SD大鼠骨髓間充質干細胞培養、純化與鑒定

欒海燕，李廣文，李　卉，王　軍，辛　越，楊朝艷，田　青，何　偉，齊志遠，曹思樟，呂波濤，裴永泉，梁　政，程碩

?

SD大鼠骨髓間充質干細胞培養、純化與鑒定

欒海燕，李廣文，李卉，王軍，辛越，楊朝艷，田青，何偉，齊志遠，曹思樟，呂波濤，裴永泉，梁政，程碩

[摘要]目的探討SD大鼠骨髓間充質干細胞（BMSCs）體外培養、純化及鑒定的方法。方法對1 w齡SD大鼠脫頸處死后，剝離大鼠兩側后肢股骨和脛骨提取BMSCs，采用全骨髓貼壁法分離、培養、純化BMSCs，觀察細胞形態變化，繪制生長曲線，并通過成骨、成脂誘導、克隆形成率等方法對其進行鑒定。結果應用全骨髓貼壁培養法體外分離、純化、培養的SD大鼠BMSCs生長迅速、生長曲線較好，經過成骨、成脂、克隆形成率等方法鑒定證實其為SD大鼠BMSCs。結論全骨髓細胞貼壁培養法是分離、純化與培養BMSCs的一種有效方法，能較快獲得增殖能力較強的原代細胞用于實驗研究。

[關鍵詞]骨髓間充質干細胞；原代培養；純化；大鼠

骨髓間充質干細胞（bone marrow deriVed mesenchyma1 stem ce11s，BMSCs）是骨髓內存在的一類非造血干細胞，也稱骨髓基質干細胞（marrow stroma1 stem ce11s，MSCs）。其來源于中胚層間充質，在體內外具有支持和調控成骨的作用，并且在體內可分布于多種組織和器官，并具有多向分化潛能，能夠向成骨系細胞、成纖維系細胞、網狀細胞、脂肪細胞和內皮細胞等分化，因此也是多能或全能干細胞。在實驗中獲取符合要求的BMSCs就必須將其在體外進行分離、純化、鑒定和增殖，以獲取足量符合要求的BMSCs。本研究采用全骨髓貼壁培養法分離、純化、培養獲取SD大鼠BMSCs，并對其進行多向分化和增殖潛能的鑒定，為相關實驗研究提供依據。

1　材料與方法

1.1主要材料和設備1 w齡SD大鼠[第四軍醫大學實驗動物中心SCXK（軍）2013-009]，體重為50～80 g；酶標儀（BioTek，美國）；α-MEM培養基（Hyc1one，美國）；胎牛血清（SC浙江天杭生物科技有限公司）；胰蛋白酶（Sigma，美國）；青霉素/鏈霉素（Sigma，美國）；L-谷氨酰胺；0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）、L-抗壞血酸（Vc）、地塞米松（Dex）、β-甘油磷酸鈉（β-GP）、胰島素、二甲基亞砜（DMSO）、吲哚美辛、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）、油紅O、CCK8試劑（Sigma，美國）；ALP染色試劑盒（碧云天，中國）；HERACELL細胞培養箱（Thermo，德國）；倒置相差顯微鏡及照相系統（CK40-F200，O1ymPas，日本）；體視顯微鏡（SZX-9，O1ymPas，日本）。

1.2方法

1.2.1細胞體外分離與培養將1 w齡健康SD大鼠脫頸處死后，75%酒精浸泡消毒3 min，在超凈工作臺無菌環境下使用原代器械盒冰上剝離出股骨和脛骨，放置于預冷的PBS溶液培養皿中，而后剪去股骨和脛骨兩端，用1 m1注射器吸取10%胎牛血清的α-MEM培養液反復沖洗骨髓3次，至骨髓腔變白，收集所有沖洗培養液于10 m1離心管中。將收集好的離心管4℃1000 r/min離心5 min，去掉上清液，加入細胞培養液重懸細胞接種于75 cm2培養瓶中。放置在37℃5%CO2孵箱中培養，3 d后對培養瓶進行半換液，并在倒置顯微鏡下觀察細胞形態及生長情況；5 d后全換培養液，培養7～10 d左右，細胞呈較為均勻的成纖維細胞樣，緊貼培養瓶壁生長，長滿90%左右，僅有部分雜細胞，可進行傳代培養。

1.2.2細胞體外分離與培養當看到細胞呈較為均勻的成纖維細胞樣，緊貼培養瓶壁生長，長滿90%左右時方可以進行傳代，一般按照1∶2或1∶3進行傳代。具體方法是：倒掉廢液，用5～10 m1 PBS液漂洗1～3次，倒置顯微鏡下觀察死細胞或衰老細胞是否洗凈；而后加入含EDTA的0.25%胰蛋白酶2～3 m1，置37℃、5%CO2孵箱中進行消化；倒置顯微鏡下觀察細胞消化狀態，細胞凸起縮為圓形時，加入等量的10%胎牛血清的α-MEM培養液終止消化，并使用滴管反復吹打培養瓶底壁細胞，注思不要產生氣泡影響細胞活性。收集培養液于10 m1離心管中，4℃1000 r/min離心5 min，去掉上清液，加入細胞培養液重懸細胞，等量接種于2～3個75 cm2培養瓶中，在37℃、5%CO2孵箱中培養。

1.2.3細胞生長曲線測定取第2～5代BMSCs，按上節方法進行消化、離心、重懸細胞，稀釋細胞濃度到5×103個/m1，使用細胞計數板計數。按200 μ1/孔細胞懸液接種至96孔板，分為12組，每組8孔，置于孵箱內培養。以后每日取1組（8孔），吸除廢液，加入100 μ1培養液及10 μ1 CCK8溶液孵箱內培養3 h。另取96孔板，從原培養板添加CCK8孔中吸取100 μ1溶液至新96孔板中，使用酶標儀在波長為450 nm處測得OD值，計算每組均值和標準差，使用GraPhPad Prism 5軟件繪制以天數為橫坐標，細胞均值數為縱坐標的生長曲線。

1.2.4細胞鑒定

1.2.4.1克隆形成取第3代BMSCs并采用細胞計數板計數，以×103個/100 mm培養皿接種細胞，加入10%胎牛血清的培養液至8 m1，于37℃、5%CO2孵箱箱中培養，每2 d換液1次。第14 d后，PBS清洗，2.5%戊二醛固定15 min，之后加入8 m1 0.1%甲苯胺藍染色15 min，PBS漂洗2次，置于體式顯微鏡下對細胞克隆形成情況進行計數（＞50個細胞的細胞團記作1個克隆），并計算克隆形成率（克隆形成率＝細胞克隆數÷接種時的細胞數×100%）。以上計數重復3次。

1.2.4.2成脂誘導分化將第3代BMSCs以5× 105個/孔接種細胞于24孔培養板中，待細胞貼壁生長、融合＞90%時，加入脂誘導液（5%FBS的α-MEM培養基，100 nM地塞米松，0.5 mM IBMX，50 mM吲哚美辛，0.01 mg/m1胰島素，50 μg/m1的抗壞血酸）誘導2 w，每4 d換液1次。2 w后倒置顯微鏡下觀察脂滴形成情況，PBS清洗3次，5 min/次，2.5%戊二醛固定15 min，油紅O染色，倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.2.4.3成骨誘導分化將第3代BMSCs以5× 105個/孔接種細胞于24孔培養板中，待細胞貼壁生長、融合＞90%時，加入骨誘導液（5%FBS的α-MEM培養基，10 mM β-甘油磷酸鈉，50 μg/m1抗壞血酸，100 nM地塞米松）培養，每4 d換液1次。一部分細胞成骨誘導1 w后，采用堿性磷酸酶試劑盒染色，倒置顯微鏡下觀察ALP的形成；其余細胞繼續誘導至4 w，茜素紅染色漂洗后，倒置顯微鏡下觀察礦化情況并拍照。

2　結果

2.1細胞生長情況及形態初接種的BMSCs一般懸浮于培養液中，2 h后逐漸貼壁生長，1 d時細胞較圓，密集分布（圖1A）；37℃、5%CO2孵箱培養3 d后，首次半換液，可見部分細胞呈成纖維細胞樣，部分雜細胞仍呈類圓形（圖1B）；培養5 d全換液后，BMSCs開始集落，多數呈成纖維細胞樣，仍有少量雜細胞（圖1C）；培養10 d后，雜細胞基本消失，細胞呈較為均勻的成纖維細胞樣，緊貼培養瓶壁生長，長滿90%左右，可進行傳代培養（圖1D）。繼續傳代得到第2、3代細胞，純化的細胞呈現均一的成纖維細胞樣，旋渦狀或輻射狀整齊有序排列，即可用于實驗。

2.2細胞生長曲線采用CCK8法測定細胞生長曲線，如圖2所示，生長曲線呈“S”形，前1～2 d細胞生長緩慢，處于生長潛伏期；自第3 d起，細胞進入快速增殖期，并在第7 d達到增殖平臺期，細胞數目增長趨于平緩。

圖2　第3代BMSCs的生長曲線

2.3細胞鑒定BMSCs低密度接種，37℃、5% CO2培養14 d，可見集落樣生長的細胞克隆團塊（圖3A），克隆形成率為（22.5±2.9）%。使用成脂誘導液誘導成脂分化2 w后，油紅O染色，可見細胞內及細胞間分布著紅色脂滴（圖3B）。使用成骨誘導液成骨誘導1 w后，可見細胞內藍色結晶（圖3C）；使用成骨誘導液成骨誘導4 w后，經茜素紅染色后，可見形成不規則的紅色礦化結節（圖3D）。

3　討論

BMSCs屬于多能或全能基質干細胞，具有分化為多種細胞的潛能，如成骨細胞、脂肪細胞等，在形態上其與成纖維細胞相似。目前常用體外分離純化培養大鼠BMSCs的方法主要包括全骨髓貼壁培養法、密度梯度離心法、流式細胞儀法、特制培養板篩選法和免疫磁珠法等[1]。從綜合各個方面考慮，全骨髓貼壁培養法較為常用、且操作相對簡易。

全骨髓貼壁法即取自動物股骨和脛骨的全骨髓加入培養液中培養，接種3 d后半換液。也有研究表明延長首次換液時間有利于細胞的貼壁和增殖，因為不貼壁細胞分泌的細胞因子可能對于干細胞的生長有促進作用，首次換液時間最長可在7～10 d進行[2]。首次換液后，每2 d換液1次，細胞長滿80%～90%即可首次傳代。本實驗采取貼壁離心法，操作簡易，需要實驗儀器設備較少，BMSCs制備純度也較高。

CCK8是一種檢測細胞存活和生長的常用方法，具有靈敏度高、重復性好、操作簡便等特點[3]。通過CCK8檢測SD大鼠BMSCs的生長曲線，表明分離純化培養的SD大鼠BMSCs具有一定的增殖能力和自我更新能力[4]。從細胞生長曲線看，全骨髓貼壁法培養的SD大鼠BMSCs增殖迅速、生長曲線良好，證明獲得的SD大鼠BMSCs具有很好的增殖能力，活性很強。

圖1　SD大鼠BMSCs不同培養時間生長情況A：培養1d；B：培養3d；C：5d；D：10d

圖3　BMSCs的克隆形成及體外多向分化潛能鑒定

克隆形成鑒定是BMSCs研究中的常用方法，主要原理是將細胞分離成單細胞懸液，然后接種培養基，根據集落形成數量和大小來判斷細胞增殖能力和群體依賴能力[1，6-7]。同時，多向分化潛能也是BMSCs的重要特征。本實驗通過體外成脂、成骨誘導對SD大鼠BMSCs多向分化潛能進行鑒定，結果發現成骨誘導后，成骨早期指標之一的堿性磷酸酶染色呈強陽性，證明分離培養的SD大鼠BMSCs開始向成骨細胞轉化；而成骨誘導4 w后經過茜素紅礦化染色發現，鈣化結節染色呈強陽性，出現了典型的成骨細胞特性，表明SD大鼠BMSCs具有成骨分化潛能。在成脂誘導2 w后，細胞胞漿及細胞間發現脂滴，油紅O染色出現明顯紅色脂滴，證實分離培養的SD大鼠BMSCs開始向成脂細胞轉化。

綜上所述，本實驗分離、純化培養的SD大鼠BMSCs是符合實驗要求的具有自我更新和增殖能力，以及多向分化潛能的干細胞，可為相關實驗研究提供依據。

【參考文獻】

[1]Pittenger MF，Mackay AM，Beck SC，et a1. Mu1ti1ineage Potentia1 of adu1t human mesenchyma1 stem ce11s [J]. Science，1999，284:143-147.

[2]Jaiswa1 N，Haynesworth SE，CaP1an AI，et a1. Osteogenic differentiation of Purified，cu1ture-exPanded human mesenchyma1 stem ce11s in Vitro[J]. J Ce11 Biochem，1997，64:295-312.

[3]熊建文，肖化，張鎮西.MTT法和CCK-8法檢測細胞活性之測試條件比較[J].激光生物學報，2007，10:559-562.

[4]Bag1ioni S，Cantini G，Po1i G，et a1. Functiona1 differences in Viscera1 and subcutaneous fat Pads originate from differences in the adiPose stem ce11[J]. PLoS One，2012，7:e36569.

[5]Fukumoto T，SPer1ing JW，Sanya1 A，et a1. Combined effects of insu1in-1ike growth factor-1 and transforming growth factor-beta1 on Periostea1 mesenchyma1 ce11s during chondrogenesis in Vitro [J]. Osteoarthr Carti1，2003，11:55-64.

[6]Gimb1e J，Gui1ak F. AdiPose-deriVed adu1t stem ce11s: iso1ation，characterization，and differentiation Potentia1 [J]. CytotheraPy，2003，5:362-369.

[7]Jankowski RJ，Deasy BM，Huard J. Musc1e-deriVed stem ce11s[J]. Gene Ther，2002，9:642-647.

Cu1tiVation，dePuration and identification of SD rats' bone marrow deriVed mesenchyma1 stem ce11s

Luan Haiyan1，Li Guangwen2，3，Li Hui4，Wang Jun6，Xin Yue2，Yang Chaoyan5，Tian Qing3，He Wei3，Qi Zhiyuan6，Cao Sizhang3，Lü Botao6，Pei Yongquan7，Liang Zheng6，Cheng Shuo6

1. B1ood Center of Yantai City，Yantai，Shandong，264000，China；2. State Key Laboratory of Mi1itary Stomato1ogy，Co11ege of Stomato1ogy，the Fourth Mi1itary Medica1 UniVersity，Xi'an，Shaanxi，710032，China；3. Unit 96617 of PLA，Luzhou，Sichuan，646000，China；4. DePartment of EPidemio1ogy and Hea1th Statistics，West China Schoo1 of Pub1ic Hea1th，Sichuan UniVersity，Chengdu，Sichuan，610041，China；5. DePartment of Pediatrics，PeoP1e's HosPita1 of Luzhou City，Luzhou，Sichuan，646000，China；6. HosPita1 537 of PLA，Baoji，Shaanxi，721006，China；7. Unit 96411 of PLA，Baoji，Shaanxi，721006，China

[Abstract]ObjectiVe To exP1ore the cu1tiVation，dePuration，and identification methods of SD rats' bone marrow deriVed mesenchyma1 stem ce11s（BMSCs）in Vitro. Methods Necks of one-week-o1d SD rats were taken off for death，their hind 1imb femurs and tibias on both sides were striPPed in order to abstract BMSCs. Who1e bone marrow adherent method was used to seParate，cu1ture，and Purify BMSCs. Ce11 morPho1ogic changes were obserVed，and the growth curVe was drawn. The identification was carried out by the methods of osteogenic and adiPogenic induction and c1oning efficiency. Resu1ts SD rats' BMSCs grew raPid1y，and the growth curVe was good. Through the methods of osteogenic and adiPogenic induction and c1oning efficiency，those ce11s were identified as SD rats BMSCs. Conc1usion Who1e bone marrow adherent method is an effectiVe way to seParate，Purify，and cu1ture the BMSCs，which can raPid1y obtained the Primary ce11s with better Pro1iferatiVe caPacity for exPeriment and research use.

[Key words]bone marrow deriVed mesenchyma1 stem ce11；Primary cu1ture；Purification；rat

收稿日期：（2015-08-12）

通訊作者：李廣文，電話：029-84776159；E-mai1: fes1gw_4138@ 163.com

基金項目：軍事口腔醫學國家重點實驗室開放課題資助項目（2014KB11）

文章編號1004-0188（2016）02-0117-04

doi:10.3969/j.issn.1004-0188.2016.02.001

中圖分類號R 329.2

文獻標識碼A

作者單位：264000山東煙臺，煙臺市中心血站（欒海燕）；軍事口腔醫學國家重點實驗室、第四軍醫大學口腔醫學院（李廣文，辛越）；解放軍96617部隊（李廣文，田青，何偉，曹思樟）；四川大學華西公共衛生學院流行病與衛生統計學系（李卉）；瀘州市人民醫院兒科（楊朝艷）；解放軍537醫院（王軍，齊志遠，呂波濤，梁政，程碩）；解放軍96411部隊（裴永泉）