可溶性有機質生物改性介導17β-雌二醇生物降解作用

顧麗鵬,何 歡,胥志祥,熊 丹,劉 君,任 東,黃 斌,潘學軍 (昆明理工大學環境科學與工程學院,云南昆明 650500)

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可溶性有機質生物改性介導17β-雌二醇生物降解作用

顧麗鵬,何 歡,胥志祥,熊 丹,劉 君,任 東,黃 斌*,潘學軍 (昆明理工大學環境科學與工程學院,云南昆明 650500)

摘要：利用元素分析、紫外-可見光譜、三維熒光指數對經過15d生物改性前后腐殖酸的組分和結構進行表征,并比較了生物改性前后3種腐殖酸對17β-雌二醇(E2)的結合作用;而且研究了結合后的腐殖酸介導微生物降解E2的影響.結果表明:經過元素分析后,生物改性前的腐殖酸OLHA、OLFA、OSHA和生物改性后的腐殖酸BLHA、BLFA、BSHA的(N+O)/C值分別為 0.801、1.214、0.820和0.629、1.080、0.797;紫外-可見光譜分析生物改性前后的SUVA254指數分別為0.146、0.023、0.073和0.179、0.036、0.011;生物改性前后熒光指數(FI)分別為:0.723、3.385、2.757和0.681、3.017、1.702.上述3種表征手段分析得出腐殖酸的極性是一致的,即改性后的腐殖酸要比改性前的腐殖酸極性小.此外,在30h內5mgC/L的腐殖酸生物改性前后對3mg/L的E2的結合效率分別為31.37％、4.96％、25.86％和37.78％、6.03％、29.92％,明顯發現改性后的腐殖酸對E2的結合作用增強;5mgC/L的腐殖酸生物改性前后對3mg/L的E2的30h內的生物降解效率分別為46.28％、15.96％、38.76％和51.11％、17.30％、44.33％,而且同等濃度下的腐殖酸對E2的結合作用越大其介導微生物降解E2的效果越好.關鍵詞：腐殖酸；生物改性；組分變化；結構變化；17β-雌二醇；生物降解

*責任作者, 副教授, huangbin@kmust.edu.cn

溶解性有機質(DOM)是動植物殘體經生物、化學及生物化學作用過程產生的一類分子量分布寬、結構復雜的異質溶解性有機混合物[1-2],是地表水體中普遍存在的活躍組分.腐殖酸是溶解性有機質的主要組成部分,其包括胡敏酸(HA)和富里酸(FA),腐殖酸含量可占到環境地表水中溶解性有機碳總量的40％～80％[3].腐殖酸對疏水性有機污染物具有很強的結合作用,能夠影響其在水環境中的遷移轉化.此外,DOM自身生物轉化過程對有機污染物結合和生物降解起著重要的介導作用.研究表明,胡敏酸可促進PCBs、PAHs等有機污染物的微生物降解[4-5].因此,腐殖酸影響疏水性有機污染物在環境中的轉化過程成為當前研究中的熱點.然而,腐殖酸通過自身生物轉化行為來影響疏水性有機污染物的生物降解機理不是很清楚.

類固醇類雌激素(SEs)是一類典型的環境內分泌干擾物,在極低濃度下就會影響生物體自身雌激素的合成、分泌和傳輸等,干擾水生生物正常的生殖功能[6],其中尤以E2的內分泌干擾性最強,在河水中濃度僅為1ng/L時就會造成雄魚雌性化[7-8].這類物質給野生動物、人類健康及生態安全帶來了既成或潛在的危害[9-10].類固醇雌激素在水環境中的消減主要依靠生物降解[11]和物理化學[12-13]等途徑去除.其中,物理化學方法,包括光化學法[14],電化學氧化法[15-16]然而,這些方法有很大的不足,例如,需要對化學物質純度要求很高,消耗的能量很高;此外,類固醇雌激素具有很長的半衰期[17],此外,特別是在深水區或者沉積物中主要是依靠微生物對其降解.因此,微生物降解對環境水體中類固醇雌激素的去除可能起著關鍵作用.同時,本課題組前期研究調查也表明,微生物降解可能是滇池水體中類固醇雌激素未發生大量積累的主要原因[18].盡管類固醇雌激素能夠發生發生微生物降解[19],但其直接生降解過程緩慢,半衰期一般為幾十至數百天[20].然而, Larcher等[21]發現自然水體中的類固醇雌激素在幾天的時間內被降解;并推測類固醇雌激素的生物降解降解過程受到了水體中腐殖酸.

因此,為了探究水體環境中廣泛存在的腐殖酸對E2的結合作用對生物降解過程的影響以及DOM自身的生物轉化對E2的結合作用和生物降解作用的影響.本研究通過對洱海沉積物中分離出的腐殖酸(OLHA)和富里酸(OLFA)以及市售腐殖酸(OSHA)進行了生物改性,采用元素分析、紫外-可見光譜技術、三維熒光光譜技術對生物改性前后的腐殖酸進行對比,并分析生物改性前后腐殖酸的組分和結構特性的改變進行表征,以探討生物改性前后的腐殖酸對E2結合過程和生物降解過程的影響.

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

主要試劑:E2 標準品和市售OSHA購于美國 Sigma 公司,分子式為C18H24O2,相對分子質量為272,溶解度為13.30mg/L,辛醇水分配系數為4.01[22],E2的分子結構和其3D結構模型如圖1所示.腐殖酸(OLHA)和富里酸(OLFA)是按照國際腐殖酸協會提供的標準方法從洱海沉積物中提取出來[23].實驗其他藥品均購置與購自國藥集團化學試劑有限公司(產品等級為分析純試劑).

圖1　E2的分子結構及其3D結構模型Fig.1 Molecular and optimized 3-dimensional structures of 17β-estradiol

主要儀器:紫外可見分光光度計UV-2600;德國ELEMENTAR元素分析儀vario micro;三維熒光光譜儀(Perkin Elemer LS55);美國Millipore 0.22μm玻璃纖維濾膜.

1.2 實驗部分

1.2.1 腐殖酸生物改性實驗 從洱海沉積物中提取的OLHA、OLFA和市售OSHA分別配成2L的腐殖酸溶液,裝滿在之前被酸化過的5L的玻璃容器中, 向溶液中添加NH4NO3和K2HPO4使營養物質比例達到: C:N:P=30:10:3以便微生物的生長不會受到抑制[24],其次,添加10mL的活性污泥上層清夜,再通過1mol/L的NaOH和6mol/L的HCl調整反應體系的pH為中性.將容器密封,放在室溫、黑暗條件,250r/min的搖床下培養15d,每天取出手搖15min,這樣防止微生物缺氧,每天都調整pH值呈中性.經過培養后,被生物改性后的腐殖酸通過0.22um玻璃纖維濾膜去除微生物,并進行121℃滅菌,取部分溶液冷凍干燥以便后續實驗進行,其余的保存在4℃冰箱.以下實驗將生物改性前的腐殖酸設置為:OLHA、OLFA、OSHA;將生物改性后的腐殖酸對應的設置為:BLHA、BLFA、BSHA.

1.2.2 生物改性前后腐殖酸的組分和結構的變化的表征 DOC的測定分析:3種腐殖酸經過15d的生物改性后,分別通過裝有0.22um玻璃纖維濾膜的抽濾裝置去除反應過程中的微生物,并121℃滅菌后冷卻保存在4℃的冰箱中以待后續實驗的進行.通過總有機碳分析儀(TOC儀)測定生物改性前后的腐殖酸的濃度大小.分別取0.50mL的生物改性前后的腐殖酸,然后將其稀釋到25mL測定其可溶性有機碳濃度的變化,并且分別設定3組平行樣.

元素分析:分別稱取2.00mg的HA、FA和SAHA于錫箔盒中,將包好的樣品放入元素分析儀(Elementar Vario,德國)進樣口,對每個樣品重復測定2次,其中氧的含量通過差減各元素的含量獲得.元素含量測定條件為燃燒爐溫度1150℃ ,還原爐溫度850℃ ,載氣氧和氦分別為0.25MPa 和0.20MPa;

UV-Vis分析:用移液器分別移取一定量的生物改性前后的腐殖酸于40mL試劑瓶中,將其配成腐殖酸的濃度為5mgC/L的溶液.于紫外-可見光譜儀(UV-2600,日本)上分別測定3種腐殖酸的吸收特征光譜.測試掃描范圍為200～700nm,波長間距為0.50nm;

三維熒光分析:腐殖酸進行三維熒光光譜測試,用超純水腐殖酸樣品稀釋至TOC為30mgC/L.測定三維熒光光譜時,將樣品溶解于0.01mol/L 的KCl溶液中,用NaOH溶液調節pH值為6.00,保持溫度恒定(恒溫水浴20±1℃ ).將樣品溶液分別置于1cm的石英比色皿中,并置于樣品槽中進行檢測.由于腐殖酸自身還是一種混合物,分別測定了其自身組分,其中蛋白質的吸收峰范圍為250～300nm,類富里酸的吸收峰范圍為300～ 380nm,類腐殖酸吸收峰范圍為370～450nm,陸地腐殖酸吸收峰范圍為420～600nm[24-25].

1.2.3 生物改性前后的腐殖酸與E2的相互作用 通過E2標準品配制1.50mg/L的水溶液.取6 個40mL的棕色瓶,分別加入5mgC/L生物改性前后的腐殖酸,再加入3mg/L的E2溶液配成取1.50mg/L的濃度E2進行結合實驗,同時添加100mg/L的NaN3抑制結合過程中E2的微生物降解,結合實驗在恒溫搖床中進行,用鋁箔將反應的棕色瓶包裹避光,25℃恒溫連續振蕩,搖床轉速為250r/min.通過三維熒光分析結合作用的E2的初始濃度和平衡濃度的差值,確定腐殖酸對E2的結合效率,每個樣設置3個平行樣.

1.2.4 生物改性前后的腐殖酸介導E2的生物降解實驗 配制30mL含5mgC/L生物改性前后的腐殖酸的E2溶液,調節溶液pH值為7.00±0.10,再加入0.10g/L干重的微生物進行E2微生物降解實驗30h.實驗溫度控制為25℃ ,恒溫連續振蕩,搖床轉速為250r/min.并保持與空氣接觸.同樣的實驗條件下,考察不同濃度的腐殖酸對E2微生物降解的影響.

1.2.5 E2定量分析 對于腐殖酸和E2的結合作用,通過三維熒光進行定量分析,從200～700nm進行熒光波長的掃射,其中E2的熒光檢測器(Ex/Em=283/346).生物降解E2的過程中使用Agilent Technologies 1260高效液相色譜對E2進行定量分析;其測定條件為:Waters C18反相柱(4.60mm×250mm,5μm),流動相為60％的乙腈(含0.1％三氟乙酸),等度洗脫,流速為1mL/min.

2 結果與討論

2.1 腐殖酸的生物改性前后的表征分析

2.1.1 腐殖酸的DOC的變化分析 3種腐殖酸經過15d的生物改性后,其DOC的變化如圖2所示.

由圖2可知,生物改性前后的腐殖酸OLHA、OLFA、OSHA和BLHA、BLFA、BSHA的值分356.10,162.50,353.70,213.80,105.60,247.10mgC/ L.經過15d的生物改性后,3種腐殖酸的濃度都在下降,說明在腐殖酸酸生物改性過程有很大的一部分有機碳被微生物氧化降解成CO2和H2O,這一結果和Hur等[26]的結果一致.其中的一部分組分和結構發生了變化,這個結論可以通過下列元素分析、UV-Vis 分析、三維熒光光譜分析等表征可以說明.

圖2　三種腐殖酸生物改性前后DOC的變化Fig.2 The changes of the DOC about before and after humic acid bio-modification

2.1.2 腐殖酸的元素分析 通過對生物改性前后的腐殖酸中C、H、O、N和S等元素分析,其各元素含量、H/C、O/C、(N+O)/C值等分析結果如表1所示.結果表明,生物改性前后的腐殖酸的組分元素沒有變化,都是由C、O、H、N及少量的S組成,其灰分含量都低于1.00％,H/C值都小于1.00,這表明生物改性前后的腐殖酸確實都為腐殖質[27].但是,生物改性前后腐殖酸中各元素所占的比例發生了明顯的變化,例如,生物改性前的腐殖酸OLHA、OLFA、OSHA和生物改性后的腐殖酸BLHA、BLFA、BSHA的C元素的比值分別為52.47％、42.93％、51.76％和58.32％、45.40％、52.67％;這說明腐殖酸在生物改性過程中其元素所占的比例發生了改變.其中:H/C值可以分析腐殖酸的芳香結構和脂肪結構含量[28].經過生物改性后的腐殖酸H/C值均小于未改性的腐殖酸H/C的比值,因此,生物改性后的腐殖酸芳香性更好.此外,Wen等[29]認為通過(N+O)/C值可以反映出腐殖酸的極性大小,其值越大,極性越強,水溶性也越好.由表1可知,生物改性后的腐殖酸它的(N+O)/C值均減小,說明相對未經過生物改性的腐殖酸而言,生物改性后的腐殖酸極性變小,說明水溶性變差.

表1　生物改性前后腐殖酸的元素分析結果Table 1 The element analyzing of before and after bio-modification humic acid

2.1.3 紫外可見光譜分析 通過前期的研究表明腐殖酸都具有相似的紫外-可見吸收光譜特征,單位濃度腐殖酸的吸光系數均隨波長增加而呈指數模型減小,最重要的是腐殖酸的SUVA254和色調系數Δlgk值等對其組分和結構具有明顯的指示作用[30].按照式(1)和式(2)方程式分別對生物改性前后的腐殖酸的SUVA254和色調系數Δlgk數據計算,其結果如表2所示.

式中:A254、A400、和A600為生物改性前后腐殖酸在波長為254,400,600nm下的吸光度;[DOC]表示生物改性前后腐殖酸的濃度大小.

表2表明,生物改性后的腐殖酸其SUVA254值變大,說明腐殖化程度變高;此外,生物改性前的腐殖酸含有更多營養物質,經過生物改性后,腐殖酸中營養物質被微生物利用[31].研究表明[32]△lgk值越大,它的氧化程度和芳香度就越小.因此,本研究中生物改性后的腐殖酸其腐殖酸的△lgk值均變小,因此,生物改性后的腐殖酸它的氧化程度變大,芳香度也增大.

表2　生物改性前后腐殖酸的紫外-可見特征吸收值Table 2 The ultraviolet-visible light absorption eigenvalues of before and after bio-modification humic acid

2.1.4 三維熒光光譜分析 腐殖酸實驗測得的熒光強度進行內過濾效應校正,并計算其各自的熒光指數、腐殖化指數(HIX)等參數.其校正公式如熒光指數(FI)能夠衡量腐殖酸的芳香性,通常FI值越高,該腐殖類物質組分中含有的苯環結構越少,芳香性越弱[33].

HIX可以表征腐殖酸的腐殖化程度,其值越大,腐殖化程度越深[34].其中熒光指數和腐殖酸化程度的計算公式分別為:

通過按照式(3)和式(4)方程式分別對生物改性前后的腐殖酸的FI和HIX值數據計算,其結果如表3所示,說明生物改性后的腐殖酸其FI值越小,HIX值越大說明經過生物改性后,其腐殖酸化程度變大,芳香性越好.

由于被分離的腐殖酸其中含有許多成分,研究表明腐殖酸其自身組分主要有蛋白質、類富里酸、類腐殖酸、陸地腐殖酸[26];為了表征腐殖酸在生物改性過程中其自身組分的變化,因此在三維熒光的測定過程中,分別對生物改性前后腐殖酸4個基本組分進行了更深入的測定.

表3　生物改性前后腐殖酸的熒光特征參數Table 3 Fluorescent characteristic parameters of before and after bio-modification humic acid

圖3　腐殖酸的生物改性前后其自身組分的變化Fig.3 The change of its components on before and after　bio-modification humic acid

由圖3表明,腐殖酸經過生物改性后其蛋白質組分變小,被微生物作為營養物質而分解掉.富里酸的所占的組分基本呈現一個減小的趨勢,而腐殖酸和陸地腐殖酸所占的組分在增大,說明經過生物改性后,腐殖酸的腐殖化程度變大.這一結果和Hur等[2]所得的結果一致.

2.2 腐殖酸的生物改性前后與E2的結合作用分析

通過圖4可見,經過生物改性后的腐殖酸其結合作用強度均比未經生物改性的結合強度大,說明腐殖酸經過生物改性以后,其腐殖酸化程度變大,芳香性變大,與水體中的E2結合程度增大.此外,對于3種腐殖酸來說,其結合作用大小為OLHA > OSHA > OLFA,這個結果和上面元素分析的(N+O)/C值分析的腐殖酸的極性結果一致,說明OLFA的極性越大,其水溶性越好,而OLHA 和OSHA的極性越小,其與水溶液中的E2的結合效果越好結果一致.腐殖酸和E2結合作用的結果與腐殖酸對菲的結合作用效果很類似[5].

圖4　3種腐殖酸生物改性前后與E2的結合作用Fig.4 The combination of before and after bio-modification humic acid on E2

2.3 腐殖酸生物改性前后介導E2生物降解作用的分析

圖5A表明,添加了腐殖酸有效地促進微生物與E2的接觸作用,最重要的原因是增大了微生物細胞表面磷脂雙分子層對E2的吸附效果.類似的結果表明疏水性有機污染物的生物降解過程中,通過添加一定量的Tween 80[35]或添加鼠李糖脂[36]等物質時,可以有效促進疏水性有機污染物的降解作用.此外,經過生物改性后的腐殖酸介導微生物對E2的降解效率更好,這個說明經過生物改性后的腐殖酸其極性變小并且與E2的結合作用變大,導致E2更容易被微生物細胞表面吸附.

通過圖5B表明,腐殖酸濃度從0～10mgC/L逐漸增大,其對微生物降解E2的效果越好,說明增加腐殖酸濃度,能夠有效的促進微生物對E2的降解;此外,經過生物改性后的腐殖酸介導E2的生物降解效率要比為改性的腐殖酸效果好,說明進過生物改性后的腐殖酸能夠有效的提高微生物對E2的降解.類似的疏水性有機污染物,例如,菲在微生物生物降解過程中,隨著腐殖酸濃度的增大,其微生物對菲的降解效率在增大[37].

圖5　腐殖酸的生物改性前后介導E2的生物降解Fig.5 The humic acid bio-modification mediated E2 biodegradation

2.4 評價生物改性前后的腐殖酸與E2的結合作用對E2生物降解作用的影響

對于疏水性有機污染物在水環境中的遷移轉化過程中,大量的研究主要集中在腐殖酸影響疏水性有機污染物在環境介質中的吸附-解吸作用[38];或者在微生物直接作用于疏水性有機物的還原降解作用[39],而忽略了腐殖酸在水環境中對微生物降解有機污染物的作用.因為腐殖酸在水環境中是普遍存在的,生物對腐殖酸自身的降解作用一直存在,但是有關研究腐殖酸生物改性的很少,而且更少有研究深入的表征腐殖酸在生物改性過程中其自身組分和結構的變化,對疏水性有機污染物的結合作用以及其生物改性前后腐殖酸介導微生物降解E2的機理;此外,結合作用和降解作用對疏水性有機污染物的相互作用需要進一步闡明.因此,本文通過生物改性前后的腐殖酸其自身的組分和結構的變化對介導E2生物降解作用;通過與沒有添加腐殖酸其微生物對E2的降解作用和添加了生物改性前后腐殖酸對E2的降解作用進行了比較.

由圖6可知,通過添加了OLHA、OLFA、OSHA(5mgC/L)對E2的降解效果相對于沒有添加腐殖酸而言分別提高了10.95％、5.21％、9.28％;對于生物改性后的BLHA、BLFA、BSHA (5mgC/L)對E2的降解效果相對于沒有添加腐殖酸而言分別提高了13.11％、7.19％、12.07％;這說明腐殖酸對E2的結合作用越好,其微生物對E2降解作用越好.此外,通過添加了BLHA、BLFA、BSHA三種腐殖酸(5mgC/L)對E2的降解效果相對于添加未經生物改性的OLHA、OLFA、OSHA(5mgC/L)而言分別提高了2.16％、1.98％、2.79％;這說明經過生物改性后的腐殖酸其腐殖酸化程度變大,導致腐殖酸對E2的結合作用增大,促使了E2更容易的被微生物細胞吸附,從而使得E2降解效率增大.這個結果和上述元素分析、紫外可見光譜分析、三維熒光光譜的分析表征結果一致.說明對腐殖酸的生物改性能夠有效的促進其對E2的結合,從而增大腐殖酸介導微生物對E2的降解效果.

圖6　腐殖酸對E2降解作用的影響貢獻Fig.6 Humic acid contribution to E2biodegradation effect

3 結論

3.1 腐殖酸經過15d的生物改性后,三種腐殖酸的DOC濃度都在下降,說明在腐殖酸酸生物改性過程有很大的一部分有機碳被微生物氧化降解成CO2和H2O.

3.2 通過元素分析得出生物改性前后的腐殖酸元素組分沒有變化,但是各元素所占的比例發生了明顯的變化,通過H/C和(N+O)/C的比值表明生物改性后的腐殖酸芳香性更好,水溶性更差,與E2的結合效果更好.

3.3 通過腐殖酸的SUVA254分析表明,生物改性后的腐殖酸其SUVA254值變大,說明它的腐殖化程度變高;色調系數△lgk值分析表明,生物改性后的腐殖酸其值表小,說明它的氧化程度變大,芳香度也增大.

3.4 通過三維熒光光譜分析其熒光指數、腐殖化指數表明,生物改性后的腐殖酸其FI值越小,HIX值越大說明經過生物改性后,其腐殖酸化程度變大,芳香性越好.其組分的中蛋白質在減少,腐殖酸所占的比例在升高,都說明生物改性后的腐殖酸的腐殖酸化程度增大.

3.5 生物改性后的腐殖酸對E2的結合作用增大,生物改性后的腐殖酸對E2的生物降解作用增大;此外,腐殖酸對E2的結合作用越大,腐殖酸介導微生物降解E2的降解效果越好.

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Dissolved organic matters bio-modification mediated 17β-estradiol biodegradation.

GU Li-peng, HE Huan, XU Zhi-xiang, XIONG Dan, LIU Jun, REN Dong, HUANG Bin*, PAN Xue-jun (Faculty of Environmental Science and Engineering, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500, China). China Environmental Science, 2016,36(2)：468～475

Abstract：Through elemental analysis, ultraviolet-visible spectra and fluorescence index, the composition and structure of the humic acid with and without 15 days biological modification were analyzed, and compared the binding function of three kinds of humic acid on 17β-estradiol (E2). And the binding function between 17β-estradiol (E2) and three different kinds of humic acid that before and after bio-modification were then compared. At last, the microbial degradation influences of E2 mediated by humic acid were studied. The elemental analysis results showed that the (N+O)/C values of humic acid (OLHA, OLFA, OSHA) that before bio-modification and humic acid (BLHA, BLFA, BSHA) that after biological modification were 0.801, 1.214, 0.820 and 0.629, 1.080, 0.797, respectively. The ultraviolet-visible spectrum results showed that the values of SUVA254were 0.146, 0.023, 0.073 and 0.179, 0.036, respectively. And the fluorescence index (FI) were 0.723, 3.385, 2.757 and 0.681, 3.017, 1.702, respectively. The above three kinds of characterization analysis results showed that the polarity of humic acid were consistent, suggesting that the polarity of modified humic acid were weaker than former. Moreover, the binding efficiency of 3mg/L E2 by 5mgC/L three humic acid before and after the bio-modification within 30h were 31.37％, 4.96％, 25.86％ and 37.78％, 6.03％, 29.92％, respectively, which showed that the binding functions of E2 were increased obviously after humic acid bio-modification treatment. The biodegradation efficiency of 3mg/L E2 by 5mgC/L three humic acid before and after the bio-modification within 30h were 46.28％, 15.96％, 38.76％ and 51.11％, 17.30％, 44.33％, respectively. Meanwhile, the stronger binding function of the same humic acid concentrations on E2, the greater efficiency of combined humic acid mediated microbial degradation of E2.

Key words：humic acid；bio-modification；component change；structure change；17β-estradiol；biodegradation

作者簡介：顧麗鵬(1990-),男,江西上饒人,昆明理工大學碩士研究生,主要從事天然有機質介導微生物對內分泌干擾物的降解作用的研究.

基金項目：國家自然科學基金(21567014, 21267012, 41401558);中國博士后科學基金(2014T70887);中國科學院環境化學與生態毒理學國家重點實驗室開放基金(KF2013-04);云南省教育廳科學研究基金項目(2014J022)

收稿日期：2015-07-14

中圖分類號：X17

文獻標識碼：A

文章編號：1000-6923(2016)02-0468-08