M3受體在低氧引起H9c2細(xì)胞損傷中的作用及其機(jī)制※

司立寧，甘桂芬，趙延禮，嚴(yán)海萍，黨國全，于冬悅，王 嶸*

(1.青海大學(xué)附屬醫(yī)院，西寧 810001；2.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心，西寧 810001；3.中國藥科大學(xué)，南京 211198)

M3受體在低氧引起H9c2細(xì)胞損傷中的作用及其機(jī)制※

司立寧1，甘桂芬1，趙延禮2，嚴(yán)海萍1，黨國全2，于冬悅3，王 嶸2*

(1.青海大學(xué)附屬醫(yī)院，西寧 810001；2.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心，西寧 810001；3.中國藥科大學(xué)，南京 211198)

目的 探討M3受體激動(dòng)對(duì)低氧誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞損傷的作用及機(jī)制。方法 采用三氣培養(yǎng)建立H9c2細(xì)胞低氧損傷模型。實(shí)驗(yàn)組分為對(duì)照組(A)、低氧組(B)、CCh+低氧組(C)、4DAMP+CCh+低氧組(D)。采用CCK-8法測定細(xì)胞存活率，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測H9c2細(xì)胞凋亡情況；Western blot法檢測凋亡蛋白Caspase-3、抗凋亡蛋白Bcl-2及HIF-1α和HO-1的表達(dá)。結(jié)果 M3受體激動(dòng)劑CCh(10mmol/L)可減少低氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷，并可增加心肌Bcl-2、HIF-1α、HO-1的表達(dá)，減少Caspase-3表達(dá)。但預(yù)先應(yīng)用4DAMP(10nmol/L)阻斷M3受體可逆轉(zhuǎn)膽堿作用。結(jié)論 激動(dòng)M3受體對(duì)低氧誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞的損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與HIF-1α、HO-1的表達(dá)增加有關(guān)。

M3受體 細(xì)胞損傷 低氧 低氧誘導(dǎo)因子-1 血紅素加氧酶-1

研究表明，M3受體激動(dòng)劑膽堿通過激動(dòng)心肌細(xì)胞M3受體產(chǎn)生負(fù)性肌力和負(fù)性頻率的作用[1]。然而，激動(dòng)M3受體對(duì)低氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的影響尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過低氧誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞損傷，研究激動(dòng)M3受體對(duì)低氧引起心肌細(xì)胞損傷的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器選擇

H9c2細(xì)胞株(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)；卡巴膽堿、4DAMP(Sigma公司)，胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone公司)；CCK-8(cellcounting kit-8)、AnnexinV-PI染色試劑盒(南京建成生物工程公司)；HIF-1α、Bcl-2、Caspase-3、HO-1、GAPDH抗體(Santa Cruz公司) ；CO2恒溫培養(yǎng)箱(Thermo Electron公司)；YCP-50S三氣培養(yǎng)箱(長沙華曦電子科技有限公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組

細(xì)胞培養(yǎng)：將H9c2細(xì)胞按(1～3)×105個(gè)/mL等量接種于35 mm培養(yǎng)皿中，于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中置于細(xì)胞培養(yǎng)箱(5%CO2、飽和濕度、37℃)無菌培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)70%～80%之間時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前采用無血清DMEM高糖培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)12 h。

實(shí)驗(yàn)分組：正常對(duì)照組(A，常氧正常培養(yǎng))；低氧組(B，細(xì)胞培養(yǎng)于37℃，5%CO2的三氣培養(yǎng)箱中，通入純度為99.9%的N2平衡培養(yǎng)箱中的O2，排氣口檢測O2濃度≤1%，培養(yǎng)24h)；CCh+低氧組[C，培養(yǎng)條件同B組，培養(yǎng)時(shí)加入CCh(10mmol/L)]；4DAMP+CCh+低氧組[D，該組細(xì)胞在按照C組培養(yǎng)前2 h加入4DAMP(10nmol/L)]。

1.3 細(xì)胞損傷的測定

按照CCK-8法細(xì)胞活性檢測試劑盒的操作步驟，對(duì)各組細(xì)胞活性進(jìn)行測定，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.4 細(xì)胞凋亡檢測

將各組細(xì)胞用PBS液洗滌2次，用適量1×Binding緩沖液重懸，使細(xì)胞濃度達(dá)到1×106個(gè)/mL。然后取100 μL重懸液，加入5 μL FITC Annexin V和5 μL碘化丙啶(PI)，室溫避光15 min。最后加入400 μL Binding緩沖液，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.5 蛋白表達(dá)檢測

收集細(xì)胞并用PBS液洗滌3次，加入適量裂解液在冰浴中裂解細(xì)胞，收集蛋白做考馬斯亮藍(lán)法蛋白定量，行十二烷基磺酸鈉/聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5%脫脂牛奶封閉后加入第1抗體孵育(4℃)過夜，用PBST緩沖液洗滌3次，10 min/次，加入第2抗體于室溫孵育2 h，再用PBST緩沖液洗滌3次，10 min/次，加入發(fā)光試劑ECL顯色曝光，采用Image-Pro圖像分析軟件進(jìn)行灰度分析，GAPDH作為內(nèi)參。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 M3受體對(duì)低氧H9c2細(xì)胞活力的影響(表1)

Table 1 Survival of mediated myocyte in each group

*：與A組比較，P<0.01；#：與B組比較，P<0.01；▲：與C組比較，P<0.01.

表1顯示，與A組相比，B組細(xì)胞進(jìn)行24 h低氧培養(yǎng)后細(xì)胞活力明顯降低(P<0.01)；C組細(xì)胞低氧處理時(shí)給予M3受體激動(dòng)劑CCh后，細(xì)胞活力較B組顯著升高(P<0.01)。但是，D組細(xì)胞在給予低氧和M3受體激動(dòng)劑處理前2 h先給予4DAMP，明顯逆轉(zhuǎn)了CCh保護(hù)低氧導(dǎo)致細(xì)胞活力下降的現(xiàn)象。

2.2 M3受體對(duì)低氧H9c2細(xì)胞凋亡的影響(圖1，表2)

圖1 各組細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果圖

Figure 1 Flow cytometry in each group

圖2 Westernblot法檢測各組細(xì)胞Caspase-3和Bcl-2蛋白結(jié)果圖

Table 2 2Apoptosis of Mediated myocyte in each group

*：與A組比較，P<0.01；#：與B組比較，P<0.01；▲：與C 組比較，P<0.05.

圖1、表2顯示，與A組相比，B組細(xì)胞低氧培養(yǎng)24 h后細(xì)胞凋亡數(shù)明顯增加(P<0.01)；與B組相比，給予M3受體激動(dòng)劑CCh后明顯減少了低氧導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡數(shù)(P<0.01)；利用4DAMP預(yù)先阻斷M3受體后可逆轉(zhuǎn)CCh的抗凋亡作用。

2.3 M3受體對(duì)低氧H9c2細(xì)胞Bcl-2和Caspase-3蛋白表達(dá)的影響(圖2，表3)

Table 3 The expression of Caspase-3 and Bcl-2 in each group

*：與A組比較，P<0.01；#：與B組比較，P<0.01；▲：與C組比較，P<0.01.

圖2、表3顯示，與A組相比，B組低氧培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白的表達(dá)降低(P<0.01)、Caspase-3蛋白的表達(dá)升高(P<0.01)；與B組相比，C組結(jié)果顯示CCh可增加Bcl-2蛋白的表達(dá)(P<0.01)、降低Caspase-3蛋白的表達(dá)(P<0.01)；給予M3受體阻斷劑4DAMP后明顯逆轉(zhuǎn)C組現(xiàn)象。

2.4 M3受體對(duì)低氧H9c2細(xì)胞HIF-1α和HO-1蛋白表達(dá)的影響(圖3，表4)

圖3 Westernblot法檢測各組細(xì)胞HIF-1α和HO-1蛋白結(jié)果圖

Figure 3 The expression of HIF-1αand HO-1 byWesternblot in each group

Table 4 The expression of HIF-1αand HO-1 in each group

*：與A組比較，P<0.01；#：與B組比較，P<0.01；▲：與C組比較，P<0.01.

圖3、表4顯示，與A組相比，B組細(xì)胞低氧培養(yǎng)24 h后細(xì)胞內(nèi)HIF-1α、HO-1蛋白的含量明顯增加(P<0.01)；與B組相比，激活M3受體可顯著增加低氧條件下心肌細(xì)胞內(nèi)HIF-1α、HO-1蛋白的表達(dá)(P<0.01)；而預(yù)先阻斷M3受體可明顯降低由CCh引起的HIF-1α、HO-1蛋白表達(dá)的增加(P<0.01)。

3 討論

本研究結(jié)果表明，給予膽堿可保護(hù)低氧引起的心肌細(xì)胞損傷，并誘導(dǎo)HIF-1α、HO-1表達(dá)增加，預(yù)先給予4DAMP可逆轉(zhuǎn)膽堿的保護(hù)作用，提示膽堿是通過激動(dòng)心肌M3受體發(fā)揮心肌保護(hù)作用，其機(jī)制可能與誘導(dǎo)HIF-1α、HO-1表達(dá)增加有關(guān)。

以往研究認(rèn)為，心肌細(xì)胞中只有M2受體。但近年研究發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞中也存在M3受體等其他類型，并且M3受體在很多心臟疾病中發(fā)揮重要的作用[2]。Liu課題組研究發(fā)現(xiàn)，心肌過表達(dá)M3受體可通過抑制MAPK通路明顯減弱血管緊張素II誘導(dǎo)的心肌肥厚[3]。另有研究發(fā)現(xiàn)，激動(dòng)心肌M3受體可抑制H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[4]。張偉志課題組研究發(fā)現(xiàn)，在H9c2細(xì)胞中，氨甲酰膽堿通過M3受體調(diào)控MEK1/2-ERK1/2信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞的生存[5]。本研究利用M3受體激動(dòng)劑CCh和抑制劑4DAMP發(fā)現(xiàn)，心肌M3受體在低氧引起的心肌細(xì)胞損傷中發(fā)揮保護(hù)作用。

慢性低氧會(huì)引起心肌組織結(jié)構(gòu)的異常，如心肌細(xì)胞肥大、凋亡和間質(zhì)纖維化等[6，7]。研究認(rèn)為，低氧能夠通過調(diào)節(jié)生長因子、應(yīng)激蛋白和酶等基因的表達(dá)調(diào)控心肌細(xì)胞的生長和分化[8，9]。本研究發(fā)現(xiàn)，給予低氧處理H9c2細(xì)胞24 h后，心肌細(xì)胞增殖能力明顯降低，心肌細(xì)胞凋亡明顯增加，促凋亡蛋白Caspase-3表達(dá)增加，抑制凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)減少。但是，低氧時(shí)給予CCh處理可明顯增加心肌細(xì)胞的增殖和減少心肌細(xì)胞的凋亡，并且促凋亡蛋白Caspase-3表達(dá)減少，抑制凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)增加。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，該現(xiàn)象可在預(yù)先給予4DAMP后明顯逆轉(zhuǎn)。該結(jié)果提示低氧對(duì)心肌細(xì)胞的生長有抑制作用，激動(dòng)心肌M3受體可抑制低氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞活力降低和凋亡增加。

研究證實(shí)，低氧可誘導(dǎo)心肌、肝臟、腎臟、骨骼肌等組織中HIF-1α和HO-1表達(dá)增加，并發(fā)揮重要的保護(hù)作用[10，11]。Hui課題組研究發(fā)現(xiàn)，激動(dòng)心肌M3受體可通過HIF-1α/HO-1/VEGF通路抑制依托泊苷誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[12]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，低氧培養(yǎng)H9c2細(xì)胞24 h可明顯誘導(dǎo)HIF-1α、HO-1表達(dá)增加；低氧條件下激動(dòng)心肌M3受體可明顯誘導(dǎo)HIF-1α、HO-1表達(dá)增加，預(yù)先給予4DAMP后可阻斷膽堿的作用，提示激動(dòng)心肌M3受體可保護(hù)低氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的作用可能是通過誘導(dǎo)HIF-1α、HO-1表達(dá)增加實(shí)現(xiàn)的。

激動(dòng)心肌M3受體可能是通過誘導(dǎo)HIF-1α、HO-1的表達(dá)增加抑制低氧引起的心肌細(xì)胞損傷。本研究為低氧條件下心肌M3受體與HIF-1α/HO-1之間的關(guān)系提供了新的證據(jù)。

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Protective effect of M3receptor on hypoxia damage of H9c2 cell※

Si lining1，Gan Guifen1，Zhao Yanli2，Yan Haiping1，Dang Guoquan2，Yu Dongyue3，Wang Rong2

(1.Qinghai University Affiliated Hospital，Xining 810000；2.Basic Science Research Center of Qinghai University Medical College，Xining810000；3.China Pharmaceutical University，Nanjing 211198)

Objective To observe the effect of activation of M3receptor on hypoxia damage in cultured H9c2 cell and to investigate its possible mechanisms.Methods A model of Hypoxia damage was performed as cells cultured in a tri-gas incubator.Cells were divided into four groups，including control(A)，hypoxia(B)，CCh+hypoxia(C)and 4DAMP+ CCh+hypoxia(D).The viability of cells was determined by CCK-8 assay.Western blot was used to determine Caspase-3，Bcl-2，HIF-1α and HO-1 levels.Results Hypoxia mediated myocyte damage was attenuated by M3receptor agonist choline(10mmol/L).Pretreatment of cardiac myocytes with choline also increased Bcl-2，HIF-1α and HO-1，decreased Caspase-3 expression in hypoxia stimulated H9c2 cell.However，blockade of M3receptor by 4DAMP(10nmol/L)completely inhibited the effects of choline on hypoxia stimulated H9c2 cell.Conclusions Activation of M3receptor showed protective effect on hypoxia induced damage in cultured H9c2 cell and this effect might be related tomodulating the expression of some genes including HIF-1α and HO-1.

M3receptor Cell damage Hypoxia HIF-1α HO-1

※：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81060162)；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81460284)；青海省自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(2014-ZJ-944Q)；青海省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2015-ZJ-744) 司立寧(1980～)，女，漢族，主治醫(yī)師.* ：通訊作者，qhwr2007@163.com

R331.3

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2016.02.004

2015-11-09