黑曲霉尿酸氧化酶基因克隆及在大腸桿菌中的表達

盧葦,榮俊 (長江大學生命科學學院,生物醫藥研究所,湖北荊州434100)匡紅艷 (長江大學生物醫藥研究所,長江大學臨床醫學院,湖北荊州434000)余知和 (長江大學生命科學學院,湖北荊州434100)

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黑曲霉尿酸氧化酶基因克隆及在大腸桿菌中的表達

盧葦,榮俊 (長江大學生命科學學院,生物醫藥研究所,湖北荊州434100)
匡紅艷 (長江大學生物醫藥研究所,長江大學臨床醫學院,湖北荊州434000)
余知和 (長江大學生命科學學院,湖北荊州434100)

[摘要]目的:為大量生產醫用尿酸氧化酶,對一個黑曲霉菌株的尿酸氧化酶基因進行了克隆和在大腸桿菌中的異源表達。方法:基因測序結果顯示,克隆的黑曲霉尿酸氧化酶基因全長為909bp,編碼302個氨基酸殘基。SDS-PAGE和非變性電泳分析結果顯示,單體酶分子量在35～37kDa之間；表達過程中酶蛋白分子自我組裝成4聚體蛋白,聚合體蛋白的表觀分子量為140～150kDa。結果:酶蛋白在大腸桿菌細胞液中表達,產物幾乎完全以水溶狀態存在,最佳溶解pH為8.0。最佳酶促反應溫度為35℃。經過誘導表達后的菌體,按照1∶20(質量/體積)比例重懸于最優緩沖液中,進行超聲波破碎后,粗酶液活力為67.69IU/mL,比活性為47.00IU/mg。結論:提供了一個微生物來源尿酸氧化酶新的獲取方法。

[關鍵詞]尿酸氧化酶；黑曲霉；表達；最佳溶解pH；最適反應溫度

[引著格式]盧葦,榮俊,匡紅艷,等.黑曲霉尿酸氧化酶基因克隆及在大腸桿菌中的表達[J].長江大學學報(自科版),2016, 13(6):1～6.

尿酸氧化酶(UrateoxidaseorUricase,EC.1.7.3.3)是大多數生物體內普遍存在的一種酶,它能催化尿酸氧化成為尿囊素和過氧化氫。人和猿類在進化過程中發生了尿酸氧化酶基因沉默,體內缺乏有活性尿酸氧化酶[1,2]。人和猿類以尿酸作為嘌呤代謝的最終產物,如果嘌呤分解增多產生過量的尿酸,或者尿酸排泄障礙,都會導致血液中的尿酸濃度升高形成高尿酸血癥,長時間尿酸過高就會導致痛風[3,4]。尿酸氧化酶可用于高尿酸血癥、腫瘤溶解綜合征和痛風等的治療[5,6],也可用于血尿酸檢測試劑盒的制備[7,8],是一種用途極其廣泛的醫藥用酶制劑。現在已有多種不同來源的尿酸氧化酶得到了制備或表達[9,10],這些酶的物理化學性質有較大差異。哺乳動物來源的尿酸氧化酶,在pH7.0～7.4條件下難以溶解[11],酶的活力相對較低。微生物分解尿酸能力強,在生理pH條件下溶解度較高[12],是尿酸氧化酶的重要來源。近年來制備微生物來源的尿酸氧化酶,包括真菌、酵母和細菌,成為研究人員關注的重點[13]。為獲得廉價且物理化學性質更優的尿酸氧化酶制劑,我們用本實驗室分離的黑曲霉菌株為基因來源,克隆了黑曲霉尿酸氧化酶基因,并用該基因高效表達出了重組黑曲霉尿酸氧化酶(recombinant AspergillusnigerUrateoxidase,rANUO)。

1　材料與方法

1.1試劑

TransScriptFirst-StrandcDNASynthesisSuperMix,Trans1-T1PhageResistentChemicallyCompetent cell,E.coliBL21(DE3)感受態細胞,T4DNALigase均為北京全式金生物技術有限公司產品；Trizol試劑為Invitrogen產品；原核表達載體pET28a為本實驗室保存；DNA凝膠回收試劑盒、小量質粒抽提試劑盒均為Axygen公司產品；pMD18-T Vector,TaKaRa(大連)產品；限制性內切酶HindⅢ、NcoⅠ-HF為NewEnglandBiolabs產品。黑曲霉(Aspergillusniger)由本實驗室分離并保存。

1.2 儀器

Bio-radGelDocEZImager(美國Bio-rad公司產品)；Mini-proteanTetraSystem(美國Bio-rad公司產品)；PowerPacBasic(美國Bio-rad公司產品)；Centrifuge5430R恒溫離心機(德國eppendorf公司產品)；IS-RDD3恒溫振蕩器(美國crystal公司產品)；UV-2450紫外分光光度計(日本島津shimadzu公司產品)；WD-9403B紫外儀(北京六一儀器廠產品)；SPX-250B-Z生化培養箱(上海博訊公司產品)。

1.3方法

1)黑曲霉培養基的配制與黑曲霉的培養 以尿酸為唯一氮源的液體培養基的配制方法:KH2PO41g、Na2HPO41.5g、MgSO4·7H2O0.2g、KCl0.5g、FeSO40.01g、甘油10g、尿酸1g,加水定容至1L,121℃滅菌20min,冷卻至室溫。取500mL培養基,用接種環接入少量黑曲霉,置28℃, 250rpm,震蕩培養5d。

2)黑曲霉尿酸氧化酶基因的RT-PCR擴增 將上述在以尿酸為唯一氮源的液體培養基中培養出的黑曲霉菌置于12000rpm,10min,4℃離心,棄上清,將沉淀的菌團用液氮冷凍,再用研缽研成粉末,用Trizol試劑提取總RNA。以總RNA為模板,用Oligod(T)18作引物,用TransScriptFirst-StrandcDNA SynthesisSuperMix進行逆轉錄,溫度參數:42℃60min；85℃5min,得cDNA。

根據GenBank公布的序列(ACCESSION:XM_001399702)設計引物,上游引物5’-CCCATGGGCTCT TCCCCAGTTACTGCGGCCCGC(下劃線為NcoⅠ識別序列),為了使NcoⅠ限制酶切位點完整,在起始密碼子后添加了一組編碼甘氨酸的密碼子GGC。下游引物5’-AAGCTTCTACAGCTTCGTGT TGCGACC(下劃線為HindⅢ識別序列)。上、下游引物由上海生物工程有限公司合成。以cDNA為模板進行PCR擴增,溫度循環參數:94℃5min；94℃45s,58℃45s；72℃60s,35個循環；72℃10min。用DNAGelExtractionKit回收擴增產物,與pMD18-Tvector連接。用連接產物轉化Trans1-T1 PhageResistentChemicallyCompetentcell,用小量質粒抽提試劑盒提取陽性轉化菌質粒DNA,命名為:pMD18-T-rANUO。同時將陽性菌送上海生物工程有限公司測序。

3)原核表達載體的構建 將pMD18-T-rANUO用HindⅢ,NcoⅠ分步酶切,回收酶切產物。再與經過同樣酶切處理的pET28a表達質粒載體連接,重組質粒命名為pET28a-rANUO。該表達質粒的構建方式刪除了pET28a質粒載體上的全部標簽,可用來構建無標簽的基因表達工程菌。用該表達質粒轉化E.coli.BL21(DE3)感受態細胞,經PCR鑒定為陽性的轉化菌命名為E.coliBL21(DE3)/ pET28a-rANUO。

4)rANUO的誘導表達 將E.coliBL21(DE3)/pET28a-rANUO,接種于25mL含卡那霉素的LB液體培養基中,200rpm,37℃,培養過夜。取飽和菌液按2%比例,接種于1000mL含卡那霉素的LB液體培養基中,200rpm,37℃培至OD600的值約0.8時,加0.6mol/L乳糖至終溶度為24mM,誘導培養6h收菌。10000rpm,4℃,離心20min,棄上清培養液收菌體并稱重。

5)rANUO提取pH條件的篩選 將誘導表達的濕菌體按1∶20(W∶V)比例分別加入pH6.0、7.0、7.4、8.0的0.1M磷酸緩沖液,和pH9.0和10.0的0.1M碳酸緩沖液。破菌時的緩沖液體積相當于培養基體積的1∶10。充分重懸菌體后,置于冰浴中用超聲波破菌。破菌條件為功率200W,工作時間5s×150次,間隙時間10s。破菌完成后,置4℃,10000rpm離心10min,離心后取上清測定表達酶活力。

6)rANUO活性測定及蛋白含量分析 尿酸氧化酶活力測定方法及活力單位定義參照Koyama 等[14]的方法進行。在25℃條件下,以尿酸濃度120μmol/L1pH8.4,0.2mol/L硼酸緩沖液為反應底物,取3mL底物于4mL石英比色皿中,加入適量重組黑曲霉尿酸氧化酶粗酶液,充分混勻后準確讀取293nm波長處反應5min起始和終止的光密度值,計算酶活力單位。活力單位定義:該條件下每分鐘催化分解1μmol尿酸所需的酶量為1.0個單位(IU)。酶活性計算公式為:

IU/mL=(ΔA×VT×df)/(12.2×VE)。

式中,IU/mL為每mL尿酸氧化酶活力單位數；ΔA為25℃,反應5min,在293nm波長下光密度的下降值；VT為反應液總體積(mL)；df為稀釋倍數；12.2為尿酸在293nm波長下的微摩爾消光系數；VE為加入的粗酶體積(mL)。

蛋白含量測定用Bradford法進行。

7)rANUO的誘導表達產物的電泳檢測 將5)中pH8.0的破菌液和離心后的上清液進行SDS-PAGE檢測(15%)和非變性電泳(8%)檢測,鑒定蛋白的表達量及分子量大小。

8)rANUO最佳作用溫度測定 按照5)中pH8.0的磷酸緩沖液提取粗酶液的方法制備粗酶液,取1μL酶液,加到上述酶活性測定用底物液中,分別置于25、30、35、37、40、45℃水浴反應5min,測定A293光吸收值變化(ΔA293),將ΔA293值最大時的酶活力定義為相對活力100%,計算不同溫度條件下的相對催化活力。

2　結果

2.1rANUO基因的RT-PCR擴增

rANUO基因的RT-PCR擴增產物的電泳檢測結果見圖1。由圖可見基因擴增的DNA片段略小于1000bp,與引物設計產物的理論值920bp預期值相符。

圖1　rANUO基因的RT-PCR擴增結果

2.2rANUO基因序列測定與分析

PCR產物與pMD18-Tvector連接后轉化Trans1-T1PhageResistentChemicallyCompetentCell。將PCR鑒定正確的轉化菌送交上海生物工程有限公司進行DNA序列測定。序列測定結果如下:

CCATGGGCTCTTCCCCAGTTACTGCGGCCCGCTACGGCAAGGACAATGTCCGAGTATACAAGGTCCACCGTG ATGAGAAGACCGGCGTCCAGACGGTCGTGGAGATGACCGTGTGCGTCCTTTTGGAGGGTGACATCGACACC TCCTACACCAAAGCCGACAACAGCGTCATTGTCGCAACCGACTCCATCAAGAACACCATCTACATCACCGCC AAGCAAAATCCCGTCACTCCCCCCGAGCTCTTCAGCTCCATTCTTGGAAGCCACTTCATCACCAAGTACAAC CACATCCACGCCGCCCATGTCAACATCATCACCCACCGCTGGACCCGTATGACCATCGACGGCAAGCCGCAC CCGCACTCCTTCCTCCGGGATGGCGAGGAAACCCGCAACGTGCAGGTCGATGTCGTCGAGGGCAAGGGTGT TGACATCACGTCGTCTCTGGCCAAGTTGACTGTGCTGAAGAGCACCAACTCGCAGTTCTGGGGCTTCCTGC GCGACGAGTACACCACACTCCCTGAGACATGGGATCGTATTCTCAGCACCGATGTCGACGCCAGCTGGCAG TGGCGCCGGTTCAGCGGGCTGGACGAGGTGCGCGCTACTGTGCCTCATTTCGATGCGACCTGGGCGGCGGC CAGGGATATCACCCTTAAGACCTTTGCCGAGGACAACTCGGCTAGTGTGCAGAACACTATGTACAAGATG GCGGAGCAGATCCTGGCTCGTCAGTCCTTGCTCGAGACGGTCGAGTACTCTCTGCCTAACAAGCACTACTT TGAAGTTGACCTGAGCTGGCACAAGGGCCTGAAGAACACCGGCAAGGACGCTGAGGTGTATGCGCCGCAG ACCAACCCGAACGGGCTGATCAAGTGCACGGTTGGTCGCAACACGAAGGCGAAGCTGTAGAAGCTT

結果顯示,除去人工加入的一組甘氨酸密碼子外,rANUO基因cDNA的ORF全長909bp,編碼302個氨基酸殘基。經Blast檢索,相似性最高的序列是AspergillusnigerCBS513.88,在GenBank上的注冊號是XM_001399702,二者間的同源性為99%。在第22位氨基酸殘基的密碼子由CGC變為CGT,23位密碼子由GAC變為GAT,30位密碼子由ACA變為ACG,第36位密碼子由GTC變為GTG,第52位密碼子由GAT變為GAC,第63位密碼子由AAA變為AAG,第277位密碼子由GCC變為GCT,上述密碼子的變異均未造成氨基酸編碼的變化。但是,在第82位密碼子由GGC變為AGC造成編碼氨基酸由甘氨酸變為絲氨酸；第215位密碼子由GAA變為GAT造成編碼氨基酸由谷氨酸變為精氨酸。根據編碼氨基酸的變化,可以推斷表達蛋白的水溶性會有輕微提高,編碼蛋白的等電點也會稍有提高。

2.3rANUO的提取pH條件的選擇與粗酶的活性測定結果

將經過誘導表達后的工程菌分別用不同pH (6.0、7.0、7.4、8.0、9.0、10.0)的緩沖液重懸濕菌體并進行超聲波破菌,離心后取上清測定酶活性。結果見圖2。由圖2可見,rANUO在0.1M,pH8.0的磷酸緩沖液中活性最高。將誘導表達的工程菌濕菌體按照1∶20的比例重懸于pH8.0,0.1mol/L 的PB中,破菌后的上清蛋白含量約1.44mg/mL,酶活性為67.69IU/mL。比活力為47.0IU/mg。用pH7.4的磷酸緩沖液提取的粗酶活力為55.79IU/mL,達到了最高活力的82.4%。

圖2　pH對rANUO溶解的影響

2.4SDS-PAGE電泳(15%)和非變性電泳(8%)檢測rANUO表達蛋白

E.coliBL21(DE3)/pET28a-rANUO誘導表達后的SDS-PAGE檢測結果見圖3。可見rANUO蛋白分子量在31～43kDa之間。推斷實際單體酶的分子量應該35～37kDa之間。在表達產物的上清和全菌中都有十分明顯表達蛋白條帶。說明該表達蛋白能夠很好的溶解在pH8.0,0.1mol/L的PB中。用BioRadGelDocXR凝膠成像分析系統中的QuantityOne1-D軟件分析SDS-PAGE電泳圖,結果顯示rANUO表達量占全菌可溶蛋白總量的36.6%。未誘導工程菌上清蛋白中未檢測出明顯的表達蛋白條帶。

非變性電泳(8%)檢測結果見圖4。由圖可見,誘導后的E.coliBL21(DE3)/pET28a-rANUO表達產物的上清和全菌中都有十分明顯表達蛋白帶,分子量大于130kDa且小于170kDa。推斷該表達蛋白自我裝配成4聚體蛋白。表觀分子量應為140～150kDa。

圖3　E.coliBL21(DE3)/pET28a-rANUO表達產物的SDS-PAGE分析(15%)

圖4　E.coliBL21(DE3)/pET28a-rANUO表達產物的非變性電泳分析(8%)

2.5rANUO最佳酶促反應溫度的測定結果

用pH8.0的0.1M磷酸緩沖液抽提rANUO,在不同溫度條件下測定其在5min時間內相對催化活力,結果見圖5。由圖可見,在溫度為35℃時相對活力最高,溫度在30～40℃之間rANUO的差異并不大,但是在45℃有較大幅度的下降。

3　討論

高尿酸血癥和痛風是現代人類最常見的代謝病之一。在臨床上,尿酸氧化酶可用于痛風、高尿酸血癥和腫瘤溶解綜合征等的治療,還能用于血尿酸檢測試劑盒的生產或制備。因此有較好理化性狀且低成本的尿酸氧化酶的制備開發非常重要。在我們檢索的文獻中只有直接用天然黑曲霉制備尿酸氧化酶的報道[15],而未見用大腸桿菌工程菌制備尿酸氧化酶的文獻。直接用黑曲霉制備尿酸氧化酶需要較長的培養時間,生產成本也相對較高。為此我們用本實驗室分離的一株黑曲霉為模板克隆了尿酸氧化酶基因,并且構建了一個以大腸桿菌為宿主的高效表達工程菌。其構建過程和表達產物有如下特點。

圖5　溫度對rANUO活性的影響

構建之初我們用普通黑曲霉培養基進行黑曲霉培養、RNA提取和RT-PCR,但總是不能克隆出rANUO基因。以后我們設計了一個以尿酸為唯一氮源的培養基對黑曲霉進行培養,然后用此培養物進行總RNA提取和RT-PCR,成功克隆出了黑曲霉尿酸氧化酶基因。這說明尿酸氧化酶在這株黑曲霉中是一種完全靠誘導產生的酶。在有充足的其它氮源時尿酸氧化酶基因不被轉錄,只有當尿酸成為其唯一氮源時才得以轉錄。

該表達工程菌能高效表達尿酸氧化酶,其表達量占菌體可溶蛋白總量的36.6%。表達的rANUO 在pH8.0,0.1mol/L的PB中能很好的溶解并有較高的酶活力。以1∶20的質量/體積比進行菌體重懸和破菌后的粗酶液活力為67.69IU/mL,比活性為47.00IU/mg。因為破菌時的緩沖液體積相當于培養基體積的1∶10,所以本實驗的表達菌活力相當于6.77IU/mL培養基。Ali等[15]用Aspergillusniger Thom&Raper1945株中制備的尿酸氧化酶活力為2.139IU/mL培養基,Aspergillusnigervan Tieghem1867菌株活力為2.456IU/mL。AliUF進行酶活力測定的溫度為30℃,較本研究的25℃為高。因此,我們構建的表達工程菌的尿酸氧化酶得率至少要高1倍以上。文獻報道的其它微生物來源尿酸氧化酶中,活性測定條件相同的有Koyama等[14]報道的產朊假絲酵母(Candidautilis)尿酸氧化酶的大腸桿菌表達工程菌。他們報道的尿酸氧化酶破菌粗提液的活力為6.1IU/mL培養基,比活力為25IU/mg,表達量為細胞可溶蛋白總量的20%。相比之下,本研究單位體積培養基生產的尿酸氧化酶總活力,比活力和目的蛋白表達量占可溶蛋白總量的比例都更高。本法制備的酶在pH7.4～8.0的條件下能較好的溶解。其溶解性狀明顯優于哺乳動物來源的尿酸氧化酶pH10以上的溶解pH[11]。

根據rANUO粗酶的SDS-PAGE和非變性電泳結果檢測分析,可以推斷rANUO是由4個分子量約為36kDa的單體聚合而成。其表觀分子量為144kDa左右。

Ali等報道了用2株黑曲霉菌株直接生產尿酸氧化酶的最佳pH和最佳溫度[15]。Aspergillusniger Thom&Raper1945株的最佳pH為9.0,最佳溫度為45℃。AspergillusnigervanTieghem1867株最佳pH為8.0,最佳溫度為35℃。本研究用基因工程菌表達rANUO,采用的生產條件等同于大腸桿菌的表達條件,也即pH7.0和37℃的培養條件。我們對表達出來的rANUO的最佳溶解pH和最佳酶促反應溫度進行了測定。結果是rANUO的最佳溶解pH為8.0,相對活力最高的溫度為35℃。該結果與AspergillusnigervanTieghem1867株的結果完全吻合。由此我們可以得出如下推斷,不同黑曲霉菌株的尿酸氧化酶酶促反應特性不同。根據AliUF的報道,至少有2種不同的特性。本實驗室分離的黑曲霉所表達的尿酸氧化酶與他們報道的AspergillusnigervanTieghem1867株有相似的生化特性。

總之,我們研究了1株黑曲霉尿酸氧化酶基因的克隆和原核表達,表達的rANUO有較好的理化形狀和較高的生產率,為獲得尿酸氧化酶提供了一個新的途徑。

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[編輯] 方多

[作者簡介]盧葦(1988—),女,碩士生,主要從事醫藥生物工程學習與研究工作;通信作者:榮俊,E-mail:496281344@qq.com。

[基金項目]國家自然科學基金項目(31570022)。

[收稿日期]2015—11—12

[中圖分類號]R34

[文獻標志碼]A

[文章編號]1673—1409(2016)06—0001—06