miR-146a(rs2910164)單核苷酸多態(tài)性與青海回族胃癌易感性

吉棟德，楊雪瑩，王榮華，安 玲，李正娥，蘇占海

(1.青海省人民醫(yī)院；2.中國計量大學(xué)；3.青海大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤放療科；4.青海紅十字醫(yī)院；5.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院)

miR-146a(rs2910164)單核苷酸多態(tài)性與青海回族胃癌易感性

吉棟德1，楊雪瑩2，王榮華3，安 玲1，李正娥4，蘇占海5#

(1.青海省人民醫(yī)院；2.中國計量大學(xué)；3.青海大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤放療科；4.青海紅十字醫(yī)院；5.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院)

目的 探討miR-146a(rs2910164)單核苷酸多態(tài)性與青海回族胃癌易感相關(guān)關(guān)系。方法 采集42例青海回族胃癌患者(胃癌組)和38例正常者(正常組)胃黏膜組織基因組DNA，應(yīng)用PCR-RFLP多態(tài)性檢測方法，分析青海回族胃癌患者miR-146a(rs2910164)基因型G/G、G/C、C/C多態(tài)性特點(diǎn)。結(jié)果 miR-146a(rs2910164)三種基因型G/G、G/C、C/C在胃癌組和對照組中分別是45.2%、47.6%、7.1%和34.2%、47.4%、18.4%，G和A等位基因頻率為0.69、0.31和0.58、0.42，其中基因型頻率和等位基因頻率在胃癌組和對照組之間無顯著性差異(P=0.268，P=0.300)。結(jié)論 miR-146a(rs2910164)單核苷酸多態(tài)性三種基因型及等位基因分布頻率在青海地區(qū)不存在地域性，與青海回族胃癌易感性無關(guān)。

miR-146a(rs2910164) 單核苷酸多態(tài)性 回族 胃癌易感性

miRNA是在真核細(xì)胞中較為保守的一組非編碼RNA，通過調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性及翻譯效率來對蛋白表達(dá)層面進(jìn)行調(diào)控，從而控制蛋白相應(yīng)的功能實(shí)現(xiàn)。miRNA在腫瘤組織和正常細(xì)胞中表達(dá)有差異性，并且具有組織特異性。因此利用檢測miRNA表達(dá)特點(diǎn)，可以為腫瘤診斷、預(yù)防和治療提供重要的指導(dǎo)[1-8]。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)作為常見的遺傳標(biāo)志之一，與疾病易感、藥物敏感、腫瘤篩查性等有關(guān)。miRNA-146a位于人基因組5q33，研究發(fā)現(xiàn)miR-146a表達(dá)異常可能與腫瘤易感密切相關(guān)，如已在乳頭狀甲狀腺癌、乳腺癌、肝癌、前列腺癌中發(fā)現(xiàn)miR-146a表達(dá)異常。深入研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a前體pre-miRNA在其結(jié)構(gòu)上有一個G/C單核苷酸多態(tài)性易導(dǎo)致miR-146a表達(dá)異常，使得腫瘤易感性提升[1，9-14]。胃癌的發(fā)生、發(fā)展和細(xì)胞內(nèi)許多因子表達(dá)異常有關(guān)，如抑癌基因或細(xì)胞生長因子等發(fā)生突變。同時也發(fā)現(xiàn)一些基因多態(tài)性與胃癌易感性有關(guān)。

榮光宏等[15]發(fā)現(xiàn)回族胃癌患病率較高。因此，探討回族胃癌易感因素具有重要意義。

本研究通過基因組學(xué)方法，探討miR-146a(rs2910164)單核苷酸多態(tài)性與青海回族胃癌發(fā)病易感性關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 胃癌組和對照組基因組DNA收集

收集2012～2015年青海省人民醫(yī)院、青海大學(xué)附屬醫(yī)院及西寧市回族醫(yī)院42例回族胃癌患者(其中男性25例，女性17例，平均年齡為56.170±12.708歲)和38例正常回族者(其中男性21例，女性17例，平均年齡為55.400±12.071歲)胃黏膜組織，并用DNA提取試劑盒行DNA提取并純化。

1.1.2 試劑和設(shè)備選擇

TaqDNA聚合酶、10×PCR Buffer(without Mg2+：100mM Tris-HCl，pH 8.8，25℃；500mM KCl)、MgCl2(25mM)、dNTP(10mM)、6×DNA Loading Dye(生工，上海)；PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒(生工，上海)，限制性內(nèi)切酶SacI(MBI，英國)；基因組DNA提取試劑盒(碧云天，北京)。PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀(加拿大 BBI公司)；SW-CJ-1D潔凈工作臺(蘇潔，江蘇)；DK-8D型電熱恒溫水槽(森信，上海)；DYY-8型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(琪特，上海)；YXJ-2離心機(jī)(湘儀，湖南)；凝膠成像系統(tǒng)(Gene Genius，美國)。

1.2 研究方法

1.2.1 基因組DNA提取和純化

將組織標(biāo)本液氮速凍、研磨后，立刻用蛋白酶K行37 ℃水浴消化，然后按照基因組DNA提取試劑盒說明提取DNA并純化，最后將基因組DNA溶解于200 μL nuclease-free water中，儲存于-20 ℃冰箱中。

1.2.2 miR-146a(rs2910164) 單核苷酸多態(tài)性分析

單核苷酸多態(tài)性通過PCR-RFLP法分析，其主要過程為miR-146a(rs2910164)PCR擴(kuò)增引物：Forward 5 ＇-TTC CAT GGG TTG TGT CAG TGT CAG ACG T-3＇；FN TTC CAT GGG TTG TGT CAG TGT CAG AGC T；Reverse 5＇-TTT CTC ACA GGA ACT CAC ACT CCT T-3＇，反應(yīng)條件是95 ℃ 10 min；95 ℃ 45 sec；65 ℃ 1 min；72 ℃ 1 min，共38個循環(huán)，最后于72 ℃反應(yīng)8 min。 20 μL PCR 產(chǎn)物經(jīng)過SacI限制性內(nèi)切酶消化，上樣于2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行電泳，并用DNA凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)處理采用SPSS for windows 17 軟件。結(jié)果分析采用卡方檢驗，P<0.05為差異統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-146a(rs2910164)基因多態(tài)性酶切結(jié)果

miR-146a(rs2910164)產(chǎn)物經(jīng)過SacI酶切后基因多態(tài)性特點(diǎn)分別是不能被內(nèi)切酶消化者為G/G基因型、雜合型為C/G基因型，而完全消化者為C/C基因型(圖1)。

2.2 miR-146a(rs2910164)基因型和基因頻率(表1)

表1顯示，miR-146a(rs2910164)G/G、C/G和C/C基因型頻率在青海回族胃癌組和對照組中分別是45.2%、47.6%、7.1%和34.2%、47.4%、18.4%，G和A等位基因頻率為0.69、0.31和0.58、0.42，其中基因型頻率在青海回族胃癌組和對照組間無顯著性差異(P=0.268)，G和A等位基因頻率在青海回族胃癌組和對照組中亦無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.300)。

圖1 miR-146a(rs2910164)PCR酶切基因多態(tài)性分析圖

Figure1 Thegenetic polymorphisms of miR-146a (rs2910164) analyzedbyPCR

(M：DNA 馬克；1、5、12、14為C/C型；2、3、4、6、8、11、13、15、17為C/G型；7、16、18為G/G型)(M：DNA marker；1、5、12、14are C/C genotype；2、3、4、6、8、11、13、15、17are C/G genotype；7、16、18 are G/G genotype)

表1 miR-146a(rs2910164)基因與青海回族胃癌發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系(%)

Table 1 Relationshipof genotype distribution of miR-146a (rs2910164) polymorphism with the risk

3 討論

本研究結(jié)果顯示，miR-146a(rs2910164)單核苷酸多態(tài)性三種基因型及等位基因分布頻率在青海地區(qū)不存在地域性，與青海回族胃癌易感性無關(guān)。

胃癌的發(fā)生是一個多步驟多基因參與的過程，牽涉到很多因素，目前認(rèn)為遺傳因素、環(huán)境因素、生物因素(如幽門螺桿菌感染)和不良生活習(xí)慣及它們相互作用共同促成了胃癌的發(fā)生和發(fā)展。但個體對胃癌易感性的不同在胃癌發(fā)生中扮演重要的角色，而這種不同的易感性的遺傳學(xué)基礎(chǔ)是人類基因組DNA序列的變異性，其中最常見的是單核苷酸多態(tài)性(SNP)，其占已知基因多態(tài)性的90%左右，說明其在遺傳特異性、基因特異性及易感性研究方面占有明顯的優(yōu)勢，如程序死亡因子-1(Programmed death-1，PD-1)、腫瘤生長因子(Tumor growth Factor)-beta-1因子多態(tài)性和胃癌易感性有密切關(guān)系；白介素-16(IL-16)、IL-17單核苷酸多態(tài)性與胃癌易感有關(guān)。對于胃癌患者預(yù)后與miR-146a(rs2910164)C>G多態(tài)性的關(guān)系，目前的研究結(jié)論尚不一致。在日本，預(yù)后最好的胃癌基因型為CC基因型[15-16]。由于CC基因型患者胃癌組織中的miR-146a表達(dá)較高，其通過下調(diào)白介素1受體相關(guān)激酶(IRAK1)和表皮生長因子受體(EG-FR)來抑制胃癌細(xì)胞遷移和浸潤。因此miR-146a低表達(dá)的胃癌患者更容易發(fā)生血管侵犯和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致生存率下降[17-18]。而在韓國則相反，CC基因型的生存率卻低于CG/GG基因型[19]。在希臘和德國，miR-146aC>G(rs2910164)多態(tài)性與胃癌患者的預(yù)后不具有相關(guān)性[20]。有Meta分析表明[21]，亞洲人群中胃癌發(fā)生與miR-146aC>G(rs2910164)多態(tài)性具有相關(guān)性，而在高加索人群則不具有相關(guān)性。上述結(jié)論的不一致，可能主要與種族差異有關(guān)。

本研究顯示，miR-146a(rs2910164)G/G、C/G和C/C基因型頻率在青海回族胃癌和正常胃黏膜組織中表達(dá)無明顯差異性，意即其單核苷酸多態(tài)性與青海回族胃癌易感性沒有相關(guān)關(guān)系，不存在地域性差異。單個堿基突變有時候?qū)е峦x突變，蛋白整體功能不受影響，但是會提升其與其他蛋白、病原體或病毒的結(jié)合能力，如p53基因在單個堿基發(fā)生突變后，與病毒結(jié)合能力就有巨大的提高，導(dǎo)致個體對某種疾病的易感性就明顯提升。雖然還未明確miR-146a(rs2910164)單核苷酸突變在致病分子機(jī)制中的具體作用，但是利用分子手段進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性分析，在臨床上可對胃癌早期診斷和預(yù)測提供幫助。

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Relationship of single nucleotide polymorphisms of miR-146a(rs2910164)with the susceptibility of gastric cancerin Qinghai Hui patients

Ji Dongde1，Yang Xueying2，Wang Ronghua3，An Ling1，Li Zhenge4，Su Zhanhai5#

(1.The people′s hospital of Qinghai Province；2.Chinese Universityof Metrology；3.Qinghai University Affiliated Hospital；4.Qinghai Red Cross Hospital；5.Qinghai University Medical College)

Objective To study the relationshipofmiR-146a(rs2910164)single nucleotide polymorphismswith the susceptibility ofgastric cancer in Qinghai Hui patients.Methods 42 gastric cancer tissues and 38 normal mucosa from patientswithgastriccancerinHui ethnic peoplewere selected，the genome DNA wasisolated and miR-146a(rs2910164)genotypes G/G，G/C and C/C single nucleotide polymorphisms were analyzed by PCR-RFLP.Results The genotype of miR-146a(rs2910164)G/G，G/C，C/C in the gastric cancer group and in the control groupwere 45.2%，47.6%，7.1% and 34.2%，47.4%，18.4%，respectively.The allele frequent of G and C in gastric cancer group and in the control group were 0.69，0.31 and 0.58，0.42，respectively.The frequent of genotype and allele between gastric cancer group and control group werenot statistically different(P=0.268，P=0.300).Conclusions The single nucleotide polymorphism of miR-146a (rs2910164)is not correlated with the susceptibility of gastric cancer in Qinghai hui patients.

miR-146a(rs2910164) Single nucleotide polymorphism QinghaiHuiethnicpatientswithgastric cancer susceptibility

R735.2

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2016.02.010

2015-09-08

吉棟德(1978～)，男，漢族，青海籍，主治醫(yī)師. #：通信作者，教授，博士生導(dǎo)師，Email：suzhanhai@qhu.edu.cn