

常 曉(1981-)，女，副主任醫師，在讀博士，從事中醫藥的臨床與研究。

△通訊作者:李惠林(1956-)，男，主任醫師，博士研究生導師，E-mail:Sztcmlhl@163．com。