基于原發(fā)性大鼠肝癌模型的糖修飾熒光膠束腫瘤成像診斷評價

劉　達(dá)，張　康，吳選俊，韓守法，劉平果*

( 1．廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院，福建廈門361102; 2．廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，福建廈門361005)

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基于原發(fā)性大鼠肝癌模型的糖修飾熒光膠束腫瘤成像診斷評價

劉達(dá)1，張康1，吳選俊2，韓守法2，劉平果1*

( 1．廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院，福建廈門361102; 2．廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，福建廈門361005)

摘要:手術(shù)成瘤模型因其腫瘤微環(huán)境與原發(fā)性肝癌相差較大而不能準(zhǔn)確評價肝癌靶向性藥物，二乙基亞硝胺( diethylnitrosamine，DEN)誘發(fā)大鼠肝癌模型因其誘發(fā)癌變的病理過程及腫瘤微環(huán)境均與原發(fā)性肝癌相似而成為理想的肝癌動物模型．本研究在傳統(tǒng)的DEN誘導(dǎo)法基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，實現(xiàn)了大鼠的100%成癌率和誘導(dǎo)過程中的零死亡率．基于該肝癌模型評價了新型肝癌靶向性糖修飾熒光膠束在肝癌中的實際應(yīng)用價值，結(jié)果證明結(jié)合半乳糖胺的羅丹明功能化的糖修飾熒光膠束( RST@ P－Gal)表現(xiàn)出了較好的腫瘤靶向性和較低的背景信號，可以檢測出0．5～5 mm的腫瘤病灶，這將對人類肝癌的早期診斷和術(shù)中微小病灶的清除帶來一定的幫助．

關(guān)鍵詞:原發(fā)性肝癌;熒光成像;二乙基亞硝胺( DEN) ;熒光膠束

原發(fā)性肝癌(簡稱肝癌)是全球第5大高發(fā)癌癥，全球每年新發(fā)癌癥1 300萬例，其中肝癌占78萬例左右［1］．肝癌早期沒有特異性臨床癥狀，出現(xiàn)癥狀時腫瘤一般已經(jīng)增長至4～8 cm，由于肝癌診斷時腫瘤往往較大，雖然肝癌手術(shù)器械不斷地革新，切除技術(shù)日臻完善，但是腫瘤根治切除率仍較低(約25%)，5年生存率徘徊在38%～47%，術(shù)后的復(fù)發(fā)率高達(dá)61．5%，這些可能與肝癌早期診斷率低，術(shù)前、術(shù)中未能發(fā)現(xiàn)微小(直徑小于5 mm)肝癌病灶有關(guān)［2－6］．

糖受體參與的細(xì)胞信號傳導(dǎo)一度成為研究熱點(diǎn)，如去唾液酸糖蛋白受體、甘露糖受體、半乳糖受體等［7－17］，但是糖受體參與的腫瘤熒光檢測領(lǐng)域還存在空白．近期有文章報道了一種酸敏感羅丹明( Rhodamine)功能化的聚(苯乙烯－馬來酸)熒光膠束( RST@ P)，其根據(jù)肝癌細(xì)胞表面不同糖蛋白受體含量的不同，分別將葡萄糖、半乳糖、甘露糖3種糖蛋白連接到RST@ P上形成新的膠束(依次簡寫為RST@ P－Glu、RST@ P－Gal、RST@ P－Man)進(jìn)行腫瘤熒光檢測成像，在皮下腫瘤模型和肝臟原位種植腫瘤模型中表現(xiàn)出了較高的腫瘤靶向性和較低的背景信號［3］．

但是，腫瘤的發(fā)生發(fā)展與其所處的內(nèi)環(huán)境密不可分，由腫瘤細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、微血管、組織液及少量浸潤細(xì)胞等共同組成，有別于正常細(xì)胞與其周圍組織所形成的微環(huán)境，它們與腫瘤相互作用，對細(xì)胞的癌變、癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和對抗癌藥物的抵抗和靶向性的干擾等都有重要的作用［18－21］．皮下腫瘤模型和肝臟原位種植腫瘤模型不能很好地模擬出自然狀態(tài)下腫瘤細(xì)胞所處的微環(huán)境，對評價該糖修飾熒光膠束的靶向性等方面存在一些不足．而二乙基亞硝胺( diethylnitrosamine，DEN)誘導(dǎo)的大鼠肝癌模型因其誘發(fā)癌變的整個過程與人類肝癌發(fā)生過程十分相似，都經(jīng)歷了經(jīng)典的“肝癌三部曲”(肝炎，肝硬化，肝癌)［22］．因此，我們嘗試構(gòu)建DEN誘發(fā)的Fisher大鼠原發(fā)性肝癌模型以評價該糖修飾熒光膠束真正臨床應(yīng)用價值．同時，我們在傳統(tǒng)DEN誘導(dǎo)大鼠肝癌法的基礎(chǔ)上對用藥濃度和周期進(jìn)行了改良，實現(xiàn)了大鼠的100%成癌率和誘導(dǎo)過程中的零死亡率．

1實驗部分

1. 1試劑耗材

DEN、臺盼藍(lán)、RPMI 1640培養(yǎng)基( Sigma公司)，胎牛血清( FBS) ( Gibco公司)，青霉素、鏈霉素(廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院)，100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿( Corning公司)，槍尖( Axygen公司)，1 mL注射器(福建莆田市醫(yī)藥有限公司)，LO2、HepG2細(xì)胞( ATCC公司)，實驗所用水均為超純水．

1. 2儀器

FX PRO型小動物光學(xué)活體成像系統(tǒng)( Carestream Health公司)，AV 400 MHz型核磁共振儀( Bruker公司)，SP5型激光共聚焦顯微鏡(德國Leica顯微系統(tǒng)有限公司)，HV－110型全自動高壓蒸汽滅菌器(日本HIYARAMA公司)，18．2 MΩ·cm超純水儀(美國PALL公司)，XB－K－2型血球計數(shù)板(浙江玉環(huán)縣求精醫(yī)用儀器廠)，KD－8025型計數(shù)器(義務(wù)逵達(dá)電子儀器廠)．

1. 3動物

Fisher 344大鼠(清潔級) :雄性，5周齡(北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司) ; BalB/c小鼠(清潔級) :雄性，5周齡(上海斯萊克實驗動物有限公司)．

1. 4實驗方法

細(xì)胞激光共聚焦成像:熒光共聚焦成像用SP5型激光共聚焦顯微鏡來完成．1)分別稱取RST@ P、RST @ P－Glu、RST@ P－Gal、RST@ P－Man各1 mg溶于1 mL超純水中，超聲波清洗器混勻5 min; 2)染色:向LO2、HepG2兩種細(xì)胞(各4盤)中每盤加入一種熒光膠束100 μL至終質(zhì)量濃度10 μg/mL，于37℃培養(yǎng)30 min; 3)固定:吸盡培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液( PBS)潤洗一遍后，分別加入2 mL多聚甲醛常溫固定細(xì)胞5 min; 4)封片:吸盡多聚甲醛，用PBS潤洗3遍后封片; 4)觀察: 490 nm激發(fā)光激發(fā)，然后收集510 nm的發(fā)射光成像．

改進(jìn)型原發(fā)性大鼠肝癌模型的建立:選取雄性Fisher 344大鼠50只，體質(zhì)量150～160 g，穩(wěn)定喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為實驗組45只(采用間斷給藥法，在第1，3，5月用0．1 mg/mL的DEN溶液喂養(yǎng)，第2，4月用超純水喂養(yǎng))和對照組5只(整個實驗過程中均飲用超純水)，在第5個月末用磁共振成像( MRI)檢測大鼠肝癌形成情況．

肝癌靶向性糖修飾熒光膠束成像:用FX PRO型小動物光學(xué)活體成像系統(tǒng)完成．1)將8只MRI驗證過的肝癌鼠隨機(jī)分為RST@ P、RST@ P－Glu、RST@ PGal、RST@ P－Man 4組，每組2只，分別經(jīng)尾靜脈注射糖修飾熒光膠束40 mg/kg，每只500 μL; 2)器官分離:注射15 h后分別分離出各組實驗鼠的代表器官，即腦、心臟、脾臟、腎臟、肺和肝; 3)熒光成像: 490 nm激發(fā)光激發(fā)，然后收集510 nm的發(fā)射光成像．

蘇木精－伊紅( HE)染色．1)取材并制作石蠟切片:切取0．5 cm×0．5 cm×0．5 cm大小的肝臟組織塊投入10%(體積分?jǐn)?shù)，下同)甲醛固定2周，脫水、浸蠟包埋、切片; 2)脫蠟:切片在二甲苯中脫蠟10 min; 3)乙醇梯度復(fù)水:依次經(jīng)過100%，100%，95%，85%，70%，50%的乙醇溶液和去離子水，各浸泡3 min; 4)蘇木精染色: 0．5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))蘇木精中染色10 min，用水沖洗掉玻片上多余染液，1%鹽酸乙醇溶液( 70%乙醇配制)分色片刻，顯微鏡觀察細(xì)胞核染色情況; 5)伊紅復(fù)染:流水沖洗20 min;經(jīng)0．5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))伊紅染液染色3 min; 6)乙醇梯度脫水:依次經(jīng)過70%，85%，95%，100%，100%的乙醇溶液，各浸泡3 min; 7)透明:經(jīng)過兩次二甲苯溶液，各浸泡5 min; 8)封片:加1～2滴中性樹膠，迅速加蓋玻片封固．

細(xì)胞水平安全性評估:正常培養(yǎng)的LO2和HepG2細(xì)胞各16盤，經(jīng)臺盼藍(lán)拒染法細(xì)胞計數(shù)后將1 mg/mL 的RST@ P熒光膠束加入4盤LO2和HepG2細(xì)胞中，至終質(zhì)量濃度分別為0，50，200，400 μg/mL，37℃培養(yǎng)24 h后同法計數(shù)．RST@ P－Glu、RST@ P－Gal、RST@ P－Man評價方法同RST@ P．

動物水平安全性評估:取5周齡健康雄性BalB/c小鼠48只，隨機(jī)分為6組，每組8只;分別經(jīng)尾靜脈注射25，50，100，200，400 mg/kg的RST@ P－Gal，每只500 μL，對照組用PBS代替;每5 d監(jiān)測體質(zhì)量一次，連續(xù)觀察一個月．

2結(jié)果與討論

2. 1糖修飾熒光膠束的攝取

目前用來成像的糖修飾熒光膠束一種是作用于細(xì)胞表面，另一種是特異性進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用．而本文所述糖修飾熒光膠束是根據(jù)腫瘤細(xì)胞表面糖受體的種類和含量不同而被特異性介導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，且熒光在溶酶體酸性( pH 4．0～6．5)環(huán)境下被490 nm激發(fā)光激發(fā)，然后收集510 nm的發(fā)射光而實現(xiàn)成像［3，23］．腫瘤細(xì)胞表面比正常細(xì)胞的去唾液酸糖蛋白受體的表達(dá)水平高［24－26］，半乳糖受體在不同種腫瘤細(xì)胞表面含量有較大差異，但它在肝細(xì)胞表面表達(dá)豐富［27－28］，甘露糖受體在高凋亡和壞死細(xì)胞中含量較高［29］，而肝硬化、肝臟癌變過程中細(xì)胞凋亡數(shù)量較正常細(xì)胞要多，因此去唾液酸糖蛋白受體、半乳糖受體、甘露糖受體都成為生物體內(nèi)檢測腫瘤情況的潛在受體．通過激光共聚焦顯微鏡對LO2、HepG2兩種細(xì)胞熒光成像結(jié)果(圖1)可知，糖修飾熒光膠束是在細(xì)胞內(nèi)部發(fā)揮作用，但含量無明顯區(qū)別，正如熒光分布在皮下腫瘤模型與在肝臟原位種植腫瘤模型中不一致一樣，這都可能與腫瘤微環(huán)境有關(guān)．

圖1糖修飾熒光膠束發(fā)揮作用位置的鑒定Fig．1 Identification of fluorescence micelles' work place

2. 2改進(jìn)型原發(fā)性肝癌模型的構(gòu)建及鑒定

實驗中所涉及操作均遵循《實驗動物管理條例》［30］．我們在傳統(tǒng)的DEN誘導(dǎo)法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，用藥質(zhì)量濃度由1 mg/mL降低至0．1 mg/mL，同時增加了用藥間歇期，實現(xiàn)了大鼠的100%成癌率和誘導(dǎo)過程中的零死亡率．實驗中對實驗組和對照組大鼠進(jìn)行體質(zhì)量監(jiān)測(圖2( a) )，實驗結(jié)束對所有實驗組大鼠進(jìn)行統(tǒng)一MRI檢測成瘤情況(圖2 ( b) )．

圖2體質(zhì)量監(jiān)測( a)及MRI鑒定成瘤情況( b)Fig．2 Chronological changes in the body weight( a) and MRI to detect the tumor( b)

2. 3原發(fā)性肝癌的糖修飾熒光膠束成像

對原發(fā)性肝癌大鼠注射不同糖修飾熒光膠束(與圖2( b)中所注1～4對應(yīng)) 15 h后，熒光成像結(jié)果(圖3)顯示:熒光膠束主要聚集在肝臟腫瘤部位，在正常肝臟組織有少量聚集，而在腦、心臟、腎臟等肝外器官很少聚集．可以看出RST@ P－Gal表現(xiàn)出了更好的腫瘤靶向性和更低的背景信號，可以檢測出0．5～5 mm的腫瘤病灶．

2. 4 HE染色鑒定肝癌情況

取圖3( a)中虛線位置組織制作HE染色切片，評價DEN誘發(fā)肝癌是否具有正常肝癌組織病理學(xué)特征．如圖4所示，纖維結(jié)締組織大量增生，正常肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，假小葉結(jié)構(gòu)形成，同時可見不同程度炎細(xì)胞浸潤和脂肪樣變等肝癌典型病理變化，與原發(fā)性肝癌組織病理特點(diǎn)吻合．

圖3糖修飾熒光膠束在不同器官中的分布Fig．3 Distribution of the fluorescence materials in different organs

2. 5安全性評估

為了評價該糖修飾熒光膠束是否會對機(jī)體產(chǎn)生影響，故在細(xì)胞水平和動物水平進(jìn)行相關(guān)毒性評價．

在細(xì)胞水平，經(jīng)用藥質(zhì)量濃度為0，50，200，400 μg/mL的4組實驗驗證，各糖修飾熒光膠束均未對細(xì)胞產(chǎn)生明顯的毒性(圖5( a)和( b) )．在動物水平，用藥質(zhì)量濃度為400 mg/kg組，在最初注射時個別小鼠會出現(xiàn)精神萎靡不振的癥狀，十幾分鐘后恢復(fù)正常，可能與用藥體積和注射速度有關(guān);實驗結(jié)束時實驗組與對照組動物狀態(tài)無差異，無死亡情況，體質(zhì)量相當(dāng)．證明藥物可隨新陳代謝排出體外，對機(jī)體不會造成明顯影響(圖5( c) )．

圖4肝癌組織切片HE染色Fig．4 Hematoxylin－Eosin staining of the sections of liver cancer tissues

圖5細(xì)胞和動物水平安全性評估Fig．5 Safety assessment of the fluorescence micelles in cells and animals

3結(jié)論

改進(jìn)后DEN誘發(fā)型原發(fā)性大鼠肝癌模型實現(xiàn)了實驗鼠的100%成癌率和誘導(dǎo)過程中的零死亡率，相對傳統(tǒng)DEN誘癌方法更安全、高效．這可能與實驗誘癌過程中將傳統(tǒng)用藥質(zhì)量濃度從1 mg/mL降低為0．1 mg/mL并設(shè)立了誘癌間歇期有關(guān):低濃度DEN對動物刺激性更低，而間歇期給了大鼠肝臟一定時間的休息和代償增生;但正是間歇期肝細(xì)胞對損傷修復(fù)的加強(qiáng)，使基因突變平穩(wěn)積累、加劇，伴隨肝硬化和肝臟炎癥反應(yīng)不斷進(jìn)展，促進(jìn)了DEN誘癌過程中肝細(xì)胞的癌變，最終有效降低了動物的死亡率并提高了成癌率．經(jīng)MRI和HE染色證明DEN誘發(fā)癌與自然肝癌組織的形成和病理特征較為接近，腫瘤微環(huán)境也比較相似，所以該肝癌模型比皮下成瘤模型、肝臟原位接種腫瘤模型對肝癌靶向性糖修飾熒光膠束的評價更有臨床參考價值．成像結(jié)果證明4種糖修飾熒光膠束主要聚集在肝臟組織，其中RST@ P－Gal熒光成像擁有腫瘤靶向性強(qiáng)、背景信號低等優(yōu)點(diǎn)，這對肝癌的早期診斷和術(shù)中微小病灶的清除將帶來一定的幫助．

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Imaging of Primary Hepatocellular Carcinoma with Glycosylated Micelles in a Rat Model

LIU Da1，ZHANG Kang1，WU Xuanjun2，HAN Shoufa2*，LIU Pingguo1*

( 1．Medical College，Xiamen University，Xiamen 361102，China; 2．College of Chemistry and Chemical Engineering，Xiamen University，Xiamen 361005，China)

Abstract:The tumor microenvironment and pathological conditions of animal xenograft tumor models employed for surgerical evaluation are significantly different from those of the primary hepatocellular carcinoma models．As such，diethylnitrosamine ( DEN)－induced primary hepatocellular carcinoma models are superior to evaluate the efficacy of tumor targeting drugs compared to xenograft tumor models．Herein，we report the development of an improved method for DEN－induced tumor in mice with 100% cancer rate and zero mortality．We have evaluated the fluorogenic micelles consisting of cores of rhodamine－sultam ( RST) and a corona of poly［styrene－alter－( maleic acid)］glycosylated with glucosamine，galactosamine or mannosamine in the primary tumor model．The results have revealed that the galactosylated micelles ( RST@ PGal) can detect the tumor foci with diameters of 0．5－5 mm．The high tumor to background fluorescence ratio and high tumor－targeting displayed by RST@ P－Gal have validated its utility for diagnosis of early hepatocellular carcinoma in an intraoperative setting．

Key words:primary hepatocellular carcinoma; fluorescence imaging; diethylnitrosamine( DEN) ; glyco－micelles

*通信作者:pgliu@ xmu．edu．cn

基金項目:國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃( 973計劃) ( 2013CB93390) ;國家自然科學(xué)基金( 21272196，21072162)

收稿日期:2015－03－30錄用日期: 2015－05－11

doi:10．6043/j．issn．0438－0479．2016．01．005

中圖分類號:Q 599

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:0438－0479( 2016) 01－0016－06

引文格式:劉達(dá)，張康，吳選俊，等．基于原發(fā)性大鼠肝癌模型的糖修飾熒光膠束腫瘤成像診斷評價［J］．廈門大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2016，55( 1) : 16－21．

Citation: LIU D，ZHANG K，WU X J，et al．Imaging of primary hepatocellular carcinoma with glycosylated micelles in a rat model［J］．Journal of Xiamen University( Natural Science)，2016，55( 1) : 16－21．( in Chinese)