應用DNAStar軟件預測結核分枝桿菌Rv3812的抗原表位*

李江英，白雪娟，梁　艷，張俊仙，陽幼榮，趙衛國#，吳雪瓊#

1)河北北方學院 張家口 075000　2)解放軍第309醫院全軍結核病研究所；全軍結核病防治重點實驗室 北京 100091

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應用DNAStar軟件預測結核分枝桿菌Rv3812的抗原表位*

李江英1,2)，白雪娟2)，梁艷2)，張俊仙2)，陽幼榮2)，趙衛國1,2)#，吳雪瓊1,2)#

1)河北北方學院 張家口 0750002)解放軍第309醫院全軍結核病研究所；全軍結核病防治重點實驗室 北京 100091

關鍵詞抗原表位；結核分枝桿菌Rv3812；二級結構

摘要目的：預測結核分枝桿菌Rv3812蛋白的抗原表位。方法：利用DNAStar軟件包中Editseq軟件將結核分枝桿菌Rv3812氨基酸序列進行編輯保存，然后利用Protean軟件進行氨基酸序列分析，預測Rv3812蛋白的二級結構、B細胞抗原表位及T細胞抗原表位，然后再用BLAST分析其與人類抗原表位的同源性。結果：Rv3812蛋白具有豐富的二級結構和多處抗原指數較高的區段，潛在的B細胞抗原表位較少，可能位于55～68、77～99、116～120、265～280、283～294、303～326、330～337和425～435位氨基酸殘基或其附近。該蛋白潛在的T細胞抗原表位較多，可能位于6～30、55～85、97～140、159～191、202～204、208～231、251～264、270～281、287～299、311～334、337～343、349～356、368～385、394～413、428～433、437～441、470～476、479～481和488～493位氨基酸殘基或其附近。結論：Rv3812是一個T細胞抗原表位占優勢的蛋白抗原，B細胞抗原表位略少。

Prediction of epitopes of Mycobacterium tuberculosis Rv3812 protein using DNAStar software

LIJiangying1,2)，BAIXuejuan2)，LIANGYan2)，ZHANGJunxian2)，YANGYourong2)，ZHAOWeiguo1,2)，WUXueqiong1，2)

1)HebeiNorthUniversity,Zhangjiakou0750002)PLAKeyLaboratoryofTuberculosisControlandPrevention;TuberculosisResearchInstituteofPLA,No. 309HospitalofChinesePLA,Beijing100091--------------------

*國家重大傳染病防治科技重大專項基金2012ZX10003008002；軍隊醫學科技“十二·五”重點項目BWS11J050；北京市科技創新基地培育與發展工程專項Z141107004414021；解放軍第309醫院重點課題2015ZD-004

Key wordsantigen epitope;Mycobacterium tuberculosis Rv3812 protein;secondary structure

AbstractAim: To predict the epitopes of Mycobacterium tuberculosis Rv3812 protein.Methods: Using DNAStar package Editseq software to save Mycobacterium tuberculosis Rv3812 amino acid sequence for editing, and then use Protean software to carry on the amino acid sequence analysis, predicting the secondary structure, B cell epitopes and T cell epitopes of Mycobacterium tuberculosis Rv3812. Use the BLAST to analysis its homology with human antigen epitopes. Results: The Rv3812 protein had rich secondary structure and multiple sections with higher antigenicity. There were a few potential B cell epitopes at 55-68, 77-99,116-120,265-280,283-294,303-326,330-337,425-435 amino acid residues or nearby. There were also more potential T cell epitopes at 6-30，55-85, 97-140,159-191, 202-204,208-231,251-264,270-281,287-299,311-334,337-343,349-356,368-385,394-413,428-433,437-441,470-476,479-481,488-493 amino acid residues or nearby.Conclusion: Mycobacterium tuberculosis Rv3812 protein is a T-cell-epitope dominant antigen, B cell epitopes also exists but less than T cell epitopes.

結核病是由結核分枝桿菌引起的一種人畜共患傳染病，是當今嚴重危害人類健康的公共衛生問題，躋身全球十大疾病死亡原因之列。卡介苗(BCG)作為一種活性減弱的牛型結核分枝桿菌疫苗，是目前使用最廣泛的疫苗之一[1-2]。我國是全球22個結核病高負擔國家之一，同時也是全球27個耐多藥結核病和廣泛耐藥結核病流行嚴重的國家之一，年發病人數約130萬，占全球發病人數的14.3%，位居全球第2位[3-4]。因此, 開發安全高效的新型結核疫苗具有重要的社會效益。抗原表位是指抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學基團，代表了抗原分子上的一個免疫活性區，負責與抗體分子或者細胞表面的抗原受體結合而發揮免疫效應。1998年結核分枝桿菌標準株H37Rv全基因組測序的完成，使得生物信息學技術進行表位預測成為可能[5]。結核分枝桿菌Rv3812(即PE_PGRS62)基因全長1 515 bp，屬于富含甘氨酸和丙氨酸的獨特的PE蛋白家族，是膜結合蛋白，由504個氨基酸組成，相對分子質量為51 789.3，等電點為4.180 2。有研究[6-10]發現結核分枝桿菌Rv3812是T細胞抗原占優勢的蛋白，是潛在的候選T細胞抗原疫苗。作者運用DNAStar軟件對Rv3812蛋白的二級結構和B、T細胞抗原表位進行分析和預測，為進一步對Rv3812中可能作為抗原表位的多肽進行分析以及研究新型結核疫苗奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料應用DNAStar有限公司開發的生物軟件DNAStar軟件包，在計算機上進行DNA和蛋白質分析；利用DNAStar軟件包中Editseq軟件將結核分枝桿菌Rv3812氨基酸序列進行編輯保存，然后用Protean軟件對蛋白的二級結構和抗原表位進行分析和預測[11]。從NCBI網站獲取Rv3812蛋白氨基酸全長序列(504個氨基酸)，GenBank序列號NP_218329.1。

1.2Rv3812氨基酸序列與人類蛋白質的BLAST分析采用EXPASY在線軟件(NCBI BLAST2 service)對Rv3812氨基酸序列與人類蛋白質的同源性進行分析，具體方法:利用Internet 網絡進入EXPASY主頁(http://web.expasy.org/blast/)，選擇蛋白數據庫[blastp-query against the UniProt Knowledgebase (Swiss-Prot+4TrEMBL)]，選擇database (Homo sapiens)，選定Run BLAST，輸入Rv3812蛋白的氨基酸序列后進行比對。

1.3Rv3812蛋白二級結構的預測用Gamier-Robson方法[12]、Chou-Fasman方法[13]預測Rv3812蛋白的二級結構。二級結構預測方案認為β轉角、無規則卷曲結構為凸出結構,多出現在蛋白質抗原表面, 利于與抗體嵌合,較可能成為抗原表位。而α螺旋、β折疊結構規則不易形變, 較難嵌合抗體, 一般不作為抗原表位[14]。

1.4Rv3812蛋白B細胞抗原表位的預測用Kyte-Doolittle方法[15]和Hopp-Woods方法[16]預測蛋白質的疏水區和親水區，親水性指數比較高的區域暴露于表面的幾率較大，作為抗原表位的可能性也最大[17]。用Emini方法[18]預測特定區域位于蛋白質的表面可能性，即蛋白質抗原中氨基酸殘基被溶劑分子接觸的可能性，它反映了蛋白質抗原內、外各層殘基的分布情況。用Karplus-Schulz方法[19]預測蛋白質骨架區的柔韌性，柔韌性好的肽段，發生扭曲、折疊的幾率較高，能形成豐富的二級結構。用Jameson-wolf方法[20]預測潛在的蛋白質抗原決定簇，抗原性好的肽段提示含有潛在抗原表位的可能性大。最后根據Rv3812蛋白二級結構預測結果及蛋白質親水性、表面可能性、抗原性及柔韌性，綜合預測潛在優勢B細胞抗原表位。

1.5Rv3812蛋白T細胞抗原表位的預測用AMPHI方法[21]預測免疫優勢輔助性T 淋巴細胞抗原位點；用Rothbard-Taylor方法[22]預測含有特定基序(motif)的潛在T細胞抗原決定簇，最后綜合預測潛在優勢T細胞抗原表位。

2結果

2.1BLAST分析結果通過分析，發現Rv3812蛋白的氨基酸序列與人類黏蛋白/黏液素(MUC5AC)只有10.3%(52/504個氨基酸)的同源性，同源性主要位于第248～466位氨基酸殘基，這段同源性達到22%。

2.2Rv3812蛋白二級結構、B細胞抗原表位及T細胞抗原表位預測見圖1。預測Rv3812蛋白α螺旋結構形成在7～33、37～48、67～79、82～91、100～117、146～198、232～243、248～257、303～308、370～391、396～412和493～504位氨基酸殘基，共212個氨基酸，占整個氨基酸序列的42%；β折疊在1～8、46～55、61～65、96～102、120～129、131～136、199～217、220～226、259～300、325～333、337～369、413～425、432～443、446～450、453～460、465～484和486～494位氨基酸殘基，共222個氨基酸，占整個氨基酸序列的44%。在各β折疊單元之間存在β轉角和無規則卷曲，其中β轉角在34～37、56～59、65～69、81～84、92～95、116～119、137～139、142～145、218～221、228～231、244～247、267～270、290～293、314～317、320～323、334～337、390～393、408～411、424～431、433～436、443～446、450～453和460～463位氨基酸殘基，共96個氨基酸，占整個氨基酸序列的19%；在34～36、59～60、140～145、227～230、312～315、332～336和428～431位氨基酸殘基存在無規則卷曲，共28個氨基酸，占整個氨基酸序列的5%。

2.3Rv3812蛋白的親水性分析Rv3812蛋白存在的低親水性區域主要位于25～27、77～83、103～107、129～135、137～141、144～146、151～153、303～312、382～384和429～431位氨基酸殘基，高親水性區域主要位于55～65、85～99、155～159和318～324位氨基酸殘基，總共有94個氨基酸，占整個氨基酸序列的19%，其中高親水性的氨基酸占整個氨基酸序列的8%。Rv3812蛋白存在較多的疏水性區域，并且疏水性程度較高，高疏水性區域主要位于1～24、31～54、108～118、160～196、199～229、233～236、238～243、246～248、250～255、258～267、272～282、339～381、291～302、390～405、418～428和434～504位氨基酸殘基；低疏水性區域主要位于100～102、121～126、147～150、313～317、328～333、385～388和407～416位氨基酸殘基，總共有394個氨基酸，占整個氨基酸序列的78%，其中高疏水性的氨基酸占整個氨基酸序列的70%。

圖1　結核分枝桿菌Rv3812蛋白二級結構和抗原表位預測

2.4Rv3812蛋白的表面可能性分析Rv3812的表面可能性較大的區域主要位于24～26、57～62、88～92、128～131、154～157、283～285、304～309、320～324、332～333、335～336、383～384和431～432位氨基酸殘基，其他部位展示的可能性較小或表現為負值，共44個氨基酸，約占整個氨基酸序列的8%。

2.5Rv3812蛋白柔韌性分析Rv3812蛋白含有的柔韌性區域主要位于22～27、34～38、57～68、79～82、90～98、102～107、117～120、128～133、204～207、216～222、265～280、284～294、319～326、330～336、347～353、380～385、418～421、425～435、461～463和468～473位氨基酸殘基，共142個氨基酸，約占整個氨基酸序列的28%。

2.6Rv3812蛋白抗原性分析Rv3812蛋白含有的抗原性區域主要位于25～32、 44～50、 56～66、79～87、 89～98、103～110 、118～121、267～274、284～295、315～327、333～339、381～387和426～436位氨基酸殘基，共118個氨基酸，約占整個氨基酸序列的23%。

2.7Rv3812蛋白B細胞抗原表位的預測分析通過以上預測的Rv3812蛋白的二級結構的轉角區、無規則卷曲區、蛋白質親水性、表面可能性、柔韌性及抗原性，得到B細胞潛在優勢抗原表位主要位于55～68、77～99、116～120、265～280、283～294、303～326、330～337和425～435位氨基酸殘基或其附近，共113個氨基酸，約占整個氨基酸序列的22%。

2.8Rv3812蛋白T細胞抗原表位的預測分析用AMPHI方法和Rothbard-Taylor方法預測的T細胞潛在優勢抗原表位主要位于6～30、55～85、97～140、159～191、202～204、208～231、251～264、270～281、287～299、311～334、337～343、349～356、368～385、394～413、428～433、437～441、470～476、479～481和488～493位氨基酸殘基或其附近,共303個氨基酸，約占整個氨基酸序列的60%。

3討論

綜合運用生物信息學的技術方法對蛋白質的相關信息進行分析、處理、模擬和預測，最終預測抗原表位的模式，已為越來越多的研究者所采用[23-24]。因為這樣的研究方式可以減少實驗的盲目性，加強實驗的目的性，大大提高實驗的成功率[14]。而開發結核感染相關抗原表位，為深入研究結核感染機制、發現新的結核感染診斷標志物及獲取有效的表位疫苗奠定了基礎[25]。

該研究通過BLAST分析，發現Rv3812蛋白的氨基酸序列與人類蛋白質的同源性很低，不會誘導產生免疫性疾病。與黏蛋白/黏液素(MUC5AC)同源性雖然很低，但在第248～466位氨基酸殘基上有22%的同源性，因此，在抗原表位設計、合成時需注意這些同源性區域，以獲得交叉反應性低的、特異性的抗原表位。

該研究運用生物信息學技術對Rv3812蛋白的B細胞抗原表位進行預測，從該蛋白的二級結構、親水性、表面可能性、柔韌性及抗原指數等方面進行分析，Rv3812蛋白α螺旋和β折疊結構數量較多，分別占整個氨基酸序列的42%和44%；在各β折疊單元之間存在β轉角較多，占整個氨基酸序列的19%；但無規則卷曲相對較少，占整個氨基酸序列的5%，預示該蛋白可能含有相對較少的B細胞抗原表位；該蛋白親水性多肽也較少，占整個氨基酸序列的19%，而高親水性氨基酸只占8%；疏水性多肽較多，占整個氨基酸序列的78%，其中高疏水性氨基酸占比高達70%，設計表位時應注意這些區域。該蛋白含有的表面可能性區域很少，只占整個氨基酸序列的8%，說明形成表位的可能性較小；該蛋白含有的柔韌性區域較少，占整個氨基酸序列的28%，說明形成表位的可能性較小，不容易與抗體進行結合；該蛋白含有的抗原性區域也較少，占整個氨基酸序列的23%，提示可能成為表面抗原的多肽較少。綜合分析得到潛在B細胞表位相對較少，占整個氨基酸序列的22%。由于考慮的方面較多，DNAStar軟件預測的B細胞表位相對準確性較高。但DNAStar軟件是在氨基酸一級結構的基礎上應用多個參數預測B細胞抗原表位，忽略了各氨基酸之間的分子作用力，因此，對構象依賴的B細胞表位的預測有一定局限性。為進一步確認新發現的B細胞線性表位，該研究通過人工方法合成Rv3812相應的B細胞線性表位多肽并進行免疫學驗證，例如酶聯免疫吸附試驗(ELISA法)[26]，由于多肽抗原相對分子質量太小而不能產生顯著的免疫反應，為此，常將多肽抗原偶聯到牛血清白蛋白(BSA)、血藍蛋白(-KLH)等較大的蛋白載體上，以期獲得更高的免疫原性[27]。

該研究用DNAStar軟件的AMPHI方法和Rothbard-Taylor方法預測結核分枝桿菌Rv3812蛋白T細胞潛在的優勢抗原表位較多，占整個氨基酸序列的60%，是一個T細胞占優勢的蛋白。Chaitra等[10，28]預測并進行鑒定的抗原表位有61～69、260～268和490～498位氨基酸殘基， 61～69位氨基酸殘基在該作者預測的55～85位氨基酸殘基范圍內，260～268位氨基酸殘基中的260～264在作者預測的251～264位氨基酸殘基上，265～268在作者預測的251～264位氨基酸殘基的附近位置上，490～498位氨基酸殘基中的490～493在作者預測的488～493位氨基酸殘基上，484～498在作者預測的488～493位氨基酸殘基的附近位置上。作者與Chaitra等預測的表位有些微差異，產生差異的原因可能是DNAStar軟件預測T細胞表位考慮的因素較少，預測的準確性不一定高，導致有的優勢表位未能預測到，也可能是由于機體內免疫應答機制的復雜性，表位預測還不能完全反應體內的實際情況。因此，作者將聯合應用SYFPEITHI 軟件(http://www.syfpeithi.de)、BIMAS 軟件(http://www-bimas.cit.nih.gov)和NetCTL軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/)進一步預測T細胞表位，以提高預測的準確度和特異性，然后再合成多肽表位做進一步的體外驗證試驗。例如T細胞表位可通過T 細胞增殖性試驗、細胞殺傷實驗、流式細胞技術、ELISPOT技術等鑒定。

總之，該研究結果顯示，結核分枝桿菌Rv3812蛋白是一個T細胞抗原表位占優勢的蛋白抗原，所含的潛在B細胞抗原表位較少，預測結果將為該蛋白的免疫學特性研究及其應用奠定理論基礎。

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中圖分類號R378.91+1

#通信作者，吳雪瓊,女，1963 年7月生，博士，研究員，研究方向：新型疫苗、診斷技術和新藥的研究；E-mail: wu-xueqiong@263.net；趙衛國,男，1966年1月生，博士，教授，研究方向：結核分枝桿菌的快速診斷,E-mail:zhaowg309@163.com

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.02.007