HPLC法比較心臟釆血和頸總動脈釆血對家兔水楊酸鈉血漿半衰期的影響

魏瑩　陳珍　馬雪　楊梅　劉丹　廖榮瓊　陳小云　張語　譚茜　田瑞敏△

(1.川北醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，四川 南充　637100；

2.川北醫(yī)學(xué)院本科生，四川 南充　637100)

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HPLC法比較心臟釆血和頸總動脈釆血對家兔水楊酸鈉血漿半衰期的影響

魏瑩1陳珍1馬雪2楊梅2劉丹2廖榮瓊2陳小云2張語2譚茜2田瑞敏2△

(1.川北醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，四川 南充637100；

2.川北醫(yī)學(xué)院本科生，四川 南充637100)

摘要目的：觀察心臟釆血和頸總動脈釆血對家兔水楊酸鈉血漿半衰期的影響。方法：將12只家兔按隨機(jī)數(shù)字單盲法分為心臟釆血組和頸總動脈釆血組(n=6)，經(jīng)耳緣靜脈注射10%水楊酸鈉溶液2 ml·kg(-1)，分別于0 min，10 min和40 min后釆血，處理血樣，HPLC測定血漿水楊酸的峰面積，計算其半衰期。結(jié)果：心臟釆血組半衰期比頸總動脈釆血組明顯延長(P<0.05)，頸總動脈釆血組的實驗數(shù)據(jù)較心臟釆血組更為穩(wěn)定。結(jié)論：頸總動脈釆血較心臟釆血對水楊酸鈉半衰期的測定更為穩(wěn)定。

關(guān)鍵詞：水楊酸鈉；半衰期；心臟；頸總動脈；HPLC

藥物半衰期是藥動學(xué)重要參數(shù)，可以揭示機(jī)體內(nèi)藥物代謝情況，藥物排泄規(guī)律等[1-2]。“水楊酸鈉血漿半衰期的測定”實驗是藥理學(xué)實驗或機(jī)能學(xué)實驗當(dāng)中的一個重要內(nèi)容[3]，然而其半衰期的測定結(jié)果各醫(yī)學(xué)院實驗室差距較大。在該實驗操作中，準(zhǔn)確，多次，及時的采取足量的動物血液[4]是保證實驗成功的重要因素。故本文分別采用了心臟釆血和頸總動脈釆血兩種途徑釆血，并采用了HPLC測定，觀察其對水楊酸鈉半衰期測定結(jié)果的影響，以期為以后藥物血漿半衰期的測定實驗中家兔采血方法的改進(jìn)提供一定依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物

健康家兔12只(2.5 kg左右，由川北醫(yī)學(xué)院實驗中心提供)。

1.1.2實驗器材

Agilent 1260 高效液相色譜儀(Agilent 1200四元泵、柱溫箱、VWD檢測器、Agilent 1200 色譜工作站)，Mettle AE240電子天平(瑞士梅特勒公司，十萬分之一)；哺乳動物手術(shù)器械，5 ml注射器及針頭，兔臺。

1.1.3藥物試劑

10%水楊酸鈉溶液，1%戊巴比妥鈉，1%肝素鈉溶液；水楊酸對照品(批號100106-201104)購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈均為色譜純，水為重蒸水，其余試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1分組與血樣采集

將家兔12只隨機(jī)數(shù)字單盲法分為兩組：心臟釆血組和頸總動脈釆血組，每組6只；分別將兩組家兔用1%戊巴比妥鈉溶液(3 ml·kg-1)全身麻醉，頸部正中皮膚做5-7 cm縱行切口；將心臟釆血組的家兔用1%肝素鈉溶液(1 ml·kg-1)全身肝素化；將頸總動脈釆血組的家兔的左側(cè)頸總動脈分離出來，用1%肝素鈉溶液(1 ml·kg-1)全身肝素化，然后在頸總動脈上插管；分別自心臟和頸總動脈取血2 ml；耳緣靜脈注射10%水楊酸鈉溶液后，分別自心臟和頸總動脈于0、10和40 min各取血2 ml備用。

1.2.2色譜條件[5-6]

水楊酸的含量測定 色譜柱：Wondasil C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-乙腈-0.3%磷酸水(32:18:50)；流速：1.0 ml·min-1；檢測波長：283 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量20 μl。

1.2.3對照品制備

精密稱取水楊酸對照品9 mg至10 ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容，得到含水楊酸0.91 mg·ml-1的對照品溶液母液；精密量取2 ml至25 ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容，得0.0728 mg·ml-1的對照品溶液。

1.2.4供試品溶液制備[7]

精密量取血液樣品0.5 ml，乙腈2 ml，旋渦振蕩2 min，15000 r·min-1離心5 min，取上清夜微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液20 μl，在上述色譜條件下進(jìn)樣，在高效液相色譜儀上進(jìn)行檢測水楊酸在不同時間點的峰面積，計算其半衰期。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理

2結(jié)果

2.1線性關(guān)系考察

在上述色譜條件下，精密吸取對照品適量進(jìn)樣，測定目標(biāo)物峰面積，以進(jìn)樣量X(μg或μg·μl-1)為橫坐標(biāo)，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，做線性回歸，得水楊酸的線性方程分別為Y=1206X+95.575(r=0.9995)；線性范圍為2.97~4.83 μg。

2.2精密度試驗

分別于0.5 ml 的空白血清中加入4 ml的水楊酸對照品溶液混勻，制得0.0728 mg·ml-1水楊酸濃度的血清樣品，按上述色譜條件，精密移取20 μl進(jìn)樣，以水楊酸的峰面積計算RSD(n=6)，結(jié)果分別為2.4%，表明精密度良好。

2.3穩(wěn)定性試驗

按“1.2.3”項下方法，分別制備樣品，在上述色譜方法下，在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測定血樣中水楊酸的峰面積，得出峰面積的RSD分別為2.1%。表明該血樣在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4回收率試驗

分別于0.5 ml 的空白血清中加入3種不同濃度水楊酸對照品溶液，混勻，7.28、72.8、728 mg·μl-1水楊酸血液樣品，按“2.3”項下方法，測定空白血漿中水楊酸的含量，計算回收率及RSD，其結(jié)果為95.8%(RSD=2.7%)。

2.5樣品測定

按照“1.2.3”項下方法制備供試品溶液，“1.2.2”項下色譜條件測定，對不同取血方式和時間點的血樣中水楊酸的含量進(jìn)行測定，樣品及對照品色譜圖見圖1。

2.6心臟釆血和頸總動脈釆血對藥物半衰期的比較

實驗結(jié)果統(tǒng)計值：T值是4.085，P值0.002，見表1。實驗結(jié)果表明，心臟采血組與頸總動脈釆血組比較半衰期較長(*P<0.05)，頸總動脈釆血組半衰期的測定結(jié)果更穩(wěn)定，與文獻(xiàn)報道一致[8]。

3討論

藥物的半衰期是臨床給藥的參考依據(jù)，故半衰期的測定十分重要[9]。“水楊酸鈉半衰期的測定”，目前該實驗半衰期測定不同時間點血液中的水楊酸鈉的光密度值，多采用分光光度法[10-11]，但有關(guān)半衰期的測定結(jié)果各實驗室相差較大[8]。本實驗采用HPLC測定水楊酸鈉的半衰期，從檢測方法上提高準(zhǔn)確度減少誤差。本實驗另一重要影響因素則是定點定量血。目前多采用心臟釆血法[3]，也有改良使用兔耳中央動脈取血法[12]，但這兩種方法取血對學(xué)生的技術(shù)要求較高，很難準(zhǔn)時取出足量血，造成測定誤差。

(A)對照品HPLC圖(1.水楊酸)

(B)樣品HPLC圖圖1　血樣中水楊酸含量測定的HPLC圖

組 別半衰期(min)心臟釆血組 85.48±30.21頸總動脈釆血組34.47±4.85*

注：與心臟采血組相比，*P<0.05。

綜上，筆者分別采取頸總動脈釆血法和心臟釆血法兩種方法取血，為了避免由于手術(shù)和麻醉所致誤差，兩組采用均在全麻下進(jìn)行，該實驗結(jié)果提示頸總動脈取血法可以縮小實驗誤差。本實驗在樣品處理時采用乙晴沉降蛋白，經(jīng)高速離心后可直接吸取上清液進(jìn)行測定，方法簡捷、易操作、回收率高測定速度快，勿需特殊控制的實驗條件。HPLC法測定水楊酸鈉的半衰期，靈敏度高，樣品用量少，是研究藥物藥動學(xué)的常用方法。

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Effect of blood samples collected from heart and common carotid artery on the half-life of plasma sodium salicylic in rabbits by HPLC

Wei Ying1, Chen Zhen1, Ma Xue2, Yang Mei2, Liu Dan2,Liao Rong-qiong2, Chen Xiao-yun2, Zhang Yu2, Wang Ling-ling2, Tian Rui-min1△

(1.School of Pharmacy, North Sichuan Medical College, Sichuan Nanchong 637100;2.Students of North Sichuan Medical College, Sichuan Nanchong 637100)

AbstractObjective：To observe the effects of blood samples were collected from heart and common carotid artery on the half-life of plasma sodium salicylic in rabbits. Methods: Twelve rabbits were divided into two groups(n=6)according to the random number and single blind method. Blood samples collected from one group werefrom heart and another from the common carotid artery. Rabbits were injected 10% sodium salicylic solution 2 ml kg-1through ear vein. Blood samples were collected at 0, 10 and 40 min respectively from heart and common carotid artery to measure the half-life of plasma salicylic sodium by high performance liquid chromatograph(HPLC). Results: The half-life in the groups whose blood samples were collected from heart were significantly longer than those in another groups(P<0.05).Theexperimental data in the groups whose blood samples were collected from common carotid artery were more stable. Conclusions: The blood samples from common carotid artery are more stable than those from heart on the half-life of plasma sodium salicylic.

Key Words:Sodium Salicylic; Half-life; Heart; Common carotid artery; HPLC

(收稿日期：2016-1-29)

作者簡介：魏瑩，女，助教，主要從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化研究，Email：414697669@qq.com。△通訊作者：田瑞敏，女，講師，主要從事藥理學(xué)研究，Email：truimin@126.com。