TCF25干擾慢病毒載體的構建與鑒定

李佑鋒++彭浩++高建芳等

摘 要 為構建一個針對TCF25（transcription factor 25）基因的慢病毒干擾載體， 設計并合成3組針對TCF25的短發夾RNA序列 （shRNA），通過基因重組技術連入 pLL3.7載體，酶切鑒定及DNA測序后，重組正確的pLL3.7質粒與病毒包裝質粒共轉染293FT細胞，培養48 h后，分別收集細胞培養上清液，感染H9C2細胞，Westernblot檢測TCF25在H9C2細胞中的表達.結果顯示TCF25蛋白在H9C2細胞中的表達被抑制.這說明TCF25的慢病毒干擾載體構建成功.

關鍵詞 TCF25基因；293FT細胞；H9C2 細胞；慢病毒載體

中圖分類號 Q786文獻標識碼 A文章編號 10002537（2016）02002306

Construction and Characterization of a Lentiviral Vector for RNA Interference of TCF25

LI Youfeng， PENG Hao， GAO Jianfang， GAO Jing， CHEN Yu， WU Xiushan， LI Yongqing*

（Center for Heart Department， Key lab of MOE for Department Biology and Protein Chemistry，

Hunan Normal University， Changsha 410005， China）

Abstract Objective To construct a lentiviral vector for RNA interference of TCF25 （transcription factor 25） gene and identify it. Methods Three pairs of complementary short hairpin RNA （shRNA） oligonucleotides targeting the TCF25 gene were designed， synthesized， and then inserted into pLL3.7 vectors by gene recombination technology. The recombinant plasmid was identified by enzyme digestion and DNA sequencing. Correct recombinant plasmids were cotransfected with packaging plasmids into 293FT cells. The cell culture supernatant was obtained after 48 hours， and then applied to infect H9C2 cells. The expression of TCF25 in H9C2 cells was detected by westernblot. Results The recombinant plasmid was successfully constructed. The westernblot showed that the expression of TCF25 in H9C2 cells was inhibited after the cells were successfully infected with the lentiviral vector supernatant. Conclusion The lentiviral vector interfering TCF25 was constructed successfully.

Key words TCF25 gene； 293FT cell； H9C2 cell； lentiviral vector

TCF25（transcription factor 25）是在小鼠胚胎發育過程中廣泛表達的一個含有bHLH結構域的轉錄因子，且其C端還含有一個功能未知的DUF654結構域.根據TCF25廣泛的表達模式和包含的轉錄激活結構域，推測其可能在腦和心臟等各種器官發育過程中發揮重要的調控作用[13].同時，已有研究表明TCF25作為SRF信號通路的抑制因子調控基因的表達，且能夠抑制P19CL6細胞向心肌細胞分化[4]，但其具體作用機制需要繼續探索.

RNA干擾（RNA interference，縮寫RNAi）是指在進化過程中高度保守的雙鏈RNA（doublestranded RNA，dsRNA）誘發的基因沉默現象，能夠特異性剔除或關閉靶基因的表達[5].目前，該技術已被廣泛用于探索基因功能和基因治療領域等[6].RNAi技術主要是將siRNA序列設計為一段shRNA（short hairpin RNA，短發夾RNA）克隆進質粒載體中，轉染細胞后被轉錄形成一個雙鏈RNA誘導基因沉默發生.慢病毒載體是根據HIV病毒基因特征，利用其基因結構重組構建而成.其能夠將外源目的基因或外源的shRNA高效地整合到宿主基因組上并持久表達[78].慢病毒載體能夠高效地感染心肌細胞、腫瘤細胞和內皮細胞等各類細胞系.同時，對于原代細胞和不分化細胞等較難轉染的細胞，慢病毒載體也能夠大大提高目的基因的轉染效率和基因整合到宿主細胞基因組上的幾率.基于其強大的轉染能力，慢病毒載體已經被廣泛應用于基礎和臨床醫學研究[910].

為將TCF25的shRNA高效且穩定地導入各類細胞中，本實驗擬構建針對TCF25的重組慢病毒載體，用于研究TCF25的功能機制.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體 慢病毒載體系統為3質粒系統，包括pLL3.7，pMDG，psPAX2（為本實驗室保存質粒）.

1.1.2 細胞 慢病毒包裝細胞293FT細胞株，H9C2細胞，COS7細胞，分離的新生大鼠心肌細胞（本實驗室保存細胞和分離）.

1.1.3 試劑及儀器 XhoⅠ，HpaⅠ，NotⅠ和XbaⅠ限制性內切酶，T4連接酶購自上海生工公司；DH5α感受態為本實驗室制備和保存；胎牛血清、細胞高糖培養基DMEM和抗生素購自Invitrogen公司；質粒DNA提取試劑盒購自康為世紀生物公司；凝膠回收試劑盒購自OMEGA公司；TCF25抗體購自美國圣克魯斯生物技術公司；βactin抗體和辣根過氧化物酶偶聯的山羊抗兔抗體購自康為世紀生物公司；倒置熒光顯微鏡購自OLYMPUS公司；PBS，無水乙醇，Ampicillin和5×SDS上樣緩沖液等常用試劑購自上海生工公司；PCR儀、移液槍和CO2培養箱購自德國Eppendorf公司.

1.2 方法

1.2.1 TCF25基因干擾寡核苷酸的合成 利用shRNA在線設計工具針對TCF25基因的核苷酸序列設計3對shRNA單鏈寡核苷酸片段，干擾shRNA中的loop結構選用了TTCAAGAGA以避免形成終止信號.見表1.設計完成后由上海生工生物公司合成.

1.2.2 重組慢病毒干擾質粒pLL3.7TCF25RNAi的構建 首先將合成的引物配對退火；取2 μg的pLL3.7載體質粒經XhoⅠ/HpaⅠ雙酶切后凝膠電泳回收酶切產物；pLL3.7載體質粒膠回收產物與引物退火后產物用T4連接酶連接，16 ℃恒溫水浴1 h；連接后轉化DH5α感受態，選擇Amp抗性LB固體培養基平板進行涂板，37 ℃培養箱過夜；第二天挑菌體單克隆接種到含Amp抗性的LB液體培養基中，37 ℃搖床過夜；質粒提取，酶切和測序鑒定.序列比對正確后，高純度去內毒素質粒中量抽提試劑盒抽提正確重組的pLL3.7干擾質粒，用于包裝病毒.

1.2.3 慢病毒的包裝與收集 用已經培養了24 h的293 FT cells進行病毒的制備：

（a） 取1 mL無血清的DMEM高糖培養液加入EP管中，依次加入：插入shRNA的pLL3.7TCF25RNAi質粒8 μg，pMDG （envolope plasmid）4 μg，psPAX2 （package plasmid）6 μg；再加入Fugene HD轉染試劑36 μL，移液槍吸打混勻后室溫下靜置30 min；

（b） 給293FT細胞更換預熱的新DMEM培養液（5 mL/培養皿），然后用1 mL槍將上步配好的轉染溶液均勻地滴加在培養液液面上輕輕搖勻，放入37 ℃培養箱培養12 h；

（c） 12 h后更換10%FBS的DMEM高糖培養液12 mL，24 h后進行GEP綠色熒光表達的檢測并開始收集被感染細胞的培養液和換新培養液，連續收集3天，共36 mL于一個50 mL離心管中；

（d） 2 000 r/min在4 ℃下離心10 min，取上清；

（e） 0.45 μm濾器過濾各組干擾TCF25慢病毒上清液，-80 ℃保存備用.

1.2.4 H9C2細胞中篩選TCF25基因有效干擾序列 慢病毒感染細胞前一天將H9C2細胞接種到6孔培養皿中，待細胞濃度為60%～75%時吸去舊培養基，向H9C2細胞中分別加入不含抗生素、10%FBS的DMEM高糖培養液500 μL和慢病毒上清液500 μL，包括未重組pLL3.7（對照組）組、TCF25RNAi1組、TCF25RNAi2組、TCF25RNAi3組；病毒感染24 h后將培養液換為新鮮的10%FBS的DMEM高糖培養液繼續培養，轉染48 h后觀察GFP綠色熒光蛋白的表達；轉染72 h后，收集細胞；蛋白提取，取1 mL 過濾滅菌后的PBS清洗細胞2次，加100 μL含蛋白酶抑制劑PMSF（1∶100）的RIPA細胞強裂解液裂解細胞，反復凍融3次；用移液槍吸取裂解液到1.5 mL EP管中， 4 ℃，13 000 g離心10 min，取上清即為蛋白溶液；按比例加入5×SDS蛋白電泳上樣緩沖液，沸水浴5 min； 自然冷卻后進行SDSPAGE電泳，轉PVDF膜.封閉液（5%脫脂奶粉）室溫封閉1 h，TBST稀釋的TCF25一抗（1∶250）4 ℃過夜或者室溫2 h，TBST稀釋的辣根過氧化物酶偶聯的山羊抗兔二抗（1∶2 000）室溫1 h，內參蛋白抗體為βactin，各過程間用TBST洗膜3次，每次10 min；顯影，蛋白表達結果分析.

1.2.5 觀察指標 重組慢病毒干擾質粒酶切電泳圖和質粒測序結果，慢病毒感染細胞后GFP熒光檢測，TCF25蛋白的表達.

2 結果

2.1 pLL3.7TCF25RNAi重組質粒酶切和測序結果

見圖1，將構建的pLL37TCF25RNAi1組、pLL37TCF25RNAi2組和pLL3.7TCF25RNAi3重組質粒DNA和對照組PLL3.7通過XbaⅠ和NotⅠ雙酶切鑒定，凝膠電泳圖顯示對照組在450 bp處都會切出一條帶，3個實驗組在500 bp處都會有一條帶，較對照組條帶大50 bp左右，證明干擾序列成功連入pLL3.7質粒.

測序結果證實3組pLL3.7TCF25RNAi重組質粒DNA上均含有實驗設計并合成的干擾靶序列，表明實驗成功將TCF25的shRNA雙鏈DNAoligo（干擾引物退火產物）精確地插入pLL3.7載體中，成功構建了干擾TCF25基因mRNA的pLL3.7重組載體質粒.見圖2.

圖2 pLL3.7TCF25RNAi1，pLL3.7TCF25RNAi2 和pLL3.7TCF25RNAi3質粒DNA 測序結果

Fig.2 DNA sequencing of pLL3.7TCF25RNAi1， pLL3.7TCF25RNAi2 and pLL3.7TCF25RNAi3 plasmids

2.2 TCF25干擾重組慢病毒的包裝和收集

pLL3.7空質粒和3組pLL3.7TCF25RNAi重組質粒分別同慢病毒包裝質粒 pMDG 和psPAX2 共同轉染293FT細胞，24 h后可見GFP大量表達.連續收集3 d感染細胞上的培養基共36 mL于一個50 mL離心管中.2 000 r/min在4 ℃下離心10 min，取上清.將各組RNA干擾質粒包裝的病毒上清液以0.45 μm過濾器過濾，-80 ℃保存.見圖3（彩圖見封三）.

2.3 TCF25重組慢病毒感染H9C2細胞的GFP熒光檢測

將包裝好的TCF25干擾重組慢病毒上清液轉染目的細胞H9C2細胞，48 h后，熒光顯微鏡觀察到較強的綠色熒光表達，證實包裝的慢病毒成功轉染H9C2細胞.見圖4（彩圖見封三）.

2.4 Westernblot 檢測慢病毒感染后TCF25蛋白表達情況

對各組TCF25重組慢病毒感染后的H9C2細胞總蛋白提取，WB檢測TCF25蛋白表達情況.與對照組pLL3.7相比，可觀察到RNAi1組、RNAi2組、RNAi3組中TCF25蛋白表達均被抑制，其中RNAi2組中TCF25表達被抑制最明顯，表明TCF25RNAi2干擾序列為最佳干擾靶點.見圖5.

2.5 TCF25重組慢病毒感染分離的新生大鼠心肌細胞和COS7細胞

為了進一步鑒定已包裝的TCF25RNAi載體慢病毒的高效感染能力，檢測其對其他細胞的感染活性，分別轉染分離的新生大鼠心肌細胞和COS7細胞后都能明顯檢測到GFP熒光蛋白的表達.見圖6和圖7（彩圖見封三）.

3 討論

2014年末美國心臟協會（AHA）對心臟病和卒中的數據統計顯示，在全球范圍內心血管疾病仍然是死亡的主要原因，每年奪去1 730萬人的生命.心血管疾病不再只是西方世界的疾病，全球低、中收入國家中80%的死亡是由心血管疾病引起的 [11].對心臟發育相關的轉錄因子進行研究，將為心臟病的臨床預防和治療提供新的思路和策略.

bHLH（basic HelixLoopHelix，堿性螺旋環螺旋）蛋白是一類真核生物中轉錄因子大家族.bHLH蛋白含有2個保守結構區域，分別為一個能與DNA結合的堿性區域和α螺旋環α螺旋結構組成.1989年，在小鼠中bHLH轉錄因子（E12和E47）首次被鑒定出，隨后在各物種得到廣泛的鑒定.目前，其轉錄功能在哺乳動物類內研究最為透徹，參與調控生物體的諸多生命活動，如肌細胞生成、神經元發生、性別決定和細胞增殖等[1115].TCF25屬于bHLH轉錄因子亞家族成員，在小鼠和人類各組織中廣泛表達，尤其在胚胎發育階段高表達.有研究表明TCF25作為一個轉錄抑制因子對SRF信號通路起著極強的抑制作用.同時還有研究發現TCF25基因抑制P19CL6細胞向心肌細胞分化.由此可見，TCF25對于心臟發育具有非常重要的調控功能.

RNAi技術是通過在細胞內形成短的雙鏈RNA結構來介導目的靶mRNA特異性的降解，在轉錄后水平實現目的基因的沉默.RNAi效應由大小為21～23 bp的shRNA分子所介導，針對目的mRNA不同位點設計的shRNA表現明顯不同的活性.shRNA介導的基因沉默效率主要取決于其21～23 bp個堿基序列的合理設計，本實驗設計了3對針對TCF25基因mRNA序列不同位點的shRNA干擾引物，分別與pLL3.7質粒連接，成功構建了3對pLL3.7TCF25重組載體質粒，經過酶切電泳和質粒測序證明與實驗設計合成的靶向鏈完全一致.病毒載體介導shRNA的表達與質粒轉染相比，具有感染效率高和轉染效果更加穩定的優勢.本實驗所用病毒包裝系統為3質粒系統，分別為病毒包裝質粒 pMDG和psPAX2及高效重組載體pLL3.7.其中pLL3.7質粒含有能表達綠色熒光蛋白（GFP）元件，pMDG和psPAX2含有病毒包裝所必須的元件.

TCF25RNAi載體慢病毒轉染H9C2細胞后， Westernblot檢測表明目的蛋白TCF25表達量顯著降低；在設計的3個靶點中，第2個靶序列對目的基因表達的干擾作用最明顯，為最佳靶點.同時在其他細胞系中實驗證明包裝的TCF25RNAi載體慢病毒具有較高的轉染效率，為后期進一步研究TCF25基因在心臟發育中的作用機制奠定了良好的基礎.

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（編輯 WJ）