基于反向對接法的大黃酸抗炎作用的分子機制研究*

徐佑東　張艷　孟憲麗　曾勇　王平

(成都中醫藥大學，四川 成都　611137)

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論著

基于反向對接法的大黃酸抗炎作用的分子機制研究*

徐佑東張艷孟憲麗曾勇王平△

(成都中醫藥大學，四川 成都611137)

摘要目的：利用反向對接技術以大黃酸為研究對象篩選出大黃酸的炎癥靶標蛋白。方法：獲取Toll樣受體/核因子(4TLR4/NF-κB)、p38促分裂原活化蛋白激酶(P38 mitogen-activated protein kinases，P38 MAKP)和Janus激酶-信號轉導轉錄激活因子(Janus kinase 2/ signal transducer and activator of transcription 3，JAK2/STAT3)3條炎癥通路上的30個蛋白的晶體學結構以及大黃酸的化學結構；利用AutoDockTools對所有晶體學結構進行標準化處理；通過AutoGrid對靶標蛋白的活性位點進行計算；利用AutoDock對大黃酸進行反向對接模擬實驗；對得到的對接結果進行篩選，根據對接自由能的高低，篩選出親和力高的靶蛋白；對篩選得到的靶蛋白進行作用力分析并作圖。結果：反向篩選得到3個與大黃酸具有高親和性的靶蛋白，分別為P38、PI3Kγ、JAK2。結論：大黃酸是通過抑制P38、PI3Kγ、JAK2靶蛋白，進而阻礙炎癥信號傳遞，影響下游蛋白的表達，發揮抗炎作用。

關鍵詞：大黃酸；分子對接；JAK2/STAT3通路；NF-κB通路；炎癥；AutoDock

大黃酸為中藥大黃Rheum palmatum L.蒽醌衍生物中的活性成分，具有顯著抗炎作用[1]。大量研究顯示大黃酸能通過TLR4/NF-κB信號通路抑制NF-κB轉錄[2]，并且其還可以顯著下調LPS誘導的iNOS mRNA的表達水平，降低LPS所誘導的IL-1β、IL-6、IL-8表達量升高[3-5]。雖然大黃酸抗炎機制得到一定進展，但是大多數研究還停留在動物以及細胞階段，僅通過蛋白表達量以及抑制率的高低來評價大黃酸的抗炎效果。而大黃酸是競爭性抑制了上述蛋白發揮了抗炎作用，還是與細胞膜表面受體(TLR4、TNFR)或細胞內的信號蛋白(NF-κB、TAK1、MyD88、IKKγ等)競爭性結合，從而阻斷信號通路，抑制下游炎癥細胞因子表達卻知之甚少。因此，有必要在分子水平上對大黃酸進行深入的探究。

在炎癥應答過程，TLR4/NF-κB信號通路涉及到多條信號通路的共同參與完成，并且信號通路間相互協同作用，增強炎癥的表達。其中，TLR4/NF-κB信號通路、JAK激酶2/信號轉導和轉錄激活因子3(Janus kinase 2/ signal transducer and activator of transcription 3，JAK2/STAT3)以及P38絲裂原激活蛋白激酶(P38 mitogen-activated protein kinases，P38 MAKP)在炎癥應答過程中不但起著重要作用而且彼此間聯系緊密。實驗顯示，NF-κB的活化將誘導一氧化氮合成酶(Inducible nitric oxide synthase，iNOS)、環氧酶2(Cyclooxygenase-2，COX-2)、金屬基質螯合蛋白酶(Matrix metallopeptidase 9，MMP-9)的表達[6-9]。在LPS刺激下，P38蛋白被激活將遷移進入細胞核調控NF-κB的表達，使NF-κB介導的下游蛋白表達增加[10]。另外，JAK2/STAT3信號通路也能通過PI3K/PDK1/Akt 通路來調控NF-κB的表達，同樣TLR4/NF-κB信號通路也可以利用PI3K/Akt/mTOR通路與STAT3協同作用，促進IL-6、IL-10、IL-11、IL-18、IL-21、IL-23、IL-27等炎癥因子活化[11,12]。因此，完整的大黃酸的抗炎實驗需要進行多個蛋白的活性抑制實驗，從而獲得詳盡蛋白活性抑制信息。

目前，證明配體與靶蛋白相互作用的最直接的手段主要包括：蛋白晶體學解析、蛋白熒光猝滅以及分子反向對接技術[13-15]。蛋白晶體學解析對蛋白純化要求極高而且成本昂貴，因此只能對單個明確的靶蛋白展開研究。熒光淬滅實驗，雖然對蛋白要求較低，但是若進行多靶標蛋白的驗證，將會導致實驗周期過長，實驗量增大，從而導致實驗成本過于高昂。

反向對接技術是目前較為準確的靶蛋白篩選手段，該技術以分子對接技術作為基礎，以單一或者多個配體作為研究對象，對大批量的蛋白進行對接篩選，再根據對接能量高低排序并分析，找出潛在的靶標蛋白。該技術手段已經得到廣泛運用[16]，為藥物的重新定義以及藥物設計做出了巨大貢獻。因此在進行實驗之前，首先運用分子反向對接技術篩選出潛在的靶標蛋白(反向對接技術[17,18])，選取具有較高親和力的靶標蛋白，再對這些蛋白進行蛋白水平實驗，這樣可以減少實驗所需靶標蛋白數量提高實驗效率，同時也能在保證可信度的基礎上降低實驗成本。

基于此思路及結合大黃酸抗炎機理的研究現狀，本文利用反向對接技術，對炎癥通路相關的30蛋白進行反向對接，以篩選出大黃酸抗炎作用的直接作用靶蛋白，并對大黃酸與靶標蛋白間相互作用進行分析，以期探究大黃酸抗炎作用的分子機制，并為以大黃酸為母核的新型抗炎先導化合物的結構設計提供相關方向。

1材料與方法

本實驗以TLR4/NF-κB、P38、JAK2/STAT3炎癥通路上30個蛋白為研究對象(相關蛋白詳見表1)，所有蛋白的晶體結構均從RCSB Protein Data Bank(PDB)上下載并保存為PDB格式。晶體結構中的所有雜原子、結晶水以及本身結構解析時所攜帶的配體全部去除，并添加極性氫，計算高斯電荷。以上所有優化過程均在AutoDock Tools-1.5.6rc3軟件上完成。

大黃酸的化學結構從PubChem上獲取，文件保存為3D SDF格式。配體結構通過Swiss-PDB Viewer V.4.02中的GRO-MOS96模塊進行MM-2能量優化。

將上述處理的蛋白受體作為大黃酸(配體)反向對接與虛擬篩選的酶靶。在模擬過程中，配體允許自由旋轉。AutoGrid模塊利用對應配體原子(C，N和O)的探針原子在靶點蛋白的活性區域進行探測并生成勢能圖。AutoDock選擇拉馬克遺傳算法(Lamarckian genetic-algorithm，GA)來模擬計算配體與靶點蛋白活性位點間的親和力。對接過程選用半柔性對接，運行次數為100次，最大能量評價為5000000，種群數量為150，其余參數采用默認值。

最后，選用PyMOL1.5.0.4(Python molecule，PyMOL)與LigPlot+進行實驗結果分析。

2結果

2.1對接方法的檢驗

為了檢驗對接方法的可靠性，選取4個晶體結構(PDB ID:2B7A,3HR4，3UVQ，4EZJ)進行重復對接實驗。對接結果顯示，配體對接的構象與原晶體結構上配體構象相似，并且根據檢驗標準，重復對接實驗的RMSD值均小于2.0?，說明重復對接實驗是成功的，對接方案是可信的。

(A)2B7A

(B)3HR4

(C)3UVQ

(D)4EZJ圖1　重復對接結果注：藍色的配體為晶體結構上的原配體，黃色配體為重復對接構象，兩個構象疊合對比顯示。

2.2大黃酸反向對接結果

大黃酸與3條炎癥通路靶標蛋白的對接結果顯示，大黃酸對蛋白激酶具有更高的親和力，尤其是對P38、PI3Kγ(PDB ID：3UVQ、4EZJ)的ATP催化位點的結合能力最強，對接自由能分別為：-9.05、-9.01 kcal·mol-1，抑制常數分別為250.48、230.75 nM·L-1。另外，大黃酸與JAK2(PDB ID：2B7A)靶點蛋白的結合能力稍弱，自由結合能為：-8.08 kcal·mol-1,抑制常數為1.19 μM·L-1。

表1　大黃酸與炎癥靶標蛋白對接數據

注：*：I類構象為最優構象相似的對接結果，相似構象間的能量差異不大于-1 kcal·mol-1；△：對接自由能反應了配體與蛋白之間的親和力，對接自由能越低，親和力越高。

此外，大黃酸對TAK1(PDB ID：2EVA)、IA型PI3K蛋白激酶家族(PI3Kα：4JPS，PI3Kβ：4BFR， PI3Kδ：4EZJ)、Akt1、Akt2、IKKβ(PDB ID：3MVH、2JDR、4KIK)也有較高的親和性。另外，大黃酸與COX-2、iNOS(PDB ID：3NT1、3HR4)也具有較高親和力。

2.3大黃酸與關鍵靶標蛋白作用模式

如圖2所示，大黃酸的羥基、羰基以及羧基是形成氫鍵作用的位點，這些氫鍵是穩定大黃酸與ATP位點相互作用的關鍵因素。由于大黃酸共軛結構，其與JAK2的Tyr931之間還產生π間還堆積效應(如圖C2所示)。大黃酸與P38、PI3Kγ、JAK2 ATP位點的穩定結合的另一個作用力——疏水作用，為大黃酸的蛋白親和做出了較大貢獻。如圖所示，大黃酸與3個蛋白上的構成ATP位點的殘基形成疏水作用，并且與活性區域形成構型互補，從而牢牢的結合在活性位點上。

圖2　大黃酸與P38、PI3Kγ、JAK2的對接模式圖A1、A2為大黃酸與P38 ATP位點的作用模式；B1、B2為大黃酸與PI3Kγ ATP位點的作用模式；C1、C2為大黃酸與JAK2 ATP位點作用模式。在3D示意圖中，靶蛋白以二級結構顯示，大黃酸以球棍模型顯示，殘基以棍棒模型顯示。在平面示意圖中，輻射狀弧形代表疏水作用的殘基，虛線代表氫鍵，球棍模型為大黃酸。

3討論

分子反向對接技術是基于分子對接的逆運用，其以配體作為研究對象，蛋白作為靶標進行靶蛋白的篩選。本實驗選擇NF-κB、P38、JAK2/STAT3 3條通路上的30個蛋白進行反向對接。結果顯示，大黃酸與P38、PI3Kγ、JAK2靶蛋白具有較高親和力。

P38是炎癥信號通路上的關鍵靶蛋白，其能夠進入細胞核調控多種核轉錄因子，如環磷腺苷反應元件鏈接蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)、轉錄活化因子-2(Activated transfer factor 2，ATF-2)、NF-κB等轉錄基因的表達，還能影響炎性細胞因子，如TGF-β1、TNF-α、IL的合成，并且參與炎癥細胞的活化[19]。 Huang J、Alam JJ、Studer RK等研究證實P38激酶的抑制制影響NF-κB的轉錄，降低iNOS、COX-2、IL的表達[20,21]。 PI3K激酶是NF-κB通路與JAK2/STAT3通路的“交匯”，磷酸化的PI3K可以通過PDK1/Akt通路激活NF-κB并促進iNOS的表達。研究顯示[22,23]，PI3Kγ在免疫細胞內高度表達并且在炎癥應答過程中起著重要的介導作用。Hee Jung Kim和Randall S. Frey的研究發現[24,25]，PI3Kγ的抑制能夠顯著減少LPS所引起的氧化自由基的產生，并且極大程度上抑制的NF-κB的活化，減少下游炎癥細胞因子的表達，從而緩解炎癥。JAK2/STAT3通路可介導多種細胞因子的轉導，JAK2的磷酸化可激活STAT3進入細胞核并介導多種炎癥因子生成，如iNOS、MMP-9、COX-2、IL-6、IL-1β、PG。

對接結果表明P38、PI3Kγ、JAK2的ATP位點極有可能為大黃酸的直接作用靶位，這一直接作用的繼發效果表現出阻礙TLR4/NF-κB信號通路，降低NF-κB的活化等作用。而大黃酸對相關下游蛋白及核轉錄的影響已有大量文獻報道[26,27]。

能量分析表明，大黃酸與相關蛋白激酶結合能力均較強，如P38、PI3Kγ、JAK2、IA型PI3Ks、Akt1、Akt2、TAK1、IKKβ等。這可能與人類激酶的ATP區域(激酶區域)都有著序列和結構的高度保守性有關[28]。在ATP與激酶的結合過程中，高度共軛腺嘌呤負責與激酶區域牢固地結合，而大黃酸蒽醌母核的高度共軛的特性與腺嘌呤相似，所以大黃酸可以像ATP的腺嘌呤環一樣的結合到激酶區域，并且ATP區域狹窄的構象特點也使得大黃酸可以有效地形成構型互補，從而與蛋白激酶結合阻礙炎癥應答，發揮抗炎作用。

從對接受力分析，大黃酸的共軛結構可與殘基之間形成π-π堆積以及cation-a相互作用，并且大黃酸的多羥基、羰基結構負責與殘基形成重要的氫鍵作用，這些特征性結構在大黃酸的穩定結合過程中發揮著重要作用。這些結構特征提示在設計P38、PI3Ks、JAK2等激酶的抑制劑時，通過加入1、8位的羥基基團，以及9、10的羰基基團可以提高配體的親和力，并且降低配體的旋轉勢能增加共軛度，將有利于配體與蛋白激酶ATP位點的結合。

綜上所述，炎癥通路靶位反向對接實驗表明大黃酸抗炎作用的直接靶蛋白可能為胞內P38、PI3Kγ和JAK2的高度保守ATP位點。這一結果為進一步明確蒽環類物質的抗炎機制提供了新的研究側重點，也為相應新型先導化合物合成提供了初步的構效關系指征。

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Study on anti-inflammatory mechanism of rhein based on reverse docking method*

Xu You-dong, Zhang Yan, Meng Xian-li, Zeng Yong, Wang Ping△

(Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Sichuan Chengdu 611137)

AbstractObjective：To investigate the mechanism of anti-inflammation of rhein through the approach of reverse docking, which was utilized to dock rhein with proteins in the signal pathways of NF-κB、P38 and JAK2/STAT3. Methods: Thirty proteins of NF-κB、P38 and JAK2/STAT3 pathway were obtained from PDB website, the structure of rhein was obtained from PubChem website. All the proteins were processed with standardization disposal of AutoDockTools. Then AutoGrid was utilized to calculate the grids of active sites. The docking result has been ranked according to docking energy, for the purpose of selecting out the proteins with high affinity for rhein. Results: Three target proteins including P38, PI3Kγ and JAK2 were found to interact with rhein with high affinity. Conclusion: Anti-inflammation of rhein relates to its function of competitive inhibition for the 3 target proteins, and the behavior of rhein results in the obstruction to signal pathways. Finally the purpose of treatment for inflammation has been achieved by this method.

Key Words:Rhein; Molecular docking; Pathway of JAK2/STAT3; Pathway of NF-κB; Inflammation; AutoDock

(收稿日期：2016-1-20)

作者簡介：徐佑東，男，在讀研究生，主要從事藥理學研究，E-mail：xydarticle@hotmail.com。△通訊作者：王平，男，副教授，主要從事中藥藥代動力學研究，Email：viviansector@aliyun.com。

*基金項目：國家自然科學基金項目(編號：81274111)