熒光報告系統(tǒng)驗證miR-142-5p的靶基因Becn1

阮　杰　黃池榮　劉桂平　梁國輝　張　健　劉新光

(廣東醫(yī)學院衰老研究所，廣東　東莞　523808)

?

熒光報告系統(tǒng)驗證miR-142-5p的靶基因Becn1

阮杰1,2黃池榮1劉桂平1梁國輝1張健1劉新光1,2

(廣東醫(yī)學院衰老研究所，廣東東莞523808)

〔摘要〕目的驗證miR-142-5p的靶基因——自噬相關基因Becn1。方法生物信息學預測miR-142-5p與Becn1的結合位點，構建含有結合位點的Becn1基因3'UTR野生型和突變型質粒，將重組質粒與miR-142-5p-mimics或miR-NC共轉染C2C12細胞，檢測熒光素酶活性。結果miR-142-5p與Becn1的3'UTR存在一個結合位點(123～129)；成功構建野生型重組質粒pGL3-Becn1-3'UTR和靶位點含3個堿基突變的重組質粒Mut-3'UTR；與共轉染pGL3-Becn1-3'UTR和miR-NC組相比，共轉染pGL3-Becn1-3'UTR和miR-142-5p-mimics組熒光素酶活性顯著下降，約為41.2%(P<0.01)；而與對照組相比，共轉染Mut-3'UTR和miR-142-5p-mimics組的熒光素酶活性下降不明顯(P>0.05)。結論初步驗證自噬相關基因Becn1是miR-142-5p的靶基因。

〔關鍵詞〕miR-142-5p；MicroRNA；Becn1基因；3'非編碼區(qū)(3'UTR)；熒光素酶報告質粒

MicroRNAs(miRNAs)通過識別靶mRNA的3'UTR 區(qū)，降解靶基因或抑制其翻譯，從而抑制蛋白質的合成，達到調控基因表達的目的〔1,2〕。雙熒光素酶檢測是目前判定miRNA是否與靶基因3'UTR結合的基本實驗方法。miR-142前體經(jīng)加工可產(chǎn)生成熟的兩個miRNA，分別為miR-142-5p和miR-142-3p，成熟miR-142-5p的堿基序列為5'-CAUAAAGUAGAAAGCACUACU-3'，在物種間具有高度的保守性，在多種腫瘤、免疫相關疾病和胚胎干細胞中均發(fā)揮了重要作用〔3〕，并可作為診斷慢性抗體介導排斥反應(CAMR)的生物標記〔4〕。近年來研究表明，miR-142-5p與衰老相關，其在衰老的骨髓源性樹突細胞(BMDC)中高表達〔5〕，而在殘粒脂蛋白誘導的衰老人內(nèi)皮祖細胞〔6〕和衰老過程中人血清中均表達降低〔7〕。本課題組前期從衰老模型Lmna(核纖層蛋白A/C的編碼基因)缺失型MEFs中篩選出與野生型胚胎成纖維細胞(MEFs)差異表達miRNA之一：miR-142-5p。本研究利用熒光報告系統(tǒng)對miR-142-5p的預測靶基因Becn1進行驗證。

1 材料與方法

1.1實驗材料熒光素報告基因載體(PGL3)雙熒光報告質粒、大腸桿菌(DH5α)與小鼠成肌細胞(C2C12)由廣東醫(yī)學院衰老研究所保存。高保真PrimeStar-Taq酶、T4 DNA 連接酶、限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和EcoRⅠ購自Takara 公司。PCR產(chǎn)物純化試劑盒和質粒DNA小量提取試劑盒購自Axygen公司。Dual-Luciferase?Reporter Assay System檢測試劑盒購自Promega公司(美國)，轉染試劑LipofectamineTM 2000購自Invitrogen 公司。DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清來源于Gibco 公司，miR-142-5p mimics 及miR-negative control(miR-NC)為上海吉瑪生物技術有限公司合成，單管型多功能熒光計為德國Berthold公司生產(chǎn)。

1.2方法

1.2.1靶基因熒光素酶報告載體的構建及突變載體構建通過TargetScan等網(wǎng)站在線分析miR-142-5p與Becn1的結合位點，從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得候選基因Becn1的3'UTR 堿基序列(基因號：NM_019584.3)，通過Premier5.0軟件設計Becn1基因3'UTR 區(qū)涵蓋miR-142-5p作用位點的引物及突變引物，見表1。Becn1-3'UTR-PF和Becn1-3'UTR-PR中下劃直線為酶切位點EcoRⅠ(GAATTC)和XbaⅠ(TCTAGA)，之前序列為保護堿基，所擴增的PCR產(chǎn)物長度為525 bp；突變引物Becn1-MUT-PF和Becn1-MUT-PR中斜體加下劃波浪線為結合位點的3個突變堿基，引物由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。

表1　Becn1基因3′UTR引物

以C2C12細胞的cDNA為模板，通過PCR法合成Becn1基因3′UTR序列目的片段，經(jīng)內(nèi)切酶XbaⅠ、EcoRⅠ雙酶切及純化，并通過T4 DNA 連接酶與線性化的pGL3雙熒光素酶報告空載體連接，然后將連接產(chǎn)物用氯化鈣法轉化至感受態(tài)大腸埃希菌DH5α中，經(jīng)氨芐青霉素篩選陽性克隆，提取質粒進行(EcoRⅠ/Xba Ⅰ)雙酶切鑒定，并送上海立菲生物技術有限公司測序，鑒定正確后的質粒命名為pGL3-Becn1-3′UTR。

利用重疊延伸聚合酶鏈反應(PCR)技術經(jīng)3輪PCR構建結合位點中含3個堿基突變的Becn1基因3′UTR突變片段，見圖1。第一輪：以C2C12細胞的cDNA為模板，Becn1-3′UTR-PF和Becn1-3′UTR-PR為引物，擴增Becn1的野生型3′UTR片段。第二輪：以Becn1的野生型3′UTR片段為模板，分別以Becn1-3′UTR-PF和Becn1-MUT-PR、Becn1-MUT-PF和Becn1-3′UTR-PR為引物，擴增Becn1的基因片段F1、F2。第三輪：以F1、F2片段為模板，Becn1-3′UTR-PF和Becn1-3′UTR-PR為引物，拼接成Becn1突變的3'UTR基因片段。將Becn1基因突變的3′UTR片段連接到pGL3載體質粒構建成重組突變載體，經(jīng)雙酶切及送測序鑒定正確后，重組突變載體命名為pGL3-Becn1-mut-3′UTR，簡稱Mut-3′UTR。

XXX為3個突變堿基圖1　重疊延伸PCR 定點突變Becn1基因3′UTR示意圖

1.2.2雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測分析 37℃ 5%的CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)C2C12細胞，以每孔2×104個細胞接種于48孔板中，每孔總體積250 μl，細胞生長至對數(shù)生長期時，取150 μl OPTI-MEM培養(yǎng)基稀釋miR-142-5p或陰性對照mimics，Becn1基因3'UTR雙熒光報告基因質粒或突變體和內(nèi)參pRL-TK，100 μl OPTI-MEM培養(yǎng)基稀釋LipofectamineTM2000試劑，5 min后三者混合，共250 μl，輕輕搖勻，靜置20 min形成轉染復合物，加到細胞培養(yǎng)板各孔中。Mimics microRNA轉染濃度均為40 nmol/L，pGL3質粒濃度為200 ng/孔，內(nèi)參pRL-TK濃度為20 ng/孔，每組設3個復孔。6 h后換含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。轉染24 h后裂解細胞，按雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)試劑說明書操作，檢測熒光素酶的活性。

1.3統(tǒng)計學方法應用SPSS16.0軟件行t檢驗。

2結果

2.1生物信息學分析mmu-miR-142-5p靶基因Targetscan軟件預測顯示，mmu-miR-142-5p與Becn1基因3'UTR有1個結合位點(123～129)，針對兩者相結合位點的靶序列我們設計了3個堿基的突變體，見圖2，命名為Mut1-3'UTR，圖中斜體表示突變位點。

圖2　mmu-miR-142-5p和Becn1 3′UTR的結合位點(斜體表示突變位點)

2.2pGL3-Becn1-3'UTR和Mut-3'UTR重組載體的構建及鑒定將PCR合成的Becn1基因野生型和突變型3'UTR序列分別構建到熒光素酶報告質粒載體pGL3中，轉化感受態(tài)DH5α，挑選陽性克隆，擴增后提取質粒DNA，經(jīng)雙酶切(EcoRⅠ/XbaⅠ)鑒定，見圖3，結果顯示pGL3-Becn1-3'UTR和Mut-3'UTR重組載體雙酶切均可見大小兩條帶，大片段與pGL3空載體片段(5 258 bp)等大小，小片段(525 bp)分別與PCR擴增的Becn1基因野生型或突變型3'UTR片段相符。

將重組載體送測序結果顯示：pGL3-Becn1-3′UTR重組載體的Becn1-3'UTR 序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫所提供的序列相同(見圖4A)。Mut-3'UTR突變體3'UTR片段插入方向正確，結合位點3個堿基TTT定點突變?yōu)镚GC，與理論相符，其余序列均與GenBank中Becn1的3'UTR序列一致(見圖4B)。因此，本實驗成功構建了Becn1基因3'UTR野生型熒光素酶報告載體pGL3-Becn1-3'UTR及突變載體Mut-3'UTR。

M：Trans2K plus ⅡDNA Marker；1：pGL3-Becn1-3'UTR雙酶切產(chǎn)物；2：Mut-3'UTR雙酶切產(chǎn)物；3：pGL3空載質粒雙酶切產(chǎn)物；4：pGL3-Becn1-3'UTR質粒PCR產(chǎn)物；5：Mut-3'UTR質粒PCR產(chǎn)物圖3　重組質粒雙酶切鑒定結果

圖4　重組質粒測序結果部分圖譜

2.3轉染重組質粒細胞熒光素酶表達的檢測結果將構建好的野生型pGL3-Becn1-3′UTR重組質粒和靶位點突變型Mut-3'UTR重組質粒分別與miR-142-5p-mimics或miR-NC共轉染小鼠C2C12細胞，檢測熒光素酶活性。雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測結果顯示：與共轉染pGL3-Becn1-3'UTR和miR-NC組相比，共轉染pGL3-Becn1-3'UTR和miR-142-5p-mimics組熒光素酶活性顯著下降，約為41.2%(P<0.01)，而與對照組相比，共轉染Mut-3'UTR和miR-142-5p-mimics組的熒光素酶活性下降不明顯(P>0.05)。

3討論

miRNA是一種長度約22個核苷酸左右的非編碼小分子RNA，是潛在的轉錄后調節(jié)因子，在大多數(shù)生理病理過程中起重要的調節(jié)作用，其中包括衰老〔1〕。本研究中的miR-142-5p是從衰老模型Lmna(核纖層蛋白A/C的編碼基因)缺失型和野生型MEFs中篩選出來的差異表達miRNA之一。Lmna基因具有突變位點較多的特點，且同一基因由于不同位點的突變可產(chǎn)生衰老、肌肉營養(yǎng)不良等十多種不同的疾病〔8〕。核纖層蛋白A/C缺失導致人胚肺成纖維細胞IMR-90生長停滯及衰老相關的標記增加，如β-半乳糖苷酶染色的藍染衰老細胞增多，CDK抑制劑p21和核小體PML表達增加〔9，10〕。研究表明，miR-142-5p可通過作用并下調靶基因B細胞易位基因3(BTG3)，誘導cyclin D1、cyclin D3、E2F3 等細胞周期調控蛋白的表達，進而促進血管平滑肌細胞的增殖〔11〕。Ding等〔3〕在研究系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者中發(fā)現(xiàn)，miR-142-5p和miR-142-3p可分別作用于靶基因CD84和SAP，并調節(jié)CD4+T細胞及B細胞活性，從而調節(jié)自身免疫。但miR-142-5p在衰老中的作用機制尚缺乏相關文獻報道。

通過TargetScan、miRDB、miRanda及Clip-seq四種數(shù)據(jù)庫對mmu-miR-142-5p的靶基因進行預測，自噬相關基因Beclin1(Becn1)是本實驗感興趣的候選靶基因，其3'UTR與miR-142-5p存在一個結合位點(123～129)，且兩者的相關性較高。Becn1基因位于人染色體17q21，與酵母atg6 /vps30同源，是重要的哺乳動物自噬特異性基因，其編碼的自噬蛋白Becn1是一個60 kD卷曲螺旋結構的蛋白〔12，13〕，有BH3、CCD和ECD三個重要的結構域，與PI3KⅢ/Vps34、Bcl-2蛋白家族、UVRAG結合形成復合體，發(fā)揮多種生物學作用，在胚胎形成、調節(jié)自噬活性、腫瘤抑制等方面發(fā)揮重要作用〔14〕。研究表明自噬與衰老有很大關系，衰老時細胞自噬降解效率下降及細胞內(nèi)廢物積累〔15〕。Becn1參與細胞凋亡、細胞自噬和炎癥小體激活，對衰老過程有重要影響。如基因毒性、代謝和環(huán)境損害等衰老相關因素，可增強核轉錄因子(NF)-κB驅動的抗凋亡Bcl-2蛋白的表達，使Becn1依賴的自噬受到抑制，從而增強衰老、引發(fā)腫瘤或細胞衰老〔16〕。也有研究表明Becn1對人類黃體細胞和卵巢雄激素分泌細胞的壽命有重要調節(jié)作用，維持自噬水平有利于黃體和卵巢雄激素分泌細胞的存活〔17〕。

綜上本文初步驗證了miR-142-5p靶作用于自噬相關基因Becn1，為進一步探討miR-142-5p及其靶基因Becn1在核纖層蛋白病模型Lmna缺失小鼠中發(fā)揮的作用奠定了實驗基礎。

4參考文獻

1Chen LH,Chiou GY,Chen YW,etal.MicroRNA and aging:a novel modulator in regulating the aging network〔J〕.Ageing Res Rev,2010;9(1):S59-66.

2Wu H,Neilson JR,Kumar P,etal.miRNA profiling of naive,effector and memory CD8 T cells〔J〕.PLoS One,2007;2(10):e1020.

3Ding S,Liang Y,Zhao M,etal.Decreased microRNA-142-3p/5p expression causes CD4+ T cell activation and B cell hyperstimulation in systemic lupus erythematosus〔J〕.Arthritis Rheum,2012;64(9):2953-63.

4Danger R,Paul C,Giral M,etal.Expression of miR-142-5p in peripheral blood mononuclear cells from renal transplant patients with chronic antibody-mediated rejection〔J〕.PLoS One,2013;8(4):e60702.

5Park S,Kang S,Min KH,etal.Age-associated changes in microRNA expression in bone marrow derived dendritic cells〔J〕.Immunol Invest,2013;42(3):179-90.

6Yang DG,Liu L,Zhou SH.MicroRNA alterations in senescent endothelial progenitor cells induced by remnant-like lipoproteins〔J〕.Chin Med J,2012;125(19):3479-84.

7Zhang H,Yang H,Zhang C,etal.Investigation of microRNA expression in human serum during the aging process〔J〕.J Gerontol A Biol Sci Med Sci,2015;70(1):102-9.

8Chojnowski A,Ong PF,Dreesen O.Nuclear lamina remodelling and its implications for human disease〔J〕.Cell Tissue Res,2015;360(3):621-31.

9Sullivan T,Escalante-Alcalde D,Bhatt H,etal.Loss of A-type lamin expression compromises nuclear envelope integrity leading to muscular dystrophy〔J〕.J Cell Biol,1999;147(5):913-20.

10Jahn D,Schramm S,Schnolzer M,etal.A truncated lamin A in the Lmna-/-mouse line:implications for the understanding of laminopathies〔J〕.Nucleus,2012;3(5):463-74.

11Moiseeva O,Bourdeau V,Vernier M,etal.Retinoblastoma-independent regulation of cell proliferation and senescence by the p53-p21 axis in lamin A/C depleted cells〔J〕.Aging Cell,2011;10(5):789-97.

12Kee HJ,Park S,Kwon JS,etal.B cell translocation gene,a direct target of miR-142-5p,inhibits vascular smooth muscle cell proliferation by down-regulating cell cycle progression〔J〕.FEBS Lett,2013;587(15):2385-92.

13Liang XH,Jackson S,Seaman M,etal.Induction of autophagy and inhibition of tumorigenesis by beclin 1〔J〕.Nature,1999;402(6762):672-6.

14Cao Y,Klionsky DJ.Physiological functions of Atg6/Beclin 1:a unique autophagy-related protein〔J〕.Cell Res,2007;17(10):839-49.

15Salminen A,Kaarniranta K.Regulation of the aging process by autophagy〔J〕.Trends Mol Med,2009;15(5):217-24.

16Salminen A,Kaarniranta K,Kauppinen A.Beclin 1 interactome controls the crosstalk between apoptosis,autophagy and inflammasome activation:impact on the aging process〔J〕.Ageing Res Rev,2013;12(2):520-34.

17Gaytan M,Morales C,Sanchez-Criado JE,etal.Immunolocalization of becn 1,a bcl-2-binding,autophagy-related protein,in the human ovary:possible relation to life span of corpus luteum〔J〕.Cell Tissue Res,2008;331(2):509-17.

〔2015-03-17修回〕

(編輯袁左鳴)

〔中圖分類號〕R34

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)06-1284-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.06.002

通訊作者：劉新光(1964-)，男，博士，教授，博士生導師，主要從事衰老與衰老相關疾病機制的研究。

基金項目：國家自然科學基金項目(No.81170327)；廣東省醫(yī)學科研基金(No.A2014470)；東莞市科技計劃項目與醫(yī)療衛(wèi)生一般項目(No.2012108102022，201410515200159)；廣東醫(yī)學院科研基金項目(No.XK1412,ZZDC006,ZZDC009,STIF201102)

1廣東醫(yī)學院醫(yī)學檢驗學院2廣東省醫(yī)學分子診斷重點實驗室

第一作者：阮杰(1972-)，女，博士，副教授，主要從事miRNA與衰老相關疾病機制的研究。