長鏈非編碼RNA AK125512在肝癌組織中的表達及其臨床意義

蔡杰，林孔英，袁聲賢，陶其飛，徐慶國，余建，黃位龍，汪珍光，楊遠，林川，周偉平（第二軍醫大學附屬東方肝膽外科醫院　肝外三科，上海　200433）

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長鏈非編碼RNA AK125512在肝癌組織中的表達及其臨床意義

蔡杰，林孔英，袁聲賢，陶其飛，徐慶國，余建，黃位龍，汪珍光，楊遠，林川，周偉平
（第二軍醫大學附屬東方肝膽外科醫院肝外三科，上海200433）

[摘 要]目的 檢測長鏈非編碼RNA AK125512在肝癌、癌旁肝組織中的表達情況，探討其與臨床病理指標的關系及作為預測肝癌患者術后預后標記物的潛在價值。方法 從本課題組已完成表達譜芯片（GSE54238）中篩選明顯差異表達lncRNA-AK125512，采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測lncRNAAK125512在肝癌、癌旁肝組織中的表達；x2檢驗分析肝癌組織中lncRNA-AK125512表達量與臨床病理指標相關性；應用Log-rank檢驗和COX回歸模型分析肝癌組織中lncRNA-AK125512表達量與肝癌患者術后預后的關系。結果 lncRNA-AK125512在肝癌組織中較癌旁肝組織明顯低表達（P＜0.0001）；肝癌組織中lncRNA-AK125512的表達水平與Edmondson分級（P=0.022）、腫瘤包膜完整與否（P=0.005）、血AFP（P=0.018）明顯相關；肝癌組織中lncRNA-AK125512相對低表達患者肝癌切除術后無瘤生存期（P=0.0041）及總體生存期（P=0.0008）均顯著縮短。肝癌組織中lncRNA-AK125512相對低表達是影響肝癌患者術后無瘤生存期（P= 0.037）、總體生存期（P=0.003）的一個獨立危險因素。結論 lncRNA-AK125512有望成為預測肝癌患者術后預后的一個新的潛在標記物。

[關鍵詞]長鏈非編碼RNA；癌，肝細胞；實時熒光定量PCR；預后

Expression of long non-coding RNA AK125512 in hepatocellular carcinoma and its clinical significance

CAI Jie,LIN Kong-ying,YUAN Sheng-xian,TAO Qi-fei,XU Qing-guo,YU Jian,HUANG Wei-long,WANG Zhen-guang,YANG Yuan,LIN Chuan,ZHOU Wei-ping.The Third Department of Hepatic Surgery,Eastern Hepatobiliary Hospital Affiliated to Second Military Medical University,Shanghai 200433,China

Abstract objectiveTo investigate the expression of the long non-coding RNA AK125512 in hepatocellular carcinoma(HCC)and its clinical significance.MethodsFrom the lncRNA microarray(GSE54238)which we completed before,lncRNA-AK125512 was selected because of its obvious expression difference.The realtime fluorescence quantitative PCR(qRT-PCR)was performed to detect the expression difference of lncRNAAK125512 between HCC and its adjacent normal tissue.Then,the correlation between the expression of lncRNA-AK125512 in HCC and the clinicopathological characteristics was analyzed by Chi-square test.What’s more,the potential of lncRNA-AK125512 in predicting the prognosis of patient with HCC after operation was assessed by Log-rank test and Cox’s proportional hazards regression model.ResultsThe expression of lncRNAAK125512 in HCC was markedly lower than that in its adjacent normal tissue(P＜0.0001).Moreover,the expression of lncRNA-AK125512 in HCC was significantly correlated with Edmondson classification(P=0.022),complete tumor capsules(P=0.005),alpha fetoprotein(AFP)serum levels(P=0.018).The patients with lower expression of lncRNA-AK125512 in HCC had a statistically shorter tumor-free survival time and overall survival time(P=0.0041,0.0008).What’s more,the lower expression of lncRNA-AK125512 in HCC was an independent risk factor for the tumor-free survival time(P=0.037)and overall survival time(P=0.003)of patients with HCC after curative hepatectomy.ConclusionlncRNA-AK125512 may be a new prognostic biomarker for hepatocel-lular carcinoma after curative hepatectomy.

Key words long non-coding RNA; hepatocellular carcinoma; real-time fluorescence quantitative PCR(qRTPCR); prognosis

肝癌是世界范圍內的高發惡性腫瘤之一，特別是在東亞、東南亞國家，而每年約一半的新發和死亡病例是發生在中國[1]。隨著現代醫療技術的進步，肝癌的診療手段已漸趨成熟，但是其術后5年的生存率仍只有15%～40%[2-3]，且每年的發病率與病死率基本持平。早期診斷并干預、術后再監測是提高肝癌患者預后的重要手段，但目前仍缺乏有效的診療、監測靶點[4]。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一群長度大于200 bp且不編碼蛋白的RNA，以往認為其是RNA聚合酶II的轉錄副產物，不具備生物學功能[5]。但是近些年來研究表明，lncRNA廣泛參與調控細胞功能，與人類疾病特別是腫瘤的發生發展密切相關[6-8]。而目前對lncRNA在肝癌發生發展中的作用仍知之甚少[9]。

本課題組從已完成的表達譜芯片（GSE 54238）中篩選lncRNA-AK125512，發現隨著肝癌的發生發展進程“正常肝-慢性肝炎-肝硬化-肝癌”，其表達量發生明顯變化，并且在肝癌、癌旁肝組織中亦明顯差異表達，提示lncRNA-AK125512可能在肝癌的發生發展過程中發揮著重要作用。為此，我們采用實時熒光定量PCR法進一步驗證其在肝癌、癌旁肝組織中的差異表達，并分析其與臨床病理指標相關性以及與患者術后預后的關系，探討其作為預測肝癌患者術后預后標記物的潛在價值，并為今后揭示肝癌發生發展機制研究和肝癌精準治療提供可能靶點。

1 材料和方法

1.1組織樣本

隨機選取2010年3月至2012年3月在我院行根治性肝癌切除術并滿足選取標準的HCC患者135例，選取標準為：（1）術前未接受其他抗癌治療；（2）有完整的臨床資料；（3）術后病理證實為原發性肝癌。術中另切取肝癌組織及相應癌旁肝組織（距離腫瘤邊界＞2 cm，病理證實無腫瘤細胞）于-80 ℃凍存備用。所有患者均已簽署相關知情同意書并獲得醫院倫理委員會批準。其詳細臨床病理指標見表1。

1.2隨訪

術后定期對患者預后進行隨訪，短期隨訪（1年內）主要以門診復診形式進行，遠期隨訪（1年以上）主要以電話隨訪形式進行。術后前兩年每3個月隨訪1次，兩年后每6個月隨訪1次，隨訪截止日期為2015 年3月，中位隨訪時間為45.3（1～60）個月，無失訪。隨訪內容包括：術后預后（進展、復發、死亡）、影像學變化、血AFP、肝功能等。

1.3主要試劑與儀器

RNA抽提試劑TRIzol（Takara，中國大連），RNA反轉錄試劑M-MLV Reverse Transcriptase Kit（Invitrogen公司），RNA熒光試劑SYBR? Premix Ex TaqTMII （Takara，中國大連）。NanoDrop2000超微量分光光度計（Thermo Scientific，USA），VeritiTM96孔熱循環儀（Applied Biosystems，USA），StepOnePlusTM實時熒光定量PCR系統（Applied Biosystems，USA）。

1.4總RNA抽提及反轉錄

按說明書所述，使用Takara公司的Trizol抽提組織樣本的總RNA并用NanoDrop2000超微量分光光度計測定其濃度、純度。吸取1 μg的RNA，按照RNA反轉錄試劑M-MLV Reverse Transcriptase Kit說明書所述加入各試劑，使用VeritiTM96孔熱循環儀進行反轉錄。反應參數：65 ℃ 5 min；37 ℃ 2 min；25 ℃10 min，37 ℃ 50 min，70 ℃ 15 min。

1.5實時熒光定量PCR檢測lncRNA-AK125512的表達

根據GenBank中lncRNA-AK125512、β-Actin的堿基序列（序列號分別為AK125512.1、NM_001101.3），應用Primer Premier 5.0軟件設計引物，引物由上海杰李生物技術有限公司合成。lncRNA-AK125512的上游引物為：5′-TGACACCCACAACCTGA-3′，下游引物為：5′-TATACCCACTATGGAACCT-3′，產物片段大小為323 bp，退火溫度為60 ℃。β-Actin的上游引物為：5′-GGGAAATCGTGCGTGACATTAAG-3′，下游引物為：5′-TGTGTTGGCGTACAGGTCTTTG-3′，產物片段大小為275 bp，退火溫度為60 ℃。qRT-PCR的反應體系為20 μL，包括2×SYBR Green mix 10 μL，ddH2O 8 μL，20×相應引物1 μL，cDNA 1 μL。使用StepOnePlusTM實時熒光定量PCR系統進行實時熒光定量PCR，反應參數：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃20 s，共40個循環。結果用2-△△Ct法分析計算。

1.6統計學分析

實驗結果應用SPSS 22.0軟件進行統計分析。計數資料用x2檢驗，計量資料用Wilcoxon配對符號秩和檢驗，生存分析用Kaplan-Meier和Log-rank檢驗，多因素分析用Cox回歸模型。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1lncRNA-AK125512在肝癌、癌旁肝組織差異表達

qRT-PCR結果經Wilcoxon配對符號秩和檢驗提示肝癌組織中lncRNA-AK125512較癌旁肝組織明顯低表達（P＜0.0001），見圖1。

圖1　lncRNA-AK125512在肝癌組織、癌旁肝組織中的表達

2.2lncRNA-AK125512在肝癌中的表達與臨床病理指標的相關性

以lncRNA-AK125512在135例肝癌組織中的相對表達量（2-△△Ct）的中位值為界，將lncRNA-AK125512的在肝癌組織中表達量分為低表達（n=67例）、高表達（n=68例）兩組，并與臨床病理指標構建四格表做x2分析。分析結果顯示，肝癌組織中lncRNAAK125512的表達水平與肝癌分化分級（P=0.022）、腫瘤包膜完整與否（P=0.005）、血AFP（P=0.018）明顯相關，與性別、年齡、有無肝硬化、巴塞羅那分期、腫瘤直徑、有無子灶、有無微血管癌栓無關，見表1。

2.3lncRNA-AK125512在肝癌組織中的表達與肝癌患者術后無瘤生存期及總體生存期的關系

分別繪制lncRNA-AK125512低表達組和高表達組的Kaplan-Meier曲線并進行Log-rank檢驗，結果顯示肝癌組織中lncRNA-AK125512低表達患者肝癌切除術后預后明顯較差，表現為術后無瘤生存期（P= 0.0041）及總體生存期（P=0.0008）均顯著縮短，見圖2。

2.4單因素、多因素分析

將各臨床病理指標分別做術后復發、生存的單因素分析，結果見表2。將單因素分析（表2）中有統計學意義的指標納入進行多因素COX回歸分析，結果見表3。結果表明，肝癌組織lncRNA-AK125512低表達、腫瘤直徑＞5 cm、有子灶、無完整包膜是影響肝癌患者術后無瘤生存期的獨立危險因素，肝癌組織lncRNA-AK125512低表達、腫瘤直徑＞5 cm、有子灶、血AFP＞20 μg/L是影響肝癌患者術后總體生存期的獨立危險因素。

表1　癌組織中lncRNA-AK125512的表達與臨床病理指標的關系

3 討論

lncRNA是近些年來的研究熱點，研究表明其并非只是細胞內的“噪音分子”，相反，其廣泛參與調控X染色體沉默、基因印記以及染色體修飾、轉錄激活、轉錄干擾、核內運輸等細胞重要生物學進程[6-7]，與多種疾病特別是腫瘤的發生發展、防治密切關聯[8]。國內學者YANG等[10]率先應用高通量芯片技術檢測了5對肝癌組織和癌旁肝組織的lncRNA表達譜，并篩選出在肝癌、癌旁肝組織中明顯差異表達的lncRNAHEIH，發現其可作為肝癌患者術后預后的預測標記物，利用shRNA抑制肝癌細胞中的lncRNA-HEIH可以明顯抑制肝癌細胞的生長周期，提示該lncRNA是肝癌治療的可能靶點。但是，其較少的樣本數量限制了對肝癌發生發展中相關lncRNA的全面分析、發現。所以，需要更大規模的數據、更為豐富的疾病譜用以系統地考察lncRNA在肝癌發生發展過程中的差異表達和潛在臨床應用價值。

圖2　肝癌組織中lncRNA-AK125512的高低表達與術后預后的關系

表2　肝癌患者術后預后的單因素分析

本課題組前期完成了表達譜芯片（NCBI GEO數據庫編號GSE54238），包括10例正常肝臟組織、10例慢性肝炎組織、10例肝硬化組織、15例早期肝癌組織和14例伴隨轉移的晚期肝癌組織以及對應的癌旁肝組織。經過標準化數據處理后，我們發現肝癌、癌旁肝組織共發現有638條lncRNA明顯差異表達（標準為差異倍數超過1.5倍，P＜0.05），這進一步表明了lncRNA廣泛參與調控肝癌的發生發展。YUAN等[11]從其中篩選出lncRNA-DANCR，在兩個隊列中驗證發現其可作為預測肝癌患者術后預后的標記物，lncRNADANCR可以增強肝癌細胞的干性特征從而促進肝癌的發生發展，干擾lncRNA-DANCR能有效阻斷該效應，提示其可能是肝癌治療的新靶點。

表3　肝癌患者術后預后的多因素分析

研究表明，人類基因組序列中4%～9%的序列產生的轉錄本是lncRNA，而相應的蛋白編碼RNA比例只有1%[7]。顯然，相較編碼蛋白基因在腫瘤發生發展中作用的廣泛性，我們對lncRNA在腫瘤發生發展、防治中的作用仍知之甚少，需要我們去進一步探究。基于此研究目的，本研究從已完成的GSE54238表達譜芯片中進一步篩選、發現lncRNA-AK125512隨著肝癌的發生發展進程“正常肝-慢性肝炎-肝硬化-肝癌”，其表達量發生明顯變化，肝癌、癌旁肝組織亦表達差異顯著，提示我們該lncRNA可能是肝癌發生發展的重要調控因子，值得我們進一步研究。

本研究通過實時熒光定量PCR檢測lncRNA-AK12 5512在135對肝癌、癌旁肝組織中的表達量，結果表明其在肝癌組織中表達量明顯低于癌旁肝組織，提示其可能具有抑制肝癌發生發展的作用，這在國內外尚屬首次報道。進一步研究發現肝癌組織中lncRNAAK125512較低表達患者具有更差的肝癌分化分級、腫瘤包膜更不完整和更高的血AFP，提示我們其可能參與調控肝癌細胞分化，這為我們下一步揭示lncRNA-AK125512對肝癌細胞的具體調控功能及機制打下基礎。分析預后發現肝癌組織中lncRNA-AK125512表達水平與肝癌患者術后預后明顯相關，可用于預測肝癌患者術后預后，提示在臨床工作中對肝癌組織中lncRNA-AK125512較低表達患者術后應進行更嚴密隨訪，監測復發，必要時予加強術后輔助治療。

已有大量研究報道通過改變lncRNA表達能夠抑制腫瘤細胞的惡性表型[10-11]，表明lncRNA可以作為腫瘤治療的新靶點。而lncRNA-AK125512表達量的變化是否會對肝癌細胞惡性表型產生影響及具體的調控機制，目前尚無相關報道，這是我們下一步的研究重點，將進一步明確lncRNA-AK125512是否能夠作為肝癌治療的潛在靶點。研究表明lncRNA往往是通過調控其鄰近mRNA而發揮生物學功能[12]，我們通過查閱UCSC基因組數據庫發現lncRNA-AK125512位于人類1號染色體q41區段，與基因線粒體偕胺肟還原酶2 （MARC2）在相同位置，并與基因線粒體偕胺肟還原酶1（MARC1）毗鄰。已報道MARC家族能消除細胞內的羥化物[13]，MARC2能夠清除子宮頸癌細胞內羥胺基堿基類似物而抑制腫瘤細胞凋亡[14]。而lncRNA-AK125512是否通過調控MARC家族而影響肝癌發生發展需要進一步的實驗證明。

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（本文編輯：張海燕，魯翠濤）

·論著 臨床研究·

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[通訊作者簡介]周偉平，教授，主任醫師，博士生導師，E-mail：ehphwp@126.com。

作者簡介][第一蔡杰（1990-），男，福建莆田人，碩士；林孔英（1989-），男，福建平潭人，碩士，本文并列第一作者。

[基金項目]國家科技重大專項(2012ZX10002010）；國家自然科學基金項目（81372207）；上海市衛生和計劃生育委員會科研課題（20154Y0083）。

[收稿日期]2015-09-09

[中圖分類號]R735.7

[文獻標識碼]A

doi:10.11952/j.issn.1007-1954.2016.02.002