鱷膽素與阿霉素聯合應用對肝癌SMMC-7721細胞凋亡的影響

丁玉梅，翁夢婷，毛云子，董　欣，鄧軼韜，陳清西

(廈門大學生命科學學院，福建廈門361102)

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鱷膽素與阿霉素聯合應用對肝癌SMMC-7721細胞凋亡的影響

丁玉梅，翁夢婷，毛云子，董欣，鄧軼韜，陳清西*

(廈門大學生命科學學院，福建廈門361102)

摘要:研究了鱷膽素( crocodile choline，Cro)聯合阿霉素( doxorubicin，Dox)對人肝癌細胞SMMC－7721凋亡的誘導作用．用鱷膽素( 15 μg/mL)和阿霉素( 0．4 μg/mL)單獨或聯合作用SMMC－7721細胞后，測定了培養基中乳酸脫氫酶( LDH)的滲漏率，吖啶橙/溴化乙錠( AO/EB)熒光染色觀察細胞的凋亡形態，流式細胞儀檢測細胞內活性氧( ROS)水平和細胞線粒體膜電位變化，免疫印跡( Western blot)檢測凋亡相關蛋白細胞色素C( CytC)及p53的表達量變化．結果(圖3)顯示鱷膽素和阿霉素單獨或者聯合作用都能促進細胞中LDH的滲漏，與對照組相比，聯合作用組有極顯著差異( p＜0．01)，其作用呈時間依賴性．經藥物處理后，AO/EB熒光染色發現細胞核出現明顯的凋亡特征．細胞中ROS水平顯著升高，同時細胞線粒體膜電位降低．Western blot結果顯示單獨用藥組及聯合用藥組都能上調促凋亡蛋白p53的表達，促進凋亡蛋白CytC由線粒體釋放到胞質中，聯合用藥組作用效果更為顯著．以上結果表明鱷膽素和阿霉素單獨或聯合作用都對人肝癌SMMC－7721細胞凋亡有誘導作用，且以聯合用藥組作用效果更加顯著．兩藥聯合作用可能通過線粒體介導的內源性途徑誘導細胞發生凋亡．本研究有望為肝癌的聯合用藥治療提供理論依據．

關鍵詞:鱷膽素;阿霉素;聯合用藥;肝癌;細胞凋亡;線粒體途徑

肝癌是人類常見惡性腫瘤之一，在惡性腫瘤發病中男性居第5位，女性居第7位;致死率居惡性腫瘤第3位，僅次于肺癌和胃癌［1］．乙肝是肝癌的主要誘因之一，且每年的肝癌患者數均有增加［2］．手術切除仍是提高肝癌患者生存率的主要方法，但多數患者會出現術后復發、轉移等，需要使用全身化療法輔助治療［3－4］．化療是一種全身性治療方法，對原發灶、轉移灶均有治療作用．阿霉素是臨床肝癌的常用化療藥物，單藥有效率能達到16%［5］，但同多數化療藥物一樣選擇性差，對正常細胞有殺傷作用，毒副作用很強，容易產生耐受性，在臨床應用中受到了一定的限制．因此，尋求新的更有效的肝癌治療方法和抗肝癌藥物組方是現在醫藥界面臨的重要挑戰．本實驗室前期研究［6］發現鱷膽素、阿霉素單獨使用對人肝癌SMMC－7721細胞增殖有明顯的抑制作用，兩者聯合使用有協同效果．鱷膽素( 15 μg/mL)與阿霉素( 0．4 μg/mL)聯合使用不僅能抑制肝癌SMMC－7721細胞的增殖及細胞的集落形成能力，還能使細胞周期發生S期阻滯，誘導細胞凋亡．本研究擬以肝癌SMMC－7721細胞為研究對象，用篩選得到具有協同作用的鱷膽素和阿霉素聯合組方作用于SMMC－7721細胞，探討兩者聯合作用誘導肝癌細胞凋亡的可能分子機理．

1材料與方法

1. 1材料

鱷膽素為本實驗室從暹羅鱷膽汁中經皂化、酸化、萃取等步驟提取分離得到的白色粉末，是多種膽汁酸的混合物，－20℃避光保存，臨用前加入二甲亞砜( DMSO)溶解，0．22 μm微孔濾膜過濾除菌．阿霉素購自上海生工生物工程有限公司; RPMI－1640培養基購自Gibco公司;胎牛血清購自Hyclone公司;熒光探針2'，7'－二氯熒光素二乙酸酯( DCFH－DA)和熒光染料羅丹明123( Rh123)購自Sigma公司;吖啶橙( AO)和溴化乙錠( EB)購自Amresco公司;人肝癌SMMC－7721細胞由廈門華僑亞熱帶植物引種園惠贈．

1. 2實驗方法

1. 2. 1細胞培養及分組

肝癌SMMC－7721細胞在含10%(體積分數)胎牛血清、1%(體積分數)雙抗( 100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)的RPMI－1640培養基( pH 7．2)上，37℃，5%(體積分數) CO2中培養．本實驗室前期研究已篩選出鱷膽素與阿霉素聯合使用具有協同作用的組方，為15 μg/mL鱷膽素+0．4 μg/mL阿霉素［6］，因此本實驗分為對照組、鱷膽素單用藥組( 15 μg/mL)、阿霉素單用藥組( 0．4 μg/mL)和聯合用藥組( 15 μg/mL鱷膽素+0．4 μg/mL阿霉素)．

1. 2. 2普通光鏡下觀察細胞形態

取對數生長期的肝癌SMMC－7721細胞接種于6孔板中培養過夜，加入藥物處理48 h后，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態．

1. 2. 3乳酸脫氫酶( LDH)活力測定

用藥物分別處理SMMC－7721細胞24和48 h后，取培養液上清按照LDH試劑盒(南京建成生物技術有限公司)說明書進行操作并在450 nm處測定吸光度( OD)．酶活力單位的定義:每100 mL待測樣品中的LDH在37℃與底物2，4－二硝基苯肼作用15 min，生成1 μmol丙酮酸即為一個LDH活力單位．細胞活力以培養基中LDH的酶活大小表示，LDH酶活越高表明細胞受損越嚴重，細胞活力越差．

1. 2. 4 AO/EB熒光染色

取對數生長期的肝癌SMMC－7721細胞接種于含多聚賴氨酸處理過的蓋玻片的6孔板中，細胞貼壁后加入藥物處理48 h．取長有細胞的爬片，磷酸鹽緩沖液( PBS)清洗3次，固定10 min; PBS再洗3次，滴加等體積預混的AO/EB染液(質量濃度均為10 μg/mL)，室溫避光孵育10 min，PBS洗3次后，晾干，封片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照．

1. 2. 5細胞內活性氧( ROS)水平的測定

將培養至對數生長期的肝癌SMMC－7721細胞接種于直徑60 mm的培養皿中，細胞貼壁后加入藥物處理48 h．離心( 800 r/min，5 min，下同)收集貼壁和懸浮細胞，PBS洗滌，再次離心，棄上清．加入終濃度為10 μmol/L的DCFH－DA完全培養液重懸細胞，37℃避光孵育30 min，離心，棄上清;再加入1 mL PBS洗滌，離心后吸去上清;加入1 mL PBS重懸細胞，300目篩絹過濾，Fortessa型流式細胞儀檢測，Flowjo－V10軟件進行數據分析．

1. 2. 6線粒體膜電位的改變

取對數生長期的肝癌SMMC－7721細胞接種于6孔板中，細胞貼壁后加入藥物作用48 h．培養結束后PBS洗2次，滴加1 mg/mL Rh123染液，室溫避光孵育5～10 min，PBS洗滌，在倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照．

1. 2. 7免疫印跡( Western blot)檢測

取對數生長期的肝癌SMMC－7721細胞，經藥物處理48 h后，收集貼壁和懸浮的所有細胞，加入預冷的細胞裂解液和蛋白酶抑制劑，混勻后于冰上裂解30 min;低溫高速離心( 4℃，10 000 r/min，10 min)，取上清，用BCA蛋白濃度測定試劑盒(生工生物工程股份有限公司)測定總蛋白濃度．

每管加入適量5×上樣緩沖液，沸水中煮沸5 min使蛋白變性，取等量蛋白樣品進行電泳．然后轉聚偏氟乙烯( PVDF)膜，5%(質量分數)脫脂牛奶封閉1 h; TBST( 10 mmol/L Tris－HCl ( pH 7．2)，150 mmol/L NaCl，0．05%(體積分數) Tween 20)緩沖液洗膜3次，每次10 min，一抗孵育過夜;相同方法洗膜后，加入辣根過氧化物酶( HRP)標記的二抗孵育1 h;再洗膜后滴加化學發光底物于PVDF膜上，在暗室中進行膠片曝光、顯影和定影．

2結果與分析

2. 1鱷膽素與阿霉素聯用對細胞形態的影響

鱷膽素與阿霉素單獨或聯合作用SMMC－7721細胞48 h后，普通倒置光學顯微鏡觀察結果如圖1所示:對照組細胞呈梭形、不規則多邊形，細胞生長均勻飽滿;鱷膽素單用藥組貼壁細胞數量減少，細胞形態變得不規則，半數細胞變成長梭形，部分細胞變圓;阿霉素單用藥組貼壁細胞數量大量減少，細胞呈單個生長，說明細胞的增殖受到了比較明顯的抑制，且細胞內顆粒、空泡明顯增多;聯合用藥組幾乎沒有細胞保持正常形態，多數細胞皺縮、變圓、體積縮小，有較多細胞從皿壁脫落，懸浮于培養液中．用藥組與對照組相比細胞形態都有明顯變化，并且聯合用藥組更為顯著，說明鱷膽素和阿霉素聯合具有協同作用．

圖1普通光鏡下觀察鱷膽素與阿霉素單獨或聯合作用后SMMC－7721細胞的形態學變化Fig．1 Effect of Cro with or without Dox on the morphologic changes of SMMC－7721 cells under ordinary optical microscope

2. 2鱷膽素與阿霉素聯用對細胞LDH滲漏的影響

LDH存在于正常細胞的細胞質中，是機體能量代謝中的一種重要的酶．一旦細胞膜受損，LDH被釋放到細胞外．通過檢測細胞培養基上清中LDH活性，可以判斷細胞受損程度．

LDH活性測定結果如圖2所示:藥物作用24 h后，與對照組相比，阿霉素單用藥組的LDH活性無明顯改變，鱷膽素單用藥組出現了顯著差異( p＜0．05)，而聯合用藥組出現了極顯著性差異( p＜0．01)，酶活比對照組高132．75%; 48 h后聯合用藥組與對照組相比差異也極顯著( p＜0．01)，LDH酶活比對照組增加了112．04%．由此可以看出，聯合用藥組能顯著增加由于細胞損傷引起的LDH滲漏．

2. 3 AO/EB染色觀察細胞凋亡

GLONASS L1OC信號采用短時相關結合FFT算法實現捕獲，捕獲的結構圖如圖5所示。該捕獲結構采用N個短時相關支路來實現時域的并行，圖中虛線所示。

AO和EB是兩種不同的熒光核酸染料: AO能透過細胞膜完整的細胞，嵌入細胞核DNA，使之發出明亮的綠色熒光; EB只能透過細胞膜破損的細胞，與細胞核DNA結合，發出橘紅色熒光．

圖2鱷膽素與阿霉素單獨或聯合作用對SMMC－7721細胞中LDH滲漏的影響Fig．2 Effect of Cro with or without Dox on the releasing of LDH in SMMC－7721 cells

鱷膽素與阿霉素單獨或聯合作用SMMC－7721細胞48 h后，經AO/EB雙染色觀察，結果(圖3)顯示:對照組細胞呈均勻的綠色熒光;鱷膽素單用藥組細胞核固縮，部分細胞核可見致密濃染的橙黃色熒光;阿霉素單用藥組細胞形態略變圓，邊緣不清晰，部分細胞核染色發出橙色至橘紅色熒光;聯合用藥組細胞密度急劇減少，發橙色、橘紅色熒光，凋亡特征十分明顯．以上結果表明，鱷膽素和阿霉素都能誘導細胞凋亡，而兩藥聯合作用效果顯著高于單用藥．

2. 4細胞內ROS的變化

熒光探針DCFH－DA本身沒有熒光，可以自由穿過細胞膜，進入細胞內后，可以被細胞內的酯酶水解生成2'，7'－二氯熒光素雙酚( DCFH) ; DCFH不能透過細胞膜，從而使探針很容易被裝載到細胞內．細胞內的ROS可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的二氯熒光素( DCF)，檢測DCF的熒光強度就可以反映細胞內ROS的水平．

鱷膽素和阿霉素單獨或聯合作用SMMC－7721細胞24 h后，對細胞進行DCFH－DA熒光染色．流式細胞儀檢測結果(圖4)表明:阿霉素單用藥組中ROS水平升高的細胞比例( P2)增加;兩藥聯合后增加更為顯著，與對照組相比，聯合用藥組P2增加了4．5倍．以上結果表明鱷膽素與阿霉素聯合作用誘導肝癌細胞的凋亡可能與細胞內ROS的積累有關．

2. 5線粒體膜電位的改變

Rh123是一種可透過細胞膜的陽離子熒光染料，可以指示線粒體跨膜電位．Rh123在正常細胞中能夠依賴線粒體膜電位進入線粒體基質，熒光強度減弱或粒體膜通透性改變，引起線粒體跨膜電位的崩潰，Rh123從線粒體中被重新釋放出來，繼而發出強黃綠色熒光．因此，可通過檢測細胞內熒光信號的強弱來判斷細胞線粒體膜電位的變化和凋亡的發生．

圖3 AO/EB染色觀察鱷膽素與阿霉素單獨或聯合作用后SMMC－7721細胞的凋亡情況Fig．3 Effect of Cro with or without Dox on the apoptosis changes of SMMC－7721 cells by staining with AO/EB

圖4鱷膽素與阿霉素單獨或聯合作用對SMMC－7721細胞內ROS水平的影響Fig．4 Effects of Cro with or without Dox on the ROS level in SMMC－7721 cells

消失;在細胞發生凋亡時，線粒體膜完整性被破壞，線

肝癌細胞經藥物處理24 h后，Rh123染色，在熒光顯微鏡下觀察，結果(圖5)發現:對照組細胞線粒體分布均勻，形態一致，發出弱的綠色熒光;鱷膽素單用藥組細胞數量減少，少數細胞線粒體發出強的黃綠色熒光，說明細胞可能正在經歷線粒體膜電位的改變;阿霉素單用藥組的細胞，線粒體形態改變較大，多分布在核周，呈團塊狀，發出強的黃綠色熒光;聯合用藥組的細胞線粒體分布與阿霉素單用藥組類似，但是數量明顯稀少．上述現象說明兩藥聯合作用對細胞線粒體損傷程度最大，對線粒體膜電位的影響遠超于單用藥，具有協同作用．

圖5 Rh123染色觀察鱷膽素與阿霉素單獨或聯合作用對SMMC－7721細胞線粒體跨膜電位的影響Fig．5 Changes of membrane potential of mitochondrion after treated with Cro with or without Dox for 24 h by staining with Rh123

2. 6凋亡相關蛋白p53和細胞色素C( CytC)表達的變化

p53基因是一類重要的腫瘤抑制基因，在細胞凋亡進程中發揮著重要作用．大量研究［7－8］表明p53蛋白既能促進促凋亡因子轉錄，也能抑制抗凋亡因子轉錄．還有研究發現p53蛋白表達增加能使細胞內ROS水平升高，從而導致線粒體通路介導的細胞凋亡［9］．線粒體中CytC的釋放是細胞凋亡過程中的關鍵步驟．線粒體膜通透性增高能引發CytC的釋放，同時Bcl－2蛋白家族對其釋放也有調控作用．因此，本研究進而探討以上諸多因素改變后對SMMC－7721細胞中p53、CytC蛋白表達的影響．

Western blot檢測結果如圖6所示:對照組細胞質中有少量CytC蛋白;鱷膽素單用藥組中，CytC蛋白的釋放量有所增加;阿霉素單用藥組中，CytC蛋白的釋放量大量增加，與對照組相比差異顯著;兩藥聯合組中，釋放到細胞質中的CytC蛋白量也顯著增加，較單用藥組更為明顯．p53蛋白在對照組中幾乎沒有表達;鱷膽素單用藥組中有少量的p53蛋白;阿霉素單用藥組中，p53蛋白表達量增加;兩藥聯合組中，p53蛋白表達量較單用藥組有顯著增加．上述結果與線粒體膜電位變化的結果一致．

圖6鱷膽素與阿霉素單獨或聯合作用對SMMC－7721細胞中p53、CytC蛋白表達的影響Fig．6 The effect of Cro with or without Doxon the protein levels of p53 and CytC

3討論

肝癌是一種常見的惡性腫瘤，發病率高，治療困難．早期肝癌比較有效的治療方法是手術治療，但由于肝癌早期癥狀不明顯，當患者發現患病時已到中晚期，錯過了最佳治療時機．化療在肝癌的治療中占有非常重要的地位．聯合化療是采用兩種或兩種以上的化療藥物聯合使用，目的在于增強療效，降低毒副反應及耐藥性［10］．本實驗室前期研究［6］發現，鱷膽素與阿霉素聯合作用對肝癌SMMC－7721細胞增殖有較強的抑制作用，同時能使細胞周期發生S期阻滯．在此基礎上，本文探討了鱷膽素與阿霉素聯合作用對SMMC－7721細胞凋亡的影響及可能的分子機制．

鱷膽素、阿霉素單獨或聯合處理后，細胞形態發生明顯變化．AO/EB熒光染色觀察發現藥物處理后部分細胞發橘紅色熒光，展現出明顯的凋亡特征，且聯合用藥組效果更顯著;細胞LDH的滲漏經聯合藥物處理大幅增加，表明細胞受到損傷．

線粒體是細胞能量代謝的中心，細胞凋亡會導致其正常功能的喪失．ROS是生物代謝過程中產生的一類性質活潑的物質，能導致蛋白質、DNA等氧化損傷，誘發細胞凋亡．細胞內ROS的累積可導致線粒體膨大，達到一定水平將激活線粒體上非特異性的通透轉運孔道( PTP)開放，使線粒體跨膜電位降低，CytC從內膜脫落并釋放到細胞質中［11］．CytC的釋放是線粒體凋亡路徑的主要步驟，在dATP/ATP存在的情況下，從線粒體釋放的CytC與凋亡蛋白酶活化因子Apaf1形成多聚復合體，激活Caspase級聯反應，進入線粒體介導的內源性凋亡途徑［12］．流式細胞儀檢測細胞內ROS水平結果發現，鱷膽素與阿霉素聯合作用于SMMC－7721細胞后，能顯著升高細胞內的ROS水平;同時采用Rh123染色，發現聯合用藥能降低線粒體膜電位．由此推測，鱷膽素與阿霉素聯合用藥能對SMMC－7721細胞產生氧化損傷，使線粒體膜通透性改變，發生線粒體膜電位崩潰，以致凋亡因子CytC釋放到胞質中，啟動細胞凋亡程序．

研究發現定位于線粒體上的轉錄因子p53能與Bcl－2家族蛋白Bax直接相互作用，兩者結合產生促凋亡的結構構象;另外這種相互作用還能引起Bax的多聚化，導致線粒體通透性改變，使促凋亡因子(如CytC)釋放到細胞質中［13］．鱷膽素與阿霉素聯合用藥能顯著上調p53蛋白和Bax蛋白［6］的表達，可能加速CytC釋放，進而加速細胞凋亡．

綜上結果，鱷膽素與阿霉素聯合作用誘導肝癌SMMC－7721細胞凋亡，可能是通過線粒體介導的內源性途徑發揮作用．在外界條件(如藥物)刺激下，細胞內ROS水平升高，線粒體膜電位降低，導致線粒體膜通透性改變，凋亡信號蛋白CytC釋放到胞質中，引發細胞凋亡．本論文研究結果有望為臨床肝癌藥物聯合治療提供理論支持．

參考文獻:

［1］FERENCI P，FRIED M，LABRECQUE D，et al．Hepatocellular carcinoma ( HCC) : a global perspective ［J］．Journal of Clinical Gastroenterology，2010，44 ( 4) : 239－245．

［2］JEMAL A，BRAY F，CENTER M M，et al．Global cancer statistics［J］．CA: A Cancer Journal for Clinicians，2011，61 ( 2) : 69－90．

［3］HAO M，LIN H，CHEN Q，et al．Efficacy of transcatheter arterial chemoembolization combined with cytokine－induced killer cell therapy on hepatocellular carcinoma: a compar－ative study［J］．Chinese Journal of Cancer，2010，29 ( 2) : 172－177．

［4］LAM V W，SPIRO C，LAURENCE J M，et al．A systematic review of clinical response and survival outcomes of downsizing systemic chemotherapy and rescue liver surgery in patients with initially unresectable colorectal liver metastases［J］．Annals of Surgical Oncology，2012，19( 4) : 1292－1301．

［5］SCHWARTZ J D，BEUTLER A S．Therapy for unresectable hepatocellular carcinoma: review of the randomized clinical trials－Ⅱ: systemic and local non－embolizationbased therapies in unresectable and advanced hepatocellular carcinoma［J］．Anti－cancer Drugs，2004，15 ( 5) : 439－452．

［6］鄧軼韜，丁玉梅，李華亮，等．鱷膽素聯合阿霉素對人肝癌細胞SMMC－7721的抑制作用［J］．廈門大學學報(自然科學版)，2015，54( 6) : 796－801．

［7］SUGAR K L，BUDHRAM－MAHADEO V，PACKHAM G，et al．A minimal Bcl-x promoter is activated by Brn－3a and repressed by p53［J］．Nucleic Acids Research，2001，29 ( 22) : 4530－4540．

［8］WILLIS S N，ADAMS J M．Life in the balance: how BH3－ only proteins induce apoptosis［J］．Current Opinion in Cell Biology，2005，17( 6) : 617－625．

［9］LIU B，CHEN Y，CLAIR D K S．ROS and p53: a versatile partnership［J］．Free Radical Biology and Medicine，2008，44( 8) : 1529－1535．

［10］YEO W，MOK T S，ZEE B，et al．A randomized phaseⅢstudy of doxorubicin versus cisplatin/interferon α－2b/doxorubicin/fluorouracil ( PIAF) combination chemotherapy for unresectable hepatocellular carcinoma［J］．Journal of the National Cancer Institute，2005，97 ( 20) : 1532－1538．

［11］ATLANTE A，CALISSANO P，BOBBA A，et al．Cytochrome c is released from mitochondria in a reactive oxygen species ( ROS)－dependent fashion and can operate as a ROS scavenger and as a respiratory substrate in cerebellar neurons undergoing excitotoxic death［J］．Journal of Biological Chemistry，2000，275( 47) : 37159－37166．

［12］SPIERINGS D，MCSTAY G，SALEH M，et al．Connected to death: the ( unexpurgated) mitochondrial pathway of apoptosis［J］．Science，2005，310 ( 5745) : 66－67．

［13］周桔，羅榮保，湯長發，等．Bcl－2蛋白家族和p53基因在細胞凋亡中的調控效應［J］．中國組織工程研究與臨床康復，2007，11( 10) : 1950－1952．

Effect of Crocodile Choline Combined with Doxorubicin on Apoptosis of Human Hepatocellular Carcinoma Cells SMMC-7721

DING Yumei，WENG Mengting，MAO Yunzi，DONG Xin，DENG Yitao，CHEN Qingxi*

( School of Life Sciences，Xiamen University，Xiamen 361102，China)

Abstract:In this paper，we studied the effect of crocodile choline combined with doxorubicin on apoptosis of human hepatocellular carcinoma cells SMMC－7721．SMMC－7721 cells were treated with crocodile choline( 15 μg/mL) alone or combined with doxorubicin( 0．4 μg/mL)，followed by LDH release assay，AO/EB staining，flow cytometry analysis and Western blot to detect relative indicators．The results showed that crocodile choline with or without doxorubicin could promote the releasing of LDH in SMMC－7721 cells，and there were very significant difference ( p＜0．01) between combined group and control group．SMMC－7721 cells exhibited obvious characteristics of apoptosis by AO/EB staining．We found that the level of ROS was markedly increased and much higher than control group when different drugs were used to treat the SMMC－7721 cells．Western blot results showed that crocodile choline with doxorubicin up－regulated expression of CytC and p53 protein in SMMC－7721 cells．Taking together，these results showed that crocodile choline alone or combined with doxorubicin could induce SMMC－7721 cells apoptosis，and the combination group showed better talents．This study suggests that mitochondrial－dependent signal transduction pathways are involved in crocodile choline with doxorubicin－induced SMMC－7721 cells apoptosis，supplying theoretical support for the treatment of human hepatocellular carcinoma on drug combination．

Key words:crocodile choline; doxorubicin; drug combination; hepatocellular carcinoma; apoptosis; mitochondrial pathway

*通信作者:chenqx@ xmu．edu．cn

基金項目:廈門市科技計劃項目( 3502Z20133009) ;廈門大學基礎科學人才培養基金( J1310027)

收稿日期:2015－04－22錄用日期: 2015－06－12

doi:10．6043/j．issn．0438－0479．2016．01．013

中圖分類號:Q 356．1

文獻標志碼:A

文章編號:0438－0479( 2016) 01－0072－06

引文格式:丁玉梅，翁夢婷，毛云子，等．鱷膽素與阿霉素聯合應用對肝癌SMMC－7721細胞凋亡的影響［J］．廈門大學學報(自然科學版)，2016，55( 1) : 72－77．

Citation: DING Y M，WENG M T，MAO Y Z，et al．Effect of crocodile choline combined with doxorubicin on apoptosis of human hepatocellular carcinoma cells SMMC－7721［J］．Journal of Xiamen University( Natural Science)，2016，55( 1) : 72－77．( in Chinese)