海洋微藻保存方法的研究進展

張文慧，高金偉，姜智飛，范耘碩，周文禮

（天津農學院 水產學院，天津市水產生態與養殖重點實驗室，天津 300384）

海洋微藻保存方法的研究進展

張文慧，高金偉，姜智飛，范耘碩，周文禮通信作者

（天津農學院 水產學院，天津市水產生態與養殖重點實驗室，天津 300384）

本文綜述了海洋微藻保存常用方法，主要有繼代保存法、低溫冷凍保存技術、超低溫保存技術、斜面保存法及脫水包埋法。繼代保存法操作簡單，保存時間短；斜面保存易攜帶，但瓊脂收縮后藻細胞容易變形；低溫冷凍保存操作簡便，相對保存時間較短；超低溫保存法適合藻類的長期保存；包埋脫水保存技術操作簡單，不需要復雜的設備，不使用抗凍保護劑，但是，目前仍需要解決預培養條件、脫水速率、膠球含水量等關鍵技術問題。此外，本文概述了當前海洋微藻保存研究的進展及其保存的意義，為藻種的保存研究提供一定的基礎。

保存技術；研究進展；保存意義

海洋微藻中所含的營養物質十分豐富，除了含有豐富的蛋白質、氨基酸、色素等，還富含EPA和DHA[1]。在育苗方面，海洋微藻是魚、蝦、貝等經濟動物良好的餌料，且具有良好的分散性和保型性[2]，這是人工餌料所不具備的。除此之外，有些微藻還可以作為優良的飼料添加劑和環境改良劑[3]。但是，在微藻的培育過程中，由于藻類的生長周期較短，容易被其他藻種、細菌等污染。因此，在保存過程中，減少接種次數，防止微藻被染，找到一種既能長期保存藻種，又能維持藻種活性的方法十分必要。目前，我國微藻保存技術比較薄弱，現有的微藻種類有限，沒有適當的保存方法而棄置藻種，使微藻資源浪費，在不同程度上限制微藻生物技術的發展[4]。近幾年，我國在海洋微藻藻種的保存方面取得了一定的進展[5-8]。本文綜述了藻種保存的幾種方法及展望，旨在為科研工作者提供參考。

1 藻種保存研究進展及其意義

海洋微藻的培養周期比較短，在培育海洋微藻過程中，容易被其他藻種、細菌所污染。實驗室培養，由于藻類繁殖迅速，需要頻繁接種，導致剩余藻種浪費，因此，急需找到合適的方法長期保存微藻。盡管國內外很早開始研究海洋微藻，但是，海洋微藻的保存工作從20世紀初期才開始，目前，國際著名的海洋微藻保存機構有CCAP、SAG、UTEX、COBRA，已保存海洋微藻2 000多種[9]。但是，每種藻類都有其各自特殊的生態條件，保存藻類的方法也各有不同，需要在具體的研究、工作中更詳細的探究。

2 藻種保存常用技術

2.1 繼代保存法

繼代保存法是目前采用的最普遍的藻種保存方法，是在常溫或低常溫條件下保存，常溫指15～25 ℃，常低溫指0～15 ℃，光照為6 μmol/（m2· s）。將海洋微藻接種在液體培養基中，先在適宜的溫度、光強下培養，待微藻生長到一定密度后，將其轉移到低溫、弱光條件下保存。繼代保存法操作簡單，但是保存時間短，繼代頻繁，藻種容易被污染。

2.2 低溫冷凍與超低溫保存

在4 ℃的低溫條件下，微藻細胞的細胞活力和生化活力均會下降，在此條件下保存微藻，可保存半年左右，可減少藻種的接種次數。一般情況下，將藻液移至離心管內，封口膜封好，置于4～5 ℃冰箱中保存。保存前，還可以將藻液離心，得到高密度的藻濃縮液后保存。利用低溫冷凍方式保存的藻種，在更新接種時，需要15～20 d方才能正常生長。研究表明，4 ℃保存小球藻不宜超過6周[10]；三角褐指藻保存的最佳溫度為0～10 ℃[11]；有低溫保存前后藻中高度不飽和脂肪酸（HUFA）的含量變化不明顯[12]；三角褐指藻在-20 ℃下保存20 d后，重新培養2 d即能恢復正常生長、繁殖[13]；海鏈藻在4、-4及-20 ℃保存時，蛋白質和糖的含量均會下降，且下降幅度隨時間的延長而逐漸增加，脂肪含量下降不明顯[14]。冷凍保存可保存細胞活力，在一定程度上抑制生物細胞的生化活性，能有效解決藻種保存過程中污染、混雜及變異，實現長期保存。

超低溫保存，又稱冰凍保存，通常用液態氮作為冷媒[15]。在此溫度下，藻類的物質代謝和生長活動幾乎完全停止，但仍處于可逆的成活狀態。超低溫保存最開始使用一步法，即在濃縮的藻液中加入甘油或DMSO（二甲基亞砜）后，直接投入液氮中保存。此方法只適用于少數微藻的保存，對含水量較高的藻類不適用。

之后，在一步法的基礎上，研究出兩步法的保存方法，先對保存的藻種進行預處理，加入抗凍保護劑，一般用二甲基亞砜（DMSO）、甘油和甲醇，濃度5％～15％。處理后的藻液放到凍存管里，按照0.5～4 ℃/min的降溫速度，在-30～-60 ℃的溫度下欲凍0～60 min后，迅速轉移到液氮中保存。

超低溫保存可以長期保持生物遺傳穩定性，不僅可以對藻種進行優勝劣汰的選擇，還能最大限度地減少藻種的污染，是當前長期保存藻種最為有效的方法。有研究表明[16]，超低溫冷凍保存可以使7屬9種微藻的22個品系的微藻存活5～8年。但是，目前藻類種類繁多，生理狀態不同，因此，每種微藻保存的方法不一樣，加入的抗凍劑的種類和濃度也不盡相同[17]。超低溫保存研究目前只取得了初步的成果，許多問題尚需解決，例如，超低溫保存條件沒有一套標準的方法，一般建立在經驗之上，增加實驗風險，浪費人力物力，增加保存成本等，需要更多進一步的研究。

2.3 斜面保存

在微藻的培養液中加入0.7％～1％的瓊脂，制成瓊脂斜面固體培養基，制作固體培養基時，其營養物質的濃度應該在正常配方的基礎上增加一倍。用平板劃線的方法將藻種接種在固體培養基上，接種后的藻種，先置于適宜的環境下培養，待藻細胞達到一定密度后，在固體培養基上會形成藻種群落，肉眼可看到明顯的條狀或塊狀的藻細胞群，而后，將固體培養基移至低溫、弱光條件下或置于冰箱中保存。一般情況下，斜面保存可保存1年左右，如果每天讓藻種接受短時間弱光照射，可保存2～3年。

斜面保存方法操作簡便，體積小，便于攜帶，是目前比較常用的保存方法，但瓊脂斜面放置時間過長后，容易干燥收縮，造成藻細胞變形，因此，在重新接種的時候需要較長的時間。

2.4 包埋脫水保存

包埋保存主要是對微藻進行蔗糖預培養，運用細胞固定化方法的原理，將海洋微藻包埋在褐藻膠基質中，使其固定化，之后適度脫水，進行超低溫保存[18]。

包埋脫水法將海洋微藻包埋在褐藻酸鈣中，然后，置于高濃度的蔗糖培養基中進行預培養，繼而用無菌空氣流或硅膠進行脫水，最后置于液氮中保存。膠囊化可以較大限度的保護海洋微藻細胞的結構，使之不會因試驗過程中溫度的急劇變化而遭受破壞。脫水是將膠囊化材料的含水量降到一定程度，之后再投入液氮中保存，脫水方法有多種，常用的有直接干燥脫水、高濃度蔗糖預處理、硅膠吸附脫水等方法。

使用蔗糖處理是為了提高細胞質的濃度，增加其抗凍力和脫水力，以促進降溫過程中玻璃化的形成。在蔗糖的使用過程中，既可以先將藻類包埋再進行高濃度的蔗糖培養，也可以先用高濃度的蔗糖培養再進行包埋，大部分研究會使用前者。使用蔗糖培養的時間與海洋微藻的種類、蔗糖的濃度有關，基本上遵循既使樣品獲得高的抗凍力和脫水力、又不能引起微藻細胞太多的高滲損傷的原則。包埋脫水保存法減少了低溫冷藏過程中冰晶的產生量，快速升溫融解時阻止了冰晶的再生，從而減少對微藻細胞的傷害。

包埋脫水法在低溫冷藏過程中可減少冰晶的產生，在快速升溫溶解過程中可阻止冰晶再生[19]，使海洋微藻細胞獲得了較高的抗凍力，提高了保存效果，降低遺傳變異的可能性。此技術操作簡單，無需復雜的設備，不使用抗凍保護劑。但目前仍需要解決預培養條件、脫水速率、膠球含水量等關鍵技術問題。

3 展望

單細胞藻類保存在實際研究與生產中具有重要的實際意義，但是，保存技術尚未成熟與穩定。目前，對微藻的研究集中在生理生態水平和分子水平，基礎的研究有待加強，許多問題有待進一步研究，例如，藻種是否可以保存更長的時間；大多數微藻保存均需要抗凍保護劑，傳統的抗凍保護劑有一定的毒性，目前新的抗凍保護劑有抗凍蛋白（AFP）和冰結合蛋白（IBF），抗凍蛋白的性質與冰晶結構相似，可降低冰晶的生長速度，冰結合蛋白可抑制再結晶，從而起到保護細胞膜的作用[20]，但抗凍劑的用量仍需進一步的研究。

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The Preservation Technology of Marine Microalgae

ZHANG Wen-hui, GAO Jin-wei, JIANG Zhi-fei, FAN Yun-shuo, ZHOU Wen-liCorrespondingAuthor
（Tianjin Key Laboratory of Aqua-ecology and Aquaculture, College of Fisheries, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

The paper summarizes several methods to preserve the marine microalgae, including succeeding preservation, cryopreservation technology at low temperature, the cryopreservation technique, save method and the embedding method of dehydration. Succeeding preservation is simple to operate, but the time is not long; agar slant is convenient to carry, but the aglae cells is out of shape easily after the agar shrink; cryopreservation technology at low temperature is also simple but the time is not long; the cryopreservation technique is suit to preservation for a long time; the embedding method of dehydration do not need the Complicated equipment and Cryoprotectant, but we should solve the key technical problems of culture conditions, dehydration rate and rubber ball water content. And provides an overview of the progress and significance of the research.

the preservation technology; the progress of the research; the significance

S931.1

A

1008-5394（2016）04-0055-03

2015-12-22

國家星火計劃項目“海水魚工廠化健康養殖關鍵技術示范與推廣”（2013GA610002）；農業部水產品加工重點實驗室開放基金“蛋白核小球藻CGF對環境因子脅迫響應及分子機理研究”（NYJG201508）

張文慧（1991-），女，河北保定人，碩士在讀，主要從事漁業資源保護與環境修復研究。E-mail：773765349@qq.com。

周文禮（1969-），男，山東濟寧人，研究員，博士，主要從事水域生態學和微藻資源化利用研究。E-mail：saz0908@126.com。