福辛普利對慢性心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡及相關基因表達的影響

謝亞芹，趙娟，李秀華，馮翔宇

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福辛普利對慢性心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡及相關基因表達的影響

謝亞芹，趙娟，李秀華，馮翔宇

摘要

關鍵詞福辛普利；心力衰竭；細胞凋亡；凋亡相關基因

作者單位:067000 河北省承德市，承德醫學院 病理生理學教研室(謝亞芹、趙娟)； 承德醫學院附屬醫院 老年病科(李秀華、馮翔宇)

Effect of Fosinppril on Myocardial Cell Apoptosis and Apoptosis-associated Gene Expression in Chronic Heart Failure Rats

XIE Ya-qin,ZHAO Juan,LI Xiu-hua,FENG Xiang-yu.
Department of Pathophysiology,Chengde Medical College,Chengde(067000),Hebei,China
Corresponding Author:XIE Ya-qin,Email:xieyq1983@126.com

Abstract

Objective:To investigate the effects of fosinppril on myocardial cell apoptosis and apoptosis-associated gene expression in chronic heart failure(CHF)rats.

Methods:CHF model was established by partially banding of abdominal aorta superior to renal artery.The experimental rats were randomly divided into 3 groups:Sham operation group and CHF group,the rats in both groups received stomach normal saline;Fosinopril group,the rats received stomach fosinopril 10 mg/kg?d.n=10 in each group and all animals were treated for 8 weeks.LVEDP,±dp/dtmaxand LVMI were examined,left ventricular myocardial cell apoptotic index(AI)was measured by TUNEL method,Bcl-2 and Bax protein levels were detected by immunohistochemistry and caspase-3 protein expression was assessed by Western blotting.

Results:Compared with Sham operation group,CHF group had increased LVEDP,LVMI,AI,elevated protein expressions of Bax and Caspase-3,P<0.01;while decreased ±dp/dtmax,reduced protein expression of Bcl-2 and the ratio of Bcl-2/Bax,P<0.01.Compared with CHF group,Fosinopril group presented decreased LVEDP,LVMI,AI,reduced protein expressions of Bax and Caspase-3,P<0.01;while increased ±dp/dtmax,elevated protein expression of Bcl-2 and the ratio of Bcl-2/Bax,P<0.01.Conclusion:Fosinopril may inhibit myocardial cell apoptosis which occurred during CHF,by up-regulating Bcl-2 expression and down-regulating expressions of Bax and Caspase-3 in CHF rats,therefore improve the cardiac function.

Key words Fosinopril;Hear failure;Apoptosis;Apoptosis-associated gene

(Chinese Circulation Journal,2016,31:285.)

慢性心力衰竭是各種病因導致心臟疾病的嚴重階段及最終歸宿，也是心臟疾病患者最主要的死亡原因。近年來有研究證明[1]，長效血管緊張素轉化酶抑制劑（ACEI）類藥物在治療高血壓的同時可使心肌肥厚逆轉，使擴大的心臟恢復正常，降低心臟負荷，改善心室功能，降低心力衰竭的死亡率。但其能否有效抑制長期慢性壓力超負荷引起的心力衰竭心肌細胞凋亡仍需進一步研究。本研究將以腎上腹主動脈縮窄方式建立慢性壓力負荷型心力衰竭動物模型，分析福辛普利對慢性心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡及相關調節基因表達的影響，探討其在積極逆轉心肌受損，改善心力衰竭進程中的作用，為臨床藥物治療的研究提供理論基礎。

1　材料與方法

材料： 2014-01至2015-01選取清潔級雄性Wistar大鼠35只,購自北京華阜康生物科技股份有限公司（合格證編號：2009-0004）；福辛普利(10 mg)商品名：蒙諾，購自中美上海施貴寶制藥有限公司；脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（TUNEL）細胞凋亡檢測試劑盒購自美國羅氏（Roche）公司；B細胞白血病/淋巴瘤相關抗原2（Bcl-2）、B細胞白血病/淋巴瘤相關抗原相關X（Bax）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 （Caspase-3）兔抗多克隆抗體均購自北京博奧森生物技術有限公司；SP免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術公司；二奎啉甲酸（BCA）法蛋白定量試劑盒購自北京泰格美科技有限公司。

動物模型的建立及分組：將35只大鼠適應性喂養1周后，隨機抽取10只作為假手術組，假手術組只分離腹主動脈而不結扎。其余25只大鼠全部采用腎上腹主動脈縮窄手術建立慢性心力衰竭模型[2,3]。術后均給予青霉素20萬U連續3天腹腔注射，常規喂養6周，造模大鼠逐漸出現呼吸、心跳加快、倦怠無力、食欲減退等表現，模型建立中死亡5只。檢測血流動力學參數，以左心室舒張末壓（LVEDP）≥15 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）作為成模標準，待成功建立模型后，福辛普利組（n=10）大鼠給予福辛普利10 mg/（kg·d），慢性心力衰竭組（n=10）和假手術組大鼠給予等量生理鹽水灌胃，連續8周。

血流動力學監測：將大鼠測體重后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉（0.5 g/kg）大鼠，經右頸總動脈逆行插管至左心室，另一端接壓力換能器輸入多媒體生物信號記錄儀系統，記錄分析后獲得LVEDP，左心室內壓最大上升和下降速率（±dp/dtmax)等。

標本制備及計算左心室質量指數（LVMI）：福辛普利治療結束后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉（0.5 g/kg）大鼠，進行血流動力學監測后，迅速開胸取出心臟，冰生理鹽水洗凈，分離左心室，取左心室稱重后，將部分放入4%多聚甲醛固定24 h，常規脫水、透明、浸蠟和包埋，備用于免疫組織化學染色檢測Bcl-2、Bax蛋白表達；其余左心室迅速投入液氮中保存，備用于蛋白免疫印記法（Western blotting）檢測Caspase-3蛋白表達。LVMI=大鼠左心室質量/大鼠體重。

TUNEL法原位檢測細胞凋亡：石蠟切片常規脫蠟至水，蛋白酶K（proteinase K）工作液消化15 min，TUNEL反應液37℃孵育60 min，過氧化物酶（POD）轉化劑37℃孵育30 min，二氨基聯苯胺（DAB）顯色，蘇木素復染，脫水，透明，封片。凋亡細胞的細胞核呈棕褐色著染。凋亡指數（AI）的確定：以TUNEL陽性細胞數目與同一視野心肌細胞總數的比值作為左心室心肌細胞凋亡指數，每只動物任選3張切片，每張切片選取4個視野，取平均值。

免疫組織化學檢測Bcl-2、Bax蛋白的表達：采用SP免疫組織化學染色方法檢測左心室心肌組織Bcl-2、Bax蛋白的表達。Ⅰ抗分別為Bcl-2、Bax多克隆抗體，稀釋濃度均為1:100。實驗同時以0.01 mmol/L磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=7.4）代替第1抗體作為陰性對照，以胞漿中出現棕黃色顆粒為陽性反應，采用MiVnt圖像分析系統在10×20倍顯微鏡下對免疫陽性結果進行半定量分析，以免疫陽性產物面積與視野面積的比值表示該抗原的相對含量。每只動物任選3張切片，每張切片選取4個視野，取平均值。

Western blotting檢測Caspase-3蛋白表達：稱取左心室心肌組織，BCA蛋白試劑盒測定總蛋白含量[4]。取蛋白質樣品每份100μg，與5×loading buffer混勻，100℃煮沸5min，12%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉膜，在麗春紅染液中染色觀察蛋白轉移情況并標出蛋白質分子量標準，然后用含5%脫脂牛奶的0.5‰TBST封閉緩沖液（含有Tris-HCl、NaCl、Tween-20，pH=8.0）中封閉，4℃過夜，洗膜后加入1:200羊抗Caspase-3多克隆抗體、1:1 000小鼠抗β肌動蛋白（β-actin）進行雜交，再洗膜后加辣根酶標記的相應的二抗（工作濃度1:5 000）進行雜交，洗膜后加入免疫印跡化學發光試劑最后進行放射自顯影。膠片掃描后，采用Quantity One-v 4.6.2軟件對顯影條帶進行分析，計算Caspase-3條帶與β-actin條帶灰度比值，作為Caspase-3蛋白表達的相對水平。

2　結果

血流動力學參數及LVMI檢測結果（表1）：與假手術組相比，慢性心力衰竭組大鼠LVEDP、LVMI顯著增高（P<0.01），±dp/dtmax明顯下降（P<0.01）；與慢性心力衰竭組相比，福辛普利組大鼠LVEDP、LVMI明顯下降（P<0.01）、±dp/dtmax明顯上升（P<0.01）,差異均有統計學意義。

心肌細胞凋亡檢測結果（表2、圖1）：TUNEL陽性產物位于胞核，呈棕褐色顆粒狀。與假手術組比較，慢性心力衰竭組大鼠心肌組織細胞凋亡明顯增多，AI明顯增高（P<0.01）；與慢性心力衰竭組比較,福辛普利組大鼠心肌組織細胞AI明顯降低（P<0.01），差異均有統計學意義。

免疫組織化學法檢測心肌組織Bcl-2和Bax蛋白表達結果（圖2、3，表2）：Bcl-2和Bax免疫陽性產物呈棕黃色，位于心肌細胞漿。與假手術組相比，慢性心力衰竭組大鼠心肌組織Bax蛋白表達明顯增高（P<0.01），Bcl-2蛋白表達及Bcl-2/Bax比值明顯降低（P<0.01）。與慢性心力衰竭組相比，福辛普利組大鼠心肌組織Bax蛋白表達明顯降低（P<0.01），Bcl-2蛋白表達及Bcl-2/Bax比值顯著升高（P<0.01），差異均有統計學意義。

表1　各組大鼠血流動力學參數及LVMI比較（n=10，±s）

表2　各組大鼠左心室心肌細胞凋亡指數及心肌組織Bcl-2、Bax蛋白表達（n=10，±s）

圖1　缺口末端標記法檢測各組大鼠心肌細胞凋亡(×200)

圖2　免疫組化染色檢測各組大鼠左心室心肌組織Bcl-2蛋白表達(×200)

圖3　免疫組化染色檢測各組大鼠左心室心肌組織Bax蛋白表達(×200)

Western blotting法檢測Caspase-3蛋白的表達結果（圖4）：慢性心力衰竭組大鼠心肌組織Caspase-3蛋白表達水平為0.66±0.08，與假手術組0.22±0.03比較明顯增高（P<0.01），福辛普利組Caspase-3蛋白表達水平為0.45±0.05，與慢性心力衰竭組比較顯著降低（P<0.01），差異均有統計學意義。

圖4　蛋白免疫印記法檢測各組大鼠左心室心肌組織Caspase-3蛋白表達

注：1：假手術組；2：慢性心力衰竭組；3：福辛普利組。Caspase-3：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3；β-actin：β肌動蛋白

3　討論

目前研究表明[5]，心肌細胞的凋亡在心力衰竭的病理改變中有著重要的作用。慢性心力衰竭發生時左心室功能的不斷惡化是心肌細胞凋亡或（和）剩余的心肌細胞收縮功能代償不足的結果，而凋亡可能是心肌細胞不斷丟失的根源所在[6]。本研究中血流動力學檢測結果，LVEDP水平明顯升高，+dp/dtmax與-dp/dtmax均降低，表明慢性心力衰竭組大鼠明顯出現心功能的惡化，同時LVMI增加，提示慢性心力衰竭組大鼠左心室壁增厚，出現心肌肥厚。TUNEL檢測顯示慢性心力衰竭組心肌細胞凋亡指數顯著升高。因此提示在慢性壓力負荷增加時，可發生心肌細胞的凋亡及心肌纖維化，并最終導致心功能的惡化。

心肌細胞凋亡是受基因調控的細胞主動死亡過程，目前已知的凋亡調節蛋白中，Bcl-2家族與Caspase家族為最關鍵的兩大類[7]。Bcl-2是一種抑制細胞凋亡的基因，而Bax是促進細胞凋亡的基因。Bcl-2與Bax形成的異源二聚體中兩者的比例決定促進細胞凋亡還是抑制凋亡[8]。因此，兩種基因在細胞中含量和功能之間的平衡一直被認為是決定促凋亡因素刺激后細胞的存活或死亡重要機制[9]，所以Bcl-2 和Bax是調控心肌細胞凋亡的關鍵基因。本研究發現慢性心力衰竭組大鼠與假手術組比較，Bax表達明顯升高，Bcl-2表達及Bcl-2/Bax比值顯著降低，提示Bcl-2、Bax確實在心肌細胞凋亡中發揮了關鍵作用。

Caspase-3被認為是各種凋亡刺激因子激活的Caspase家族中的關鍵蛋白酶，是細胞凋亡蛋白酶級聯反應的必經之路，其活化標志著凋亡進入不可逆階段[10]。現已證實Caspase-3在心、腦等重要器官缺血再灌注過程及腫瘤細胞[11]均異常表達，參與細胞凋亡。本研究顯示發現慢性心力衰竭組大鼠與假手術組比較，Caspase-3蛋白的表達均明顯升高，提示Caspase-3在壓力負荷型慢性心力衰竭心肌細胞凋亡中發揮了重要作用。

ACEI類藥物能使血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）生成減少，并使神經內分泌激素和AngⅡ介導的進行性左心室肥大和擴張受到抑制，增加前列腺素的生成，從而抑制心室重構，被認為是治療慢性心力衰竭的基石[12]。但大多是ACEI是前體藥物，生物利用度較低。福辛普利作為第三代長效ACEI類藥物，具有作用時間更長，副作用減少，肝腎雙重排泄等優點，因此其在心血管疾病及腎臟損害的治療等方面得到了越來越多的關注[13]。本研究發現，在福辛普利的作用下，慢性心力衰竭大鼠的心功能得到明顯改善，并抑制了心肌肥厚的發生。同時，福辛普利的治療使心肌細胞凋亡指數、Bax、Caspase-3的表達明顯低于慢性心力衰竭組大鼠，Bcl-2表達及Bcl-2/Bax比值較慢性心力衰竭組顯著升高。這表明福辛普利通過上調抑制凋亡基因Bcl-2表達、下調促凋亡基因Bax、Caspase-3表達，從而抑制心肌細胞的凋亡，改善心室功能。

參考文獻

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(編輯:汪碧蓉)

基礎與實驗研究

(收稿日期:2015-04-28)

中圖分類號：R541.6

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3614（2016）03-0285-04

doi:10.3969/j.issn.1000-3614.2016.03.019

作者簡介:謝亞芹 講師 碩士 研究方向：慢性心力衰竭的發病機制與治療 Email：xieyq1983@126.com 通訊作者:謝亞芹

基金項目:河北省高校省級重點學科（病理學與病理生理學） 項目

目的： 探討福辛普利對慢性心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡及相關基因表達的影響。

方法： 采用腎上腹主動脈縮窄法建立大鼠慢性心力衰竭模型，隨機分為假手術組、慢性心力衰竭組、福辛普利組，每組10只大鼠。術后假手術組和慢性心力衰竭組給予生理鹽水灌胃，福辛普利組給予福辛普利10 mg/（kg·d）灌胃。8周后，觀察各組大鼠左心室舒張末壓（LVEDP）、左心室內壓最大上升及下降速率（±dp/dtmax）和左心室質量指數（LVMI）；脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（TUNEL）檢測大鼠左心室心肌細胞的凋亡指數（AI）；SP免疫組織化學染色法檢測左心室心肌組織B細胞白血病/淋巴瘤相關抗原2（Bcl-2）、B細胞白血病/淋巴瘤相關抗原相關X（Bax）蛋白的表達；蛋白免疫印記法（Western blotting） 檢測半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）蛋白的表達。

結果： 慢性心力衰竭組與假手術組相比，大鼠LVEDP、LVMI 、心肌細胞凋亡指數、Bax蛋白、Caspase-3蛋白的表達均明顯升高（P<0.01），±dp/dtmax、Bcl-2蛋白的表達、Bcl-2/Bax比值顯著下降（P<0.01）；與慢性心力衰竭組比較，福辛普利組大鼠LVEDP、LVMI、心肌細胞凋亡指數、Bax蛋白、Caspase-3蛋白的表達均明顯降低（P<0.01），±dp/dtmax、Bcl-2蛋白的表達、Bcl-2/Bax比值顯著升高（P<0.01）,差異均有統計學意義。

結論： 慢性心力衰竭過程中發生了心肌細胞凋亡，福辛普利可通過上調Bcl-2的表達及下調Bax及Caspase-3的表達抑制心肌細胞凋亡，改善慢性心力衰竭大鼠心室功能及心肌肥厚。