電針對頸椎病大鼠椎間盤軟骨細胞及PI3K/Akt信號通路的影響*

童秀冰，鄭佳璇，廖 軍，黃萍萍，鄭春水

(福建中醫藥大學針灸學院，福州 350122)

電針對頸椎病大鼠椎間盤軟骨細胞及PI3K/Akt信號通路的影響*

童秀冰，鄭佳璇，廖 軍△，黃萍萍，鄭春水

(福建中醫藥大學針灸學院，福州 350122)

目的:探討電針在頸椎病大鼠模型椎間盤軟骨細胞的凋亡，以及磷脂酰肌醇3-激酶/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(PI3K/ Akt)信號傳導通路中的兩個蛋白PI3K、Akt的影響。方法:將40只SD大鼠按隨機數字表法分成電針組、莫比可組、假手術組、模型組4組各8只，雌雄各半。電針組給予“頸夾脊”、“手三里”穴治療25 min/d/次，14 d為1個療程共2個療程，中間休息2 d;莫比可組用莫比可進行灌胃處理;模型組、假手術組無任何治療只做固定，其治療療程同電針組。療程結束，取大鼠頸部椎間盤組織測生化相關指標。結果:電針治療后可見頸椎病大鼠模型軟骨細胞中PI3K、P-Akt、Bcl-2的蛋白含量表達上升且幅度大，Bax的表達則出現抑制。結論:電針能延緩頸椎病大鼠椎間盤軟骨細胞的凋亡過程，其機制與PI3K/Akt信號傳導通路與Bcl-2、Bax的含量可能有關。

電針;頸椎病;軟骨細胞凋亡;PI3K;AKT

頸椎病是臨床常見疾病，頸椎病發生病理改變，究其根本的原因是椎間盤的退變［1］。諸多研究［2-3］認為，椎間盤退變始發于軟骨細胞的凋亡，也因此使得細胞分泌胞外基質的功能退化，從而加速了椎間盤退行性變的發生，通過對軟骨細胞的凋亡進行干預，在治療椎間盤退行性相關疾病方面有一定的意義［4］。在頸椎病的治療中，電針是很有優勢的方法之一，本實驗復制頸椎病大鼠的模型，觀察電針在軟骨細胞凋亡和PI3K/Akt的表達中起調控作用，進而探究在椎間盤退變過程中相關因子可能起到的作用。

1 材料

1.1 動物

SPF級SD大鼠40只，雌雄各半，體質量(100 g ±20 g)(上海斯克萊)，大鼠適應性喂養7 d。

1.2 主要藥物、試劑及儀器

莫比可片(揚子江藥業);苯甲基磺酰氟(PMSF)、丙烯酰胺、亞甲雙丙烯酰胺、Tris-HCL、Loading buffer、甘氨酸、Tris、TBST、二抗(碧云天); Bradford試劑盒(南京凱基);SDS、過硫酸胺、TEMED、二硫蘇糖醇(美國BIO-RAD);蛋白marker (Fermentas);一抗(PI3K、P-Akt、Akt，Cell Signaling Technology);二抗(Bax、Bcl-2，北京博奧森);電針儀(華佗牌);酶聯免疫檢測儀(上海中庸);移液器(德國EPPENDORF);AB204-N電子天平(梅特勒公司);脫水機(亞光醫用公司);BIO RAD凝膠成像分析儀(美國BIO-RAD公司);MDF-D5410低溫冰箱(日本三洋);LDZ5-2離心機(北京離心機廠)。

2 方法

2.1 分組及造模

采用隨機數字表法在40只大鼠中選出10只作為假手術組，其余為造模組，每組中雌雄各半。根據王擁軍［5］等文獻資料造模，10%的水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉。備皮并在大鼠頸背的正中間做一縱向手術切口，長度控制在2 cm，鈍性分離各層組織，橫向破壞右側肌肉和韌帶最后縫合。假手術組僅將皮膚切開、縫合，不需其他處理。術后正常飼養3個月，每組取出1只大鼠，HE染色及Toluidine blue染色用以確定造模是否成功［6］。課題前期研究提示，在TUNEL染色中模型大鼠椎間盤的細胞程序性死亡顯著高于假手術組［7］。模型復制成功，雌雄各半隨機分為電針組、莫比可組、假手術組、模型組，每組8只。

2.2 動物干預

2.2.1 電針組 模型大鼠成功后選頸夾脊、手三里穴位(兩側)，治療時每次取同側，穴位參照《實驗針灸學》［8］，雙側交替進行電針治療。具體如下:固定大鼠后針刺上述兩穴(用Φ0.3×15 mm華佗牌針灸針，深度4 mm左右)并連接電針儀，疏密波(2/ 100 Hz)，強度以局部輕微抖動為佳，25 min/d，1個月療程14 d，共2個療程，療程間休息2 d。

2.2.2 莫比可組 造模成功后用莫比可灌胃治療，每日1次，按照0.75 mg/kg的標準［9］做到時間相對固定，于上午8～10點進行，每周1次大鼠體質量監測以調整藥物劑量，療程同電針組。

2.2.3 假手術組、模型組 無其他治療，只作固定處理，治療療程同電針組。

2.3 動物取材

干預療程結束后即采集標本。以5 ml/kg的計量參照標準，用10%的水合氯醛對大鼠行麻醉處死，開始鈍性分離頸項部各層組織，并取下所需的頸椎間盤節段，用PBS沖洗并逐一標記，迅速放入已經備好的液氮罐里，再轉入－80℃的冰箱儲存。

2.4 免疫組化法檢測Bax和Bcl-2表達

石蠟切片并脫蠟，將枸櫞酸緩沖液用微波爐加熱沸騰，玻片放入其中燜5 min再加熱1 min，再燜5 min取出后冷卻至常溫;PBS浸泡3 min，反復3次，加3%H2O2反應10 min;同上滴加封閉液;載玻片上加一抗(Bax和Bcl-2濃度均為1∶100)于4℃冰箱過夜;次日將玻片置于常溫回溫1 h后用PBS浸泡5 min，反復3次，加入二抗進行反應10 min;然后用PBS反復浸泡3次，每次5 min，加入過氧化物酶并在室溫反應10 min后取出;最后是用DAB進行顯色，蘇木精染色，常規條件下脫水進行透明并封片，鏡下觀察結果。

2.5 Western Blot檢測

將頸椎間盤組織按照實驗試劑說明書，經蛋白提取、裂解和離心后得組織總蛋白產物，蛋白濃度測定(Bradford法);配膠后進行電泳然后轉膜，在5%脫脂牛奶里加入 PVDF膜在室溫下搖床反應30 min;加一抗，兔抗大鼠PI3K(濃度1∶2000)、兔抗大鼠Akt(濃度1∶2000)、兔抗大鼠 P-Akt(濃度1∶1500)，并放置4℃冰箱搖床過夜，次日用1×TBST緩沖液沖洗10 min，反復3次;加二抗，山羊抗兔(濃度1∶2000)進行搖床反應至2 h，沖洗同上;膜上加入AB混合液顯色，最后用圖像分析軟件分析相應蛋白表達情況。

2.6 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統計分析，全部資料以均數±標準差(±s)表示，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 Bax、Bcl-2的組間表達分析

圖1、2表1顯示，大鼠頸椎間盤軟骨細胞內有Bax、Bcl-2的表達，呈棕黃色陽性反應。從每組陽性細胞數量及陽性蛋白表達來看，模型組與假手術組比較，Bax陽性蛋白表達升高(P＜0.05);電針組、莫比可組與模型組比較，Bax陽性蛋白表達顯著下降(P＜0.05);Bcl-2陽性蛋白表達在假手術組最高，電針組、莫比可組次之，3組與模型組比較差異有統計學意義。

圖1 Bax蛋白含量的表達比較分析圖(免疫組化×400)

表1 各組大鼠軟骨細胞Bax和Bcl-2比較(±s)

表1 各組大鼠軟骨細胞Bax和Bcl-2比較(±s)

注:與模型組比較:*P＜0.05

組 別 鼠數Bax Bcl-2假 手 術 組 8 6.63±2.13* 21.88±10.41*模 型 組 8 17.25±7.87 11.50± 4.66電 針 組 8 10.75±3.41* 20.75± 8.43*莫 比 可 組 8 11.09±5.95* 20.38± 7.65*

3.2 PI3K、P-Akt(Ser473)、Akt蛋白表達分析

圖3表2顯示，電針組、莫比可組及假手術組較模型組PI3K蛋白表達量均上升，差異有統計學意義。

圖2 Bcl-2蛋白含量表達比較分析圖(免疫組化×400)

P-Akt表達顯示，電針組、莫比可組及假手術組較模型組P-Akt的蛋白表達量均上升，差異有統計學意義。Akt表達顯示，每個組別之間Akt蛋白含量的表達無明顯差異。

圖3 PI3K、P-Akt、Akt蛋白含量表達比較

表2 PI3K、P-Akt、Akt蛋白含量表達比較(±s)

表2 PI3K、P-Akt、Akt蛋白含量表達比較(±s)

注:與模型組比較:*P＜0.05，#P＞0.05

組 別 鼠數 PI3K P-Akt(Ser473)Akt假手 術 組 8 0.94±0.12* 1.06±0.25* 0.94±0.12#模 型 組 8 0.51±0.19 0.63±0.16 0.97±0.16電 針 組 8 0.82±0.13* 0.89±0.14* 0.94±0.17#莫比 可 組 8 0.81±0.15* 0.89±0.25* 0.97±0.18#

4 討論

PI3K/Akt通路被命名為“抗凋亡途徑”，多數專家學者肯定其作為軟骨細胞存活的重要通路作用。PI3K屬于胞內磷脂酰肌醇激酶，具有蛋白、脂類激酶的活性，當酪氨酸激酶受體或G2蛋白耦聯受體將其激活后，可產生胞內信使(PIP2及PIP3)，由此對細胞增生、凋亡及代謝等發揮重大作用［10］。PIP3與Akt相結合即磷酸化啟動，且Akt中Ser473位點之磷酸化是作為Akt最終活化的標志。PI3K/Akt通路被激活后，使得Akt迅速活化，并進一步磷酸化豐富的下游靶點，如核因子κB(NF-κB)、Bax、cAMP反應元件結合蛋白(CREB)、Survivin以及Forkhead轉錄因子家族成員FKHRL1，這些因子讓Bcl-2轉錄的能力增強，產生抗細胞程序性死亡的作用。Ulicietal［11］發現，添加PI3K抑制劑組的脛骨生長較另一組速度顯著緩慢，軟骨細胞程序性死亡的數量明顯增多，提示此途徑如果在正常情況下的表達能夠有效對抗軟骨細胞凋亡。本次實驗中，模型組軟骨細胞的PI3K、P-Akt相對假手術組的蛋白含量表達呈現下降趨勢，電針后軟骨細胞中的PI3K、P-Akt蛋白含量表達上升，Akt蛋白含量的表達在組間未見明顯差異。若Akt未經磷酸化，PI3K/Akt無法激活，則Akt無法通過調控其下游因子，進而影響細胞存活。由此暗示電針后Akt磷酸化、PI3K/Akt激活在調控軟骨細胞程序性死亡過程中有相當重要的地位。

Bax和Bcl-2是PI3K/Akt信號途徑上的2個關鍵因子，它們作用于細胞的凋亡，并發揮各自的調節功能。其中Bax促進細胞凋亡，而Bcl-2通過拮抗Bax使半胱氨酸蛋白酶的激活被阻斷，從而抑制凋亡的進行［12］。馬春輝等［13］認為，軟骨細胞的程序性死亡是骨關節炎性疾病的誘因之一，并觀察到Bax蛋白表達在炎性關節軟骨中的含量明顯升高，認為Bax和Bcl-2共同參與該類疾病的調控。在此次實驗中，模型組Bax蛋白含量明顯升高，軟骨細胞的凋亡數量明顯;電針組、莫比可組與模型組比較其蛋白的表達量下降，Bcl-2的表達情況則與之相反，說明電針對大鼠頸椎病軟骨細胞程序性死亡的調控與Bax、Bcl-2這對因子密切相關。

莫比可片作為非甾體鎮痛、消炎用藥，是臨床醫生治療頸椎病的常用手段。電針亦可發揮抗炎、鎮痛效應、調節機體的整體機能和肌張力、加快循環等作用［14］。在頸椎病的治療中，臨床常選用手三里、頸夾脊穴。頸夾脊在督脈與足太陽經之間循行，督脈統領著人身之陽氣，是人體的陽脈之海。足太陽經為人體最長的經脈，電針頸夾脊既通調督脈又調人之陰陽，故而頸部氣血疏通為醫治頸椎病之根本。現代醫學證實，頸夾脊穴其下富含血管、神經、肌肉等，施刺該處能加快血行，進而改善病患肌肉強硬。手三里歸屬手陽明經，該經陽氣最為盛實且多氣多血，施刺該穴即可振奮陽氣、促進血行;且從經絡的走向來看，其經過頸部，正如《靈樞·經脈》記載:“大腸手陽明之脈……上肩……上出于柱骨之會上。”

綜上可知，電針施治可使頸椎病大鼠軟骨細胞中的Bcl-2、PI3K、P-Akt蛋白表達含量顯著上調，使Bax蛋白表達含量下調。從分子生物學角度出發，結合蛋白表達情況的差異化對比，認為電針在治療椎間盤退變的過程中，可能與PI3K/Akt信號傳導路徑的激活，并發揮相關調節因子如Bax、Bcl-2的含量相關。但我們此次實驗未對其他相關分子機理深入探究，后續實驗開展會進一步完善。

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Effects on electroacupuncture of intervertebral disc cartilage cells in the cervical spondylosis rat model and PI3K/Akt signal pathway

TONG Xiu-bing，ZHENG Jia-xuan，LIAO Jun△，HUANG Ping-ping，ZHENG Chun-shui
(Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou 350122，China)

Objective:To discuss the effect on electro-acupuncture(EA)in the intervertebral disc cartilage cells apoptosis and phosphatidylinositol 3-kinase(PI3K) and serine threonine kinas(AKT)in the rats with cervical spondylosis．Methods:40 SD rats were divided into four groups randomly，including control，model，EA and mobbic groups，male and female half，only 8 for each group．The EA rats were treated with EA on the cervical Jiaji and Shousanli points，25 minutes every day，14 days were one treatment course．The mobbic rats were treated with moby．The control and the model rats were fixed without any treatments．All rats shared the same treatment time．After the courses，the cervical intervertebral disc were detected to examine biochemical indicators．Results:EA treatment on rats of cervical spondylosis could improve the expression of PI3K and P-AKT and Bcl-2，at the same time，reduce the content of Bax．Conclusion:EA treatment can delay intervertebral disc cartilage cell apoptosis in the rats with cervical spondylosis，and the mechanism may be associated with PI3K/AKT signal pathway．

Electroacupuncture;Cervicas spondylosis;Chondrocytes apoptosis;PI3K;AKT

R245．9+7

B

1006-3250(2016)09-1232-04

2016-03-11

國家自然科學基金資助項目(81273836，81001554)

童秀冰(1989-)，女，福建龍巖人，醫學碩士，從事針灸推拿治療脊柱疾病的基礎與臨床研究。

△通訊作者:廖 軍(1977-)，男，重慶合川人，副教授，醫學博士，從事中醫藥防治脊柱疾病的臨床與研究，E-mail: 77liaojun@163．com。